Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Główny dogmat neurobiologii, ustanowiony przez fundamentalne obserwacje cytoarchitektury mózgu dokonane przez Ramóna Y. Cajala ponad sto lat temu, utrzymywał, że neurogeneza jest mało prawdopodobna po okresie dojrzewania, biorąc pod uwagę złożoność sieci neuronowych znajdujących się w OUN¹. Pomimo prac Altmana z lat sześćdziesiątych, a później Kaplana, wykazujących, że ³H-tymidynę można znaleźć w dojrzałych neuronach, co wskazuje, że w rzeczywistości neurony są generowane w różnych obszarach dorosłego mózgu, dogmat nadal utrzymywał^{się na poziomie 2,3}. Dowodów było coraz więcej, a badania Nottebohma opisywały sezonowe zmiany w liczbie neuronów obecnych w mózgach ptaków śpiewających⁴. Dopiero w 1999 roku, kiedy Gould i in. opublikowali pracę na temat generowania neuronów w hipokampie wraz z wykonywaniem zadań uczenia się asocjacyjnego u szczurów, a także obserwacje Kornacka i Rakicia wykazujące ciągłą neurogenezę u dorosłych makaków, koncepcja mniej sztywnego, bardziej plastycznego mózgu, została rozpoznana ^5,6.

Poszukiwanie komórkowego źródła dla tych neuronów generowanych de novo doprowadziło do odkrycia odrębnej populacji komórek macierzystych (SC), które znajdują się w obszarach mózgu określanych jako nisze⁷. Strefa podkomorowa i strefa subziarnista hipokampa są uważane za dwa główne regiony neurogenne^8,9. Komórki wyizolowane z tych lokalizacji wykazują klasyczną cechę zarodkowych lub płodowych SC, potencjał samoodnowy i różnicowania. W przypadku nerwowych komórek macierzystych (NSC) mogą one być różnicowane w neurony, astrocyty i oligodendrocyty. Ponadto te SC są dodatnie pod kątem płodowych markerów NSC, takich jak gniazdo białka pośredniego filamentu¹⁰. Nowsze prace podkreślają, że SC mogą nie ograniczać się do tych dwóch obszarów i są w rzeczywistości zlokalizowane w całym mózgu jako w dużej mierze spokojna populacja komórek ściśle związanych z układem naczyniowym.

Obserwacje tego, że SC są mobilizowane w odpowiedzi na uraz, sugerują możliwość wykorzystania tych komórek do celów regeneracyjnych, aby pomóc w powrocie do zdrowia po zaburzeniu neurodegeneracyjnym i udarze^12,13. Nie różni się to od roli, jaką mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) odgrywają w gojeniu tkanek łącznych, które znajdują się jako komórki okołonaczyniowe, które mają potencjał, aby stać się osteoblastami, chondrocytami i komórkami tłuszczowymi¹⁴. Jednak NSC nie mogą być pobierane ze szpiku kostnego w taki sam sposób, jak MSCs za pomocą rutynowych technik aspiracji i wirowania w gradiacji gęstości, a następnie wykorzystywane w terapiach opartych na autologicznych komórkach. W związku z tym inne źródła komórek, takie jak wykorzystanie płodowych NSC lub prekursorów neuronalnych pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, były szeroko badane w modelach chorób i urazów zwierząt z różnym powodzeniem¹⁵. Technologie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych wykorzystujące źródła komórek somatycznych oferują kolejną potencjalną drogę do wytwarzania terapeutycznie użytecznych terapii komórkowych o szerokim zakresie zastosowań, przezwyciężając ograniczoną dostępność i obawy etyczne dotyczące wykorzystania komórek embrionalnych i tkanek płodowych¹⁶. Jednak kliniczne przełożenie tych wyników okazało się trudnym zadaniem, co pokazały zmagania z leczeniem różnych schorzeń neurologicznych za pomocą podejść terapeutycznych opartych na SC^17,18, a także kręta ścieżka do klirensu regulacyjnego. Jako alternatywne podejście, wprowadzenie specyficznych terapii farmakologicznych może modulować liczbę NSC i ułatwić powrót do zdrowia w modelach choroby Parkinsona i udaru^{mózgu 19}. Niezależnie od strategii, zrozumienie, jak skutecznie manipulować tymi komórkami, wymaga dostępnego systemu in vitro.

