Kompatybilna z wysoką przepustowością platforma oparta na FRET do identyfikacji i charakterystyki modulatorów łańcucha lekkiego neurotoksyny botulinowej

Summary

Łańcuch lekki neurotoksyny botulinowej typu A (BoNT/A LC) to metaloproteaza, która dostaje się do neuronów ruchowych, rozszczepia ich substrat SNAP-25 i zakłóca neurotransmisję, powodując tym samym porażenie wiotkie. Wykorzystując wysokoprzepustowy test oparty na FRET, duże biblioteki małych cząsteczek mogą być badane pod kątem ich wpływu na aktywność enzymatyczną BoNT/A LC.

Abstract

Neurotoksyna botulinowa (BoNT) to silna i potencjalnie śmiertelna toksyna bakteryjna, która wiąże się z neuronami ruchowymi gospodarza, jest internalizowana w komórce i rozszczepia wewnątrzkomórkowe białka, które są niezbędne do uwalniania neuroprzekaźników. BoNT składa się z łańcucha ciężkiego (HC), który pośredniczy w wiązaniu i internalizacji komórek gospodarza, oraz łańcucha lekkiego (LC), który rozszczepia wewnątrzkomórkowe białka gospodarza niezbędne do uwalniania acetylocholiny. Podczas gdy terapie, które hamują wiązanie/internalizację toksyn, mają krótkie okno czasowe podawania, związki, które celują w wewnątrzkomórkową aktywność LC, mają znacznie dłuższe okno czasowe podawania, co jest szczególnie istotne, biorąc pod uwagę wyjątkowo długi okres półtrwania toksyny. W ostatnich latach małe cząsteczki były intensywnie analizowane jako potencjalne inhibitory LC w oparciu o ich zwiększoną przepuszczalność komórkową w porównaniu z większymi terapiami (peptydy, aptamery itp.). Identyfikacja odprowadzeń często obejmuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS), w których duże biblioteki małych cząsteczek są badane na podstawie ich zdolności do modulowania docelowej funkcji terapeutycznej. W tym miejscu opisujemy test oparty na FRET z komercyjnym substratem BoNT/A LC i rekombinowanym LC, który można zautomatyzować pod kątem HTS potencjalnych inhibitorów BoNT. Ponadto opisujemy technikę manualną, która może być wykorzystana do dalszych wtórnych badań przesiewowych lub do porównania siły działania kilku kandydujących związków.

Introduction

Neurotoksyna botulinowa A (BoNT/A), najsilniejsza obecnie znana toksyna (LD₅₀ ~1 ng/kg)¹, jest silną neurotoksyną wytwarzaną przez bakterię Clostridium botulinum. W obrębie dotkniętego gospodarza BoNT / A zakłóca neurotransmisję w połączeniu nerwowo-mięśniowym poprzez wiązanie neuronów ruchowych, internalizację do cytozolu i ostatecznie rozszczepianie białek neuronalnych, które są niezbędne do egzocytozy acetylocholiny. Po wejściu do neuronu BoNT/A może utrzymywać się nawet przez kilka miesięcy². Długotrwałe hamowanie uwalniania acetylocholiny utrudnia normalny skurcz mięśni i powoduje porażenie wiotkie, które w ciężkich przypadkach może prowadzić do niewydolności serca i/lub oddechowej. Ze względu na jego ekstremalną moc, łatwość produkcji i długoterminowe skutki w organizmie gospodarza, CDC oznaczyło wszystkie serotypy BoNT jako czynniki bioterrorystyczne wysokiego ryzyka.

