In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Martina Sonego; Ya Zhou; Madeleine Julie Oudin; Patrick Doherty; Giovanna Lalli

doi:10.3791/50905

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

13.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50905

⸱

25 listopada 2013

Martina Sonego^*¹ , Ya Zhou^*¹ , Madeleine Julie Oudin² , Patrick Doherty¹ , Giovanna Lalli¹

¹Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, ²David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

Streszczenie

Strefa podkomorowa (SVZ) jest jedną z głównych nisz neurogennych w mózgu po urodzeniu. W tym przypadku neuronalne komórki progenitorowe namnażają się i dają początek neuroblastom zdolnym do poruszania się wzdłuż rostralnego strumienia migracyjnego (RMS) w kierunku opuszki węchowej (OB). Ta długodystansowa migracja jest niezbędna do późniejszego dojrzewania nowo narodzonych neuronów w OB, ale mechanizmy molekularne regulujące ten proces są nadal niejasne. Badanie szlaków sygnałowych kontrolujących ruchliwość neuroblastów może nie tylko pomóc w zrozumieniu podstawowego etapu neurogenezy, ale także mieć terapeutyczny potencjał regeneracyjny, biorąc pod uwagę zdolność tych neuroblastów do celowania w miejsca mózgu dotknięte urazem, udarem lub zwyrodnieniem.

W tym manuskrypcie opisujemy szczegółowy protokół elektroporacji in vivo i późniejszego obrazowania poklatkowego migracji neuroblastów w RMS myszy. Elektroporacja poporodowa może skutecznie transfekować komórki progenitorowe SVZ, które z kolei generują neuroblasty migrujące wzdłuż RMS. Korzystając z konfokalnej mikroskopii poklatkowej z wirującym dyskiem na ostrych kulturach wycinków mózgu, migracja neuroblastów może być monitorowana w środowisku bardzo przypominającym w warunkach in vivo. Co więcej, ruchliwość neuroblastów może być śledzona i analizowana ilościowo. Jako przykład opisujemy, jak wykorzystać elektroporację in vivo plazmidu wykazującego ekspresję GFP do znakowania i wizualizacji neuroblastów migrujących wzdłuż RMS. Elektroporacja plazmidów eksprymujących rekombinazę shRNA lub CRE u myszy z warunkowym nokautem wykorzystujących system LoxP może być również wykorzystana do celowania w interesujące geny. Można przeprowadzić farmakologiczną manipulację ostrymi kulturami wycinków mózgu w celu zbadania roli różnych cząsteczek sygnałowych w migracji neuroblastów. Łącząc elektroporację in vivo z obrazowaniem poklatkowym, mamy nadzieję zrozumieć mechanizmy molekularne kontrolujące ruchliwość neuroblastów i przyczynić się do rozwoju nowych podejść wspomagających naprawę mózgu.

Wprowadzenie

W mózgu ssaków tworzenie nowych neuronów (neurogeneza) następuje po urodzeniu głównie w dwóch regionach, strefie podkomorowej (SVZ) komór bocznych i strefie podziarnistej w zakręcie zębatym hipokampa¹. Liczne dowody zebrane w ostatnich latach potwierdzają kluczową rolę neurogenezy pourodzeniowej w funkcjach pamięci hipokampa i opuszki węchowej^1-3. Co ważne, neurogeneza poporodowa ma również potencjał terapeutyczny ze względu na jej związek z zwyrodnieniowymi zaburzeniami neurologicznymi oraz zdolność neuroblastów do migracji do uszkodzonych miejsc w mózgu^4-6.

Strefa podkomorowa (SVZ) stała się ostatnio klucz....