Hodowle NSC mogą być wykonywane albo jako kultury zbiorcze, znane również jako neurosfery, albo jako monowarstwa^8,20. Obie techniki są szeroko stosowane, co pozwala na ustalenie określonych warunków hodowli, tj. wykorzystanie naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) lub zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) jako źródła mitogenu, które zapewniają ekspansję multipotencjalnych prekursorów. Podczas gdy hodowle neurosfery mogą być lepiej przystosowane do badania zdolności rozmnażania klonów izolowanego typu komórki, wykazano, że system wytwarza mieszaną populację komórek podczas ekspansji²¹. Ponadto zamknięta struktura neurosfer sprawia, że farmakologiczna manipulacja komórkami jest niepraktyczna, a interpretacja wpływu, jaki mogą mieć te czynniki, może być zagmatwana ze względu na mikrośrodowisko ustanowione w samej neurosferze. Z drugiej strony, hodowle jednowarstwowe mogą być stosowane w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych bibliotek małych cząsteczek, zapewniając potężne narzędzie do badania mechanizmów transdukcji sygnału, które regulują wzrost i różnicowanie SC, a także otwiera możliwość odkrycia nowych związków, które są ukierunkowane na tę populację komórek.

W konsekwencji, zdolność do powtarzalnego generowania kultur dorosłych NSC z różnych regionów mózgu może być wykorzystana w szerokim spektrum zastosowań badawczych, począwszy od badań rozwojowych ośrodkowego układu nerwowego (OUN), a skończywszy na odkrywaniu nowych podejść medycyny regeneracyjnej. Przedstawiony tutaj protokół pokazuje, jak przeprowadzić analizę i ocenę potencjału różnicowania SC OUN wyizolowanych z mózgu dorosłego gryzonia.

Praca jest zgodna z Deklaracją Helsińskiego i Oświadczeniem ARVO o zwierzętach. Do pobierania tkanek wykorzystano zwierzęta, a wszystkie odpowiednie metody były przestrzegane zgodnie z instrukcjami zakładu dla zwierząt na Uniwersytecie w Dreźnie. Zwierzęta były traktowane i trzymane w pomieszczeniach zgodnie z niemieckimi wytycznymi federalnymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi, a badanie zostało zatwierdzone przez Landesdirektion Dresden. Prosimy o skonsultowanie się z polityką weterynaryjną Państwa instytucji (IACUC lub inną radą) w sprawie właściwej metodologii eutanazji.

Konkretne zapasy i stężenia robocze odczynników można znaleźć w Tabelach Odczynników dołączonych do tego protokołu.

1. Przygotowanie potrawy kulturowej

1. Pokryć naczynia wystarczającą objętością 75 μg/ml poli-L-ornityny (tj. 2 ml/dołek z płytki 6-dołkowej) przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych na 2 dni przed planowaną datą sekcji.
2. Odessać poli-L-ornitynę następnego dnia i przemywać każdą studzienkę 2x 3 ml PBS przez 5 minut.
3. Usuń ostatnie płukanie, a następnie dodaj fibronektynę (rozcieńczoną w stosunku 1:250, 4 μg/ml w PBS) do płytki i umieść naczynia w inkubatorze na noc.
4. Odessać fibronektynę w dniu sekcji i umyć naczynia 2x PBS. Płytki zawierające ostatnie przepłukanie PBS należy umieścić z powrotem w inkubatorze do momentu, gdy zdysocjowana tkanka będzie gotowa do hodowli. W tym czasie należy usunąć PBS przed posiewem tkanki.
5. Płytki pokryte poli-L-ornityną należy przechowywać w inkubatorze do 3 tygodni. Płytki pokryte fibronektyną można przechowywać do 1 tygodnia. Powlekanie fibronektyną można wykonać w ciągu zaledwie 2 godzin, jeśli jest to pilne. Fibronektyna jest podatna na denaturację; Nie mieszaj roztworu ani nie pozwól naczyniom wyschnąć.