Mechanizm działania toksyny obejmuje liczne etapy, w tym wiązanie się z receptorami na powierzchni neuronów, pobieranie komórek przez endocytozę za pośrednictwem receptorów i translokację do cytozolu neuronu. BoNT/A składa się z dwóch łańcuchów, ciężkiego i lekkiego, a oba łańcuchy są wymagane do toksyczności. Łańcuch ciężki (HC) zawiera domeny wiążące i translokacyjne, podczas gdy łańcuch lekki (LC) jest metaloproteazą zależną od, która przemieszcza się z endosomu do cytoplazmy. Po wejściu do cytozolu metaloprotaza LC / A lokalizuje się w wewnętrznej błonie cytoplazmatycznej i rozszczepia białko gospodarza związane z błoną SNAP-25. SNAP-25 należy do rodziny białek SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Protein Receptor), które odgrywają kluczową rolę w egzocytozie acetylocholiny (przegląd w piśmiennictwie³). Rozszczepienie LC/A SNAP-25 upośledza funkcję kompleksu SNARE, co hamuje uwalnianie neuroprzekaźnika acetycholiny i upośledza skurcz mięśni.

Obecnie leczenie zatrucia jadem kiełbasianym jest ograniczone i często obejmuje podawanie przeciwciała neutralizującego u koni⁴; jednakże, ponieważ toksyna jest szybko internalizowana do neuronów, przeciwciało ma wąskie okno czasowe podania. W związku z tym wielu badaczy uważa, że BoNT/A LC może być lepszym celem terapeutycznym. Ponieważ LC jest metaloproteazą zależną od, jednym ze sposobów hamowania aktywności LC/A było opracowanie związków, które chelatują jon w miejscu aktywnym. Na przykład związki hydroksamianowe chelatują w miejscu aktywnym i mają doskonałą siłę działania in vitro (K_i najlepszego z najlepszych do tej pory małocząsteczkowych inhibitorów BoNT/A LC wynosi 77 nM)⁵. Jednak wiele małych cząsteczek nie rozwija się jako terapia z powodu różnych problemów ex vivo lub in vivo, w tym słabej rozpuszczalności w wodzie, szybkiego metabolizmu i/lub wysokiej cytotoksyczności. W związku z tym potrzebne są nowe związki o ulepszonych właściwościach farmakologicznych i farmakokinetycznych . Identyfikacja związków małocząsteczkowych często obejmuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) w celu zidentyfikowania nowych rusztowań. Początkowe metody badania przesiewowego aktywności BoNT/A LC opierały się na wykrywaniu metodą HPLC rozszczepienia krótkiego substratu peptydowego, co jest czasochłonne i niepodatne na zastosowania HTS^6-8. Następnie Schmidt i^{współpracownicy opracowali} wysokoprzepustowy test aktywności BoNT/A LC, który wykorzystuje znakowany fluoresceiną substrat peptydowy kowalencyjnie przymocowany do płytki mikromiareczkowej. BoNT/A LC rozszczepia podłoże i uwalnia fluoresceinę, którą można określić ilościowo za pomocą fluorometru. Format płytki tego testu pozwala na jednoczesne badanie przesiewowe wielu związków; Jednak test wymaga znakowania syntetycznych peptydów fluoresceiną i powlekania płytek testowych derywatyzowanymi cząsteczkami substratu, co jest kłopotliwą techniką. Znacznie prostsza metoda wykrywania aktywności BoNT/A LC przy niskich stężeniach została później opisana przez Schmidta i wsp., gdzie wykorzystano szereg substratów fluorogennych do monitorowania aktywności BoNT LC w czasie rzeczywistym¹⁰. Dodatkowe techniki opisane w literaturze obejmują depolaryzację po rezonansowym teście opartym na transferze energii w celu wykrycia i ilościowego określenia aktywności BoNT w ekstraktach surowych; metoda ta może być stosowana w zastosowaniach o wysokiej przepustowości^10,11, chociaż wymaga zaawansowanego sprzętu do pomiaru transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) i sygnałów polaryzacji. Wreszcie, opisano kilka modeli komórkowych zatrucia BoNT (omówionych w odnośniku¹¹), które umożliwią naukowcom zbadanie często ograniczających właściwości wcześniej wymienionych związków, w tym cytotoksyczności, przepuszczalności komórek i stabilności. Jednak większość istniejących testów opartych na komórkach nie jest podatna na HTS i jest pracochłonna i czasochłonna.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół dla metody HTS, która wykorzystuje dostępny na rynku substrat BoNT/A LC oparty na FRET. Substrat oparty jest na sekwencji cięcia SNAP-25 i jest syntetycznym 13-merowym peptydem, który zawiera końcowy fluorofor i wygaszacz. Rozszczepienie BoNT/A oddziela fluorofor i wygaszacz, znosząc FRET i zwiększając mierzoną fluorescencję, która może być stale mierzona w czytniku płytek fluorometrycznych. Test jest rutynowo stosowany w naszym, jak również w innych laboratoriach, do identyfikacji nowych klas inhibitorów BoNT/A LC lub do określenia względnej siły działania wcześniej zidentyfikowanych związków^5,12-15. Test ten jest odpowiedni dla HTS ze względu na jego prostotę, potencjał automatyzacji, niski koszt materiałów i zdolność do badania przesiewowego wielu związków jednocześnie (patrz odniesienie¹⁶; Caglič i wsp., przedłożone; Bompiani i wsp., w przygotowaniu). Oprócz HTS, test ten może być stosowany do porównywania względnej siły działania związków poprzez określenie wartości IC₅₀ (stężenie wymagane do zahamowania 50% aktywności BoNT/A LC) związku. Test może być wykonany ręcznie w formacie 96-dołkowym (sekcja Manual Screening w tekście protokołu) lub może być zautomatyzowany w formacie 384-dołkowym dla HTS (sekcja Automated Operation w tekście protokołu).

Protocol

Ręczne badanie przesiewowe lub oznaczanie IC₅₀

Ten protokół może być użyty do określenia względnej siły związku (wartość IC₅₀) poprzez przygotowanie serii rozcieńczeń związku, lub do ręcznego badania przesiewowego na obecność inhibitorów małych cząsteczek o pojedynczym stężeniu.

1. Przygotowanie, odczynników i wymaganego oprzyrządowania

1. Przygotować 50 ml buforu testowego (40 mM HEPES, pH 7,4 i 0,01% Tween-20) i wysterylizować filtrem. Bufor może być przechowywany w temperaturze pokojowej (RT) przez kilka miesięcy.
2. Przygotować robocze rozcieńczenie 70 nM rekombinowanej neurotoksyny botulinowej/łańcucha lekkiego A (LC/A (1-425))¹⁷ w buforze testowym, delikatnie odwirować i przechowywać na lodzie. Badanie każdego związku wymaga co najmniej 120 μl roboczego rozcieńczenia LC/A.
3. Przygotować 7 μM rozcieńczenie robocze substratu BoNT/A LC na bazie FRET w buforze testowym zawierającym 10% DMSO. Początkowo rozcieńczyć 5 mM roztwór podstawowy substratu w odpowiedniej objętości 100% DMSO, a następnie powoli (kroplami) dodać bufor do oznaczania, delikatnie mieszając. Zawiń w folię i przechowuj na lodzie. Badanie każdego związku wymaga co najmniej 130 μl roboczego rozcieńczenia substratu.
4. Skonfiguruj czytnik płytek do mikromiareczkowania fluorescencji tak, aby potrząsał płytką ze średnią prędkością przez 10 sekund, a następnie monitoruj fluorescencję przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 490 nm i 523 nm co 5 minut (tryb kinetyczny) przez 90 minut przy RT. Należy zauważyć, że tworzenie się produktu (tj. wzrost fluorescencji) jest liniowe przez cały ten okres czasu (rysunek 1A).