2. Rozwarstwienie/Poszycie

1. Protokół ten dotyczy wykorzystania 3 dorosłych szczurów (w wieku 3-6 miesięcy).
2. Schłodź blok sekcyjny mózgu na lodzie przed eutanazją szczura.
3. Umieść na lodzie 15 ml probówkę Falcon zawierającą 5 ml pożywki N2 z dodatkiem bFGF.
4. Poddaj szczury eutanazji zgodnie z polityką weterynaryjną swojej instytucji.
5. Usuń mózg z czaszki, wykonując nacięcie wzdłuż linii środkowej głowy. Użyj kleszczy, aby oderwać kość, co pozwoli na ostrożne wydobycie mózgu.
6. Umieść mózg na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej lodowaty PBS. Spowoduje to usunięcie wszelkich resztek włosów i krwi. (Rysunek 1A)
7. Umieść mózg w schłodzonym bloku sekcyjnym. (Rysunek 1B)
8. Włóż jedną nową, czystą żyletkę do bloku, jak pokazano na rysunku 1C.
9. Włóż drugą czystą żyletkę 3 mm ogonową do pierwszej, jak pokazano na rysunku 1D.
10. Ostrożnie podnieś ostrza z bloku, zabierając ze sobą interesującą Cię sekcję.
11. Odsuń sekcję od ostrza, zanurzając ją w PBS. (Rysunek 1E)
12. Zbierz tkankę z obszaru zainteresowania (w tym przykładzie użyliśmy spoidła przedniego, (przedniego) ACA, ryc. 1F) za pomocą kleszczy #5 i zbierz do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 1 ml pożywki N2 zawierającej bFGF.
13. Przenieś probówkę do kaptura do hodowli komórek z przepływem laminarnym, kontynuując pozostałą część protokołu w sterylnych warunkach.
14. Mechanicznie zdysocjować tkankę za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml dołączonej do pipetora P1000. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół (około 20 razy z szybkością 1 cyklu pipetowania na sekundę), jednocześnie dociskając otwór końcówki pipety do dna rurki stożkowej (rysunki 1G 1-3). Zatrzymaj rozcieranie, gdy roztwór stanie się jednorodny.
15. Pozostaw roztwór na 2 minuty, aby każda większa niezdysocjowana tkanka mogła osiąść na dnie. (Rysunek 1G 4)
16. Zebrać jednorodny supernatant i umieścić w stożkowej probówce zawierającej 8,5 ml pożywki N2 plus 20 ng/ml bFGF, 500 ng/ml Dll4, 500 ng/ml Ang2 i 200 nMJAK inhibitora.
17. Umieść je w 3 dołkach na płytce 6-dołkowej, używając 3 ml rozcieńczonego roztworu komórek/dołka.
18. Umieścić płytkę w inkubatorze z nawilżanymi komórkami w temperaturze 37 °C, 5% CO₂, 5% O_{2 .}

3. Codzienna pielęgnacja

1. Zastąp pożywkę na szalkach hodowlanych pożywką N2 zawierającą bFGF, Ang2, Dll4 i inhibitor JAK 24 godziny po posiewie.
2. Następnego dnia dodać bolus z bFGF, Dll4, Ang2 i inhibitorem JAK.
3. Kontynuuj ten naprzemienny proces zmian pożywek i dodawania czynników przez łącznie 10-14 dni.

4. Indukcja różnicowania

1. Odstaw pożywkę zawierającą bFGF, Dll4, Ang2 i inhibitor JAK i zastąp ją pożywką N2, która nie zawiera żadnych dodatkowych czynników.
2. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
3. Napraw komórki po 10 dniach i wykonaj immunocytochemię.