2. Przygotowanie serii rozcieńczeń złożonych

1. Określić zakres stężeń związku (tj. liczbę rozcieńczeń w szeregu rozcieńczeń i współczynnik rozcieńczenia); zakres stężeń dobiera się na podstawie oczekiwanej wartości IC₅₀, aby zapewnić optymalne dopasowanie krzywej. W przypadku związków o nieznanym IC₅₀ jako najwyższe stężenie związku należy użyć nierozcieńczonego składnika.
2. Oznaczyć probówki odpowiednią nazwą związku i stężeniem.
3. Podaniec 100% DMSO do wszystkich probówek, aby przygotować je do seryjnego rozcieńczania złożonego. Zalecana jest co najmniej 2 μl końcowej objętości rozcieńczenia, przy czym 1 μl każdego stężenia stosuje się na basenie na płytce do oznaczania. Na przykład standardowa seria rozcieńczeń 1:3 wymaga zmieszania 2 μl związku z 4 μl DMSO na probówkę.
4. Przygotować seryjne rozcieńczenia związków i wirować lub ręcznie dokładnie wymieszać między każdym rozcieńczeniem; wymieniać końcówki pipet pomiędzy każdym rozcieńczeniem. Dla standardowej serii rozcieńczeń 1:3 dodać 2 μl nierozcieńczonego związku do 4 μl DMSO w pierwszej probówce z serii rozcieńczeń i dobrze wymieszać. Za pomocą nowej końcówki do pipety usunąć 2 μl pierwszego rozcieńczenia i dodać do 4 μl DMSO w drugiej probówce; Dobrze wymieszaj. Powtórzyć dla pozostałych rozcieńczeń. Upewnij się, że dobrze wymieszałeś rozcieńczenia związków, aby upewnić się, że stężenia związków są dokładne.
5. Przykryj probówki złożone i odstaw na bok w temperaturze pokojowej.

3. Przygotowanie i plamienie płytki (Tabela 1)

1. Otrzymać płaską denną, nieprzezroczystą, czarną płytkę 96-dołkową. Patrz zalecany układ płytek w Tabeli 1, gdzie każda seria rozcieńczeń związków jest sformatowana w rzędach płytki 96-dołkowej. Ręcznie dozować 1 μl odpowiedniego rozcieńczenia związku bezpośrednio na dno każdej odpowiedniej studzienki (studzienki 1-9). Dozować 1 μl najwyższego stężenia badanego związku do studzienka 11 (wewnętrzna kontrola fluorescencji związku).
2. Ręcznie dozować 1 μl znanego silnego inhibitora do studzienki 12 (kontrola dodatnia) i 1 μl 100% DMSO do studzienki 10 (kontrola ujemna).
3. Za pomocą automatycznego pipetatora dozować 79 μl buforu do oznaczania na bok studzienek 1-10 i 12 (rozcieńczenia związków i kontrola pozytywna) oraz 89 μl na bok basenika 11 (złożona wewnętrzna kontrola fluorescencji). Upewnij się, że nie dotykasz końcówki do dna studni, w której znajduje się związek, aby nie zanieczyścić krzyżowo studzienek.
4. Odwirować robocze rozcieńczenie LC/A i użyć automatycznego pipetora, aby dodać 10 μl z boku każdej studzienki, z wyjątkiem studzienki 11 (złożona wewnętrzna kontrola fluorescencji). Delikatnie postukaj w płytkę, aby upewnić się, że cały dodany enzym trafi na dno studzienki.
5. Delikatnie wymieszaj, przykryj i inkubuj płytkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ta inkubacja zapewnia etap wstępnej równowagi, w którym związki wiążą się z LC/A przed dodaniem substratu.

4. Dodawanie substratu i pomiar fluorescencji

1. Delikatnie zmieszać podłoże BoNT/A LC i za pomocą automatycznego pipetora dodać 10 μl substratu po drugiej stronie każdej studzienki. Pamiętaj, aby dodać substrat po stronie studni przeciwnej do miejsca, w którym enzym został dodany wcześniej.
2. Delikatnie postukać w płytkę, aby wymieszać odczynniki, natychmiast umieścić je w czytniku płytek i rozpocząć pomiar fluorescencji z ustawieniami określonymi wcześniej w kroku 1.4.
3. Prędkości enzymu oblicza się na podstawie nachylenia linii wygenerowanej przez wykres względnej jednostki fluorescencji (RFU) w funkcji czasu w okresie liniowym reakcji.

Tabela 1.Sugerowany układ płytki testowej.

Cóż # Opis studni związek Bufor testowy substrat Lc Dmso 1 Dawka złożona 1 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- cyfra arabska Dawka złożona 2 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 3 Dawka złożona 3 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 4 Dawka złożona 4 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 5 Dawka złożona 5 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 6 Dawka złożona 6 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 7 Dawka złożona 7 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 8 Dawka złożona 8 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 9 Dawka złożona 9 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 10 Kontrola ujemna
(100% aktywności LC) --- 79 μl 10 μl 10 μl 1 μl 11 Złożona wewnętrzna kontrola fluorescencji 1 μl 89 μl 10 μl --- --- 12 Kontrola pozytywna
(0% aktywności LC) 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl ---

Zautomatyzowana obsługa dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych

5. Przygotowanie, odczynników, tabliczek złożonych, kodów kreskowych i wymaganego oprzyrządowania

1. Rozmrażać szczelnie zamknięte płytki wyjściowe w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
2. Przygotować 500 ml (lub więcej, w zależności od liczby związków do przesiewu) buforu testowego (40 mM HEPES, pH 7,4 i 0,01% Tween-20) i wysterylizować filtrem. Przefiltrowany bufor testowy może być przechowywany w RT przez kilka miesięcy.
3. Przygotować robocze rozcieńczenie 8,75 nM rekombinowanego BoNT/A LC (1-425) w buforze testowym, wirować i przechowywać na lodzie. Każda studzienka w 384-dołkowej płytce o małej objętości wymaga 8 μl. Przygotuj 10-15% nadmiaru, czyli około 3,7 ml lub każdą płytkę 384-dołkową o małej objętości.
4. Przygotować rozcieńczenie robocze substratu BoNT/A LC na bazie 3,5 μM FRET w buforze testowym zawierającym 10% DMSO. Początkowo rozcieńczyć 5 mM roztwór podstawowy substratu bezpośrednio w odpowiedniej objętości 100% DMSO, a następnie powoli (kroplami) dodać bufor do oznaczania, delikatnie mieszając. Zawiń w folię i przechowuj na lodzie. Każda studzienka w 384-dołkowej płytce o małej objętości wymaga 2 μl. Przygotuj 10-15% nadmiaru, czyli około 1 ml na każdą płytkę 384-dołkową o małej objętości.
5. Przygotuj kody kreskowe dla każdej czarnej, 384-dołkowej, niskoobjętościowej płytki do mikromiareczkowania [płytki testowej] i przyklej etykietę bezpośrednio do boku płytki, gdzie skaner kodów kreskowych może ją odczytać; upewnij się, że etykieta nie wystaje poza bok płytki, ponieważ może to przeszkadzać w obsłudze płytek i układaniu ich w stosy. Ułóż talerze w kolejności numerycznej i odłóż na bok. Zakryj górną płytę. Należy pamiętać, że ten krok jest opcjonalny, ale ułatwia śledzenie wyników dla odpowiednich związków, gdy używanych jest wiele płytek.
6. Odwirować rozmrożone, szczelnie zamknięte płytki wyjściowe o masie 200 x g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zdejmij uszczelkę płyty, upewnij się, że usunąłeś pozostały klej i przykryj płytkę czystą plastikową pokrywką, aby zapobiec parowaniu. Należy pamiętać, że jeśli na powierzchni płytki znajduje się jakikolwiek klej, może on zakłócać automatyczne przenoszenie pokrywki i układanie płyt. Umieść przykrytą płytkę w hotelu przymocowanym do pojemnika na płyny. Nie trzymaj płytek odkrytych, ponieważ spowoduje to parowanie.
7. Skonfiguruj piętrowy czytnik mikropłytek do miareczkowania fluorescencji, aby odczytywać fluorescencję każdej płytki testowej przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 490 nm i 523 nm co 30 minut (tryb kinetyczny) przez 3-6 cykli w temperaturze pokojowej.