5. Detekcja immunocytochemiczna

1. Odessać pożywkę i utrwalić płytki do hodowli komórkowych 2 ml 4% paraformaldehydu przez 20 minut.
2. Myć 2x po 3 ml PBS po 5 min.
3. Odessać PBS, a następnie przeniknąć i zablokować komórki, dodając 2 ml PBS zawierającego 5% normalnej surowicy osła (NDS) i 0,1% Triton X-100 przez 20 minut.
4. Przygotować pierwszorzędową mieszaninę przeciwciał w PBS zawierającą 5% NDS. Przeciwciało anty-nestynowe może być używane do identyfikacji SC, podczas gdy przeciwciała TuJ1 (klasa III β-tubulina), GFAP i CNPaza mogą być używane razem do potrójnego barwienia markerów różnicowania.
5. Odessać roztwór blokujący i dodać 1,5 ml mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 90 minut.
6. Usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i przemyć 2x 3 ml PBS i 1x 3 ml PBS zawierającego 5% NDS przez 5 min każdy.
7. Przygotować przeciwciała drugorzędowe w PBS zawierające 5% NDS.
8. Odessać ostatnie płukanie i dodać 1,5 ml wtórnego roztworu przeciwciał do każdej studzienki. Inkubować w ciemności przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
9. Usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała i dodać 2 ml świeżo przygotowanego barwnika DAPI (500 ng/ml w PBS). Inkubować przez 3 minuty.
10. Odessać roztwór DAPI, a następnie przemyć 3x 3 ml PBS przez 5 minut każdy. Komórki można teraz uwidocznić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Identyfikacja obszaru zainteresowania, z którego należy pobrać nerwowe komórki macierzyste, jest krytycznym pierwszym krokiem i określi ilość czasu potrzebną do uzyskania zlewającej się płytki komórek. Na przykład SVZ jest klasycznym obszarem neurogennym i dlatego ma wyższy względny odsetek nerwowych komórek macierzystych. Jednak przedstawiona tutaj technika może być stosowana w innych regionach, które nie są często rozpoznawane jako posiadające silny potencjał neurogenny w wieku dorosłym. Na potrzeby tego protokołu zastosowaliśmy spoidło przednie (część przednia). Podczas gdy niektóre komórki i zanieczyszczenia osiądą po posiewaniu, podłoże zwykle pozostanie mętne w wyniku ilości materiału komórkowego, który jest obecny po roztarciu. Pierwsza średnia zmiana po 24 godzinach usunie większość z nich. Jak uwidoczniono za pomocą mikroskopii świetlnej, wydaje się, że nawet po pierwszej zmianie pożywki pozostała duża ilość materiału komórkowego wraz z naczyniami krwionośnymi. W ciągu najbliższych kilku dni kolonie odrębnej populacji komórek proliferujących staną się widoczne pod mikroskopem (ryc. 2A). Są to nerwowe komórki macierzyste, które zostały wyselekcjonowane do wzrostu za pomocą pożywki N2 zawierającej bFGF, Ang2, Dll4 i inhibitor JAK. Ponadto może być również obecna bardziej wydłużona populacja komórek wrzecionowatych (ryc. 2B i C). Nie są to nerwowe komórki macierzyste (prawdopodobnie promieniste komórki glejowe na podstawie morfologii i barwienia), w końcu zostaną wyprzedzone przez szybciej rozprzestrzeniającą się populację nerwowych komórek macierzystych. W ciągu tygodnia do 14 dni komórki staną się bardziej gęste, aż osiągną konfluencję (ryc. 2D). Kultury te wybarwiają się dodatnio na obecność wielu markerów komórek macierzystych, w tym Nestin, Hes3 i Sox2. (Ryc. 2E-H), dając w ten sposób pewność, że populacje komórek, które zostały wybrane i rozszerzone, są rzeczywiście nerwowymi komórkami macierzystymi. Dalsze potwierdzenie pochodzi ze zdolności do usuwania FGF z pożywki, umożliwiając komórkom różnicowanie się przez 10 dni w celu wytworzenia neuronów, astrocytów i oligodendrocytów (Figura 2I).

Rycina 1: Izolacja skrawków mózgu szczura w celu pobrania dorosłych nerwowych komórek macierzystych. A) Mózg dorosłego szczura po umyciu PBS. B) Mózg szczura umieszczony w schłodzonym bloku sekcyjnym ze stali nierdzewnej. C) Przybliżone umiejscowienie początkowych żyletek w bloku w celu wytworzenia odcinków koronalnych mózgu. D) Umieszczenie 2 dodatkowych żyletek w bloku sekcyjnym. Uwaga, cieńsze ostrza obosieczne zostały użyte w celach demonstracyjnych, aby umożliwić łatwiejszą wizualizację przekrojów w bloku. E) Koronalne sekcje mózgu zawierające obszary do pobrania. F) Schemat ideowy z atlasu mózgu Paxinos podkreślający strefę podkomorową jako klasyczny region neurogenny oraz spoidło przednie, z którego pobrano komórki do tego protokołu. G) Sekwencyjne obrazy procesu dysocjacji tkanek za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml podłączonej do mikropipetora P1000. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rycina 2: Dorosłe nerwowe komórki macierzyste in vitro. A) Hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych po tygodniu. B) Przykłady komórek o szerszej morfologii wrzeciona (czerwone strzałki) sporadycznie występujących w hodowlach, które nie są nerwowymi komórkami macierzystymi. C, D) W warunkach hodowli określonych w niniejszym protokole nerwowe komórki macierzyste preferencyjnie się namnażają. E-H) Ekspresja markerów nerwowych komórek macierzystych po 14 dniach in vitro, Sox2 (zielony) (E), Hes 3 (czerwony) (F) i Nestin (fioletowy) (G). I) Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych w neurony, astrocyty i oligodendrocyty. Po wycofaniu mitogenu komórkom pozwolono różnicować się przez 10 dni, a następnie wybarwiono immunologicznie pod kątem GFAP (zielony), TuJ1 (czerwony) i CNPazy (niebieski). J) Barwienie immunologiczne Hes3 w mózgu dorosłego szczura. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Nie mamy nic do ujawnienia.