6. Przygotowanie narzędzia do przypinania

1. Sprawdź wzrokowo narzędzie do kołków z głowicą 384 pod kątem wszelkich nieprawidłowości, w tym wypaczeń, odprysków lub dużych zanieczyszczeń.
2. Napełnij trzy oddzielne tace około 1 calem 100% metanolu (klasa HPLC), 100% izopropanolu (klasa HPLC) i roztworem do czyszczenia narzędzi do szpilek rozcieńczonym w ultraczystej wodzie.
3. Napełnij stację czyszczącą na urządzeniu do obsługi cieczy 100% DMSO.
4. Ułóż 2-3 kawałki czystej, nowej bibuły na tacy. Ważne jest, aby skalibrować robota w osi z tak, aby kołki stykały się z bibułą, ale jej nie przebijały.
5. Przymocuj nasadkę wentylatora do obszaru roboczego w celu wysuszenia kołków po umyciu.
6. Przymocuj narzędzie do szpilek do ramienia robota obsługującego ciecze i wstępnie wyczyść szpilki, zanurzając je w DMSO, susząc na bibułce, mocząc przez 2 minuty w roztworze czyszczącym, susząc na bibułce, zanurzając w izopropanolu, susząc na bibułce, zanurzając w metanolu, susząc na bibułce i na koniec susząc nad wentylatorem.

7. Przygotowanie dozownika płynów o małej objętości

1. Podłącz kasetę o małej objętości (1-10 μl) do dozownika płynów i podłącz przewód odpływowy do odpowiedniego naczynia.
2. Sprawdź wzrokowo dysze dozujące kasety i sprawdź, czy nie są wypaczone, rozdarte lub zablokowane. Ważne jest, aby utrzymywać kanały i dysze w czystości, ponieważ opady lub zanieczyszczenia wpłyną na dystrybucję cieczy.
3. Zalać kanały, przepuszczając 30 ml ultraczystej wody, 30 ml 70% etanolu, a następnie 30 ml ultraczystej wody ponownie bezpośrednio do naczynia na odpady.
4. Umieść 384-dołkową płytkę testową o małej objętości w dozowniku cieczy i dodaj znaną objętość wody do każdej studzienki. Sprawdź wzrokowo, aby upewnić się, że każda studzienka otrzymuje odpowiednią objętość i że między studzienkami nie ma rozlania ani roztworu.
5. Zalać rurki powietrzem przez około 5 sekund, aby usunąć wodę i wysuszyć kanały.

8. Dozowanie lekkiego łańcucha BoNT/A na płytkę testową

1. Zanurz przewód dozownika cieczy w roztworze roboczym BoNT/A LC, zalej w celu usunięcia powietrza i dozuj 8 μl do każdej studzienki 384-dołkowej płytki testowej o małej objętości. Należy pamiętać, że płyty mogą być ręcznie umieszczane w obszarze roboczym urządzenia do obsługi cieczy lub automatycznie ustawiane i ponownie układane w stosy za pomocą dołączonego hotelu płytowego.
2. Przykryj każdą płytkę czystą plastikową pokrywką i ułóż w innej kolumnie talerza przymocowanego do pojemnika na płyny. Nie trzymaj płytek rozszczelnionych, ponieważ może to spowodować parowanie.
3. Wyczyść dozownik płynu, przepuszczając 30 ml ultraczystej wody, 30 ml 70% etanolu, 30 ml ultraczystej wody ponownie bezpośrednio do naczynia na odpady.
4. Zalać rurki powietrzem przez około 5 sekund, aby wysuszyć kanały.

9. Tłoczenie związków na płytce testowej

1. Przypisz obszary na platformie obsługi cieczy dla płytek złożonych, płytek testowych i pojemników z roztworami czyszczącymi.
2. Zaprogramować osobę zajmującą się cieczami tak, aby umieszczała płytki złożone i płytki testowe w wyznaczonych pozycjach i zdejmowała pokrywki płytek przed tłoczeniem.
3. Ostemplować 50 nl związku bezpośrednio na płytce testowej zawierającej 8 μl BoNT/A LC. Podczas kalibracji programu do tłoczenia upewnij się, że kołki są zanurzone, ale nie rysuj dolnej części płytki testowej. Należy pamiętać, że dodanie związków w 100% DMSO może stworzyć lokalną strefę denaturacji enzymu w miarę jego dyspersji. W związku z tym należy dołożyć starań, aby ocenić poziom denaturacji enzymów poprzez porównanie kontroli opartej wyłącznie na DMSO z kontrolą niepoddawaną działaniu środka (tj. enzymem bez dodatku DMSO).
4. Wyczyść szpilki po każdej płycie, zanurzając w DMSO, susząc na bibułce, zanurzając w izopropanolu, susząc na bibułce, zanurzając w metanolu, susząc na bibułce i na koniec susząc nad wentylatorem.
5. Po wytłoczeniu związków na płytce testowej enzymem, oddzielnie ułóż płytki ze związkami podstawowymi i płytki testowe. Przykryj górną płytkę testową w stosie, aby zapobiec parowaniu i odłóż na bok. Upewnij się, że inkubujesz LC ze związkami przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej; Dłuższe czasy inkubacji można stosować przy tłoczeniu dużej liczby płytek.

10. Dozowanie substratu do płytki testowej

1. Zanurzyć przewód dolotowy maszyny do obsługi cieczy w roztworze roboczym podłoża BoNT/A LC i chronić przed światłem. Sprawdź dysze dozujące, aby upewnić się, że są suche i nie są zablokowane. Zagruntować kanały, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.
2. Rozłóż płytki testowe i dozuj 2 μl roboczego rozcieńczenia substratu do każdej studzienki. Sprawdź, czy substrat jest dozowany bezpośrednio do każdej studzienki. Ułóż płytki w stos i umieść jedną pustą płytkę testową na pierwszej płytce i jedną pustą płytkę pod dolną płytką w stosie, aby zapobiec parowaniu podczas odczytu i ponownego układania w czytniku płytek.

11. Pomiary fluorescencji

1. Natychmiast załaduj stos płytek testowych do czytnika płytek fluorescencyjnych.
2. Rozpocznij pomiar fluorescencji z ustawieniami określonymi wcześniej w kroku 5.7. Szybkość oznaczania dla każdego związku jest obliczana na podstawie wykresu względnej jednostki fluorescencji (RFU) w czasie. Należy pamiętać, że ważne jest, aby uwzględnić kontrolę ujemną (DMSO) w celu uzyskania niezahamowanej szybkości; Do każdej płytki można również dodać kontrolę pozytywną ze znanym inhibitorem. Reprezentatywne dane wyjściowe z pojedynczego punktu czasowego pokazano na rysunku 2.

12. Sprzątanie

1. Uszczelnić każdą złożoną płytę zawartościową uszczelką foliową za pomocą wałka i przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. Po odczytaniu każdej płytki testowej należy wyrzucić płytki, wszelkie pozostałe rozcieńczenia LC/A lub substratu w odpadach stanowiących zagrożenie biologiczne.

Results

Test LC oparty na FRET może być wykonywany ręcznie w sposób niskoprzepustowy w celu scharakteryzowania znanych inhibitorów lub przesiewania małych bibliotek; alternatywnie, protokół może być zmniejszony i zautomatyzowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) z dużymi bibliotekami w celu identyfikacji nowych inhibitorów BoNT/A LC. Niezależnie od przyjętego podejścia, wzrost fluorescencji należy zaobserwować w czasie, gdy BoNT/A LC jest inkubowany z substratem (rysunek 1A przedstawia reprezentat...

Discussion

Opisany tutaj test LC BONT/A oparty na FRET stanowi atrakcyjną metodę identyfikacji i charakterystyki małych cząsteczek, które modulują aktywność BoNT/A LC. Oparty na roztworze charakter testu sprawia, że protokół ten jest podatny na wysokoprzepustowe badania przesiewowe opisane w sekcji Zautomatyzowana operacja w tekście protokołu. Współczynnik Z jest często używany do określenia przydatności testu w kampaniach HTS¹⁸. Określony jako Z = 1 – 3 (σ_p + σ_n)/(μ_p - μ_n), ws...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Teknova	H1021
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
Metanol (klasa HPLC)	Sigma-Aldrich	34860
Izopropanol (klasa HPLC)	Sigma-Aldrich	650447
96-dołkowa płytka testowa	Costar	3915
384-dołkowa płytka testowa o małej objętości	Greiner	788076
Lista substratów SNAPtide FITC/Dabcyl	Laboratoria biologiczne	521	Podłoże BoNT/A LC na bazie FRET
Roztwór do czyszczenia szpilek	V& P Scientific	VP 110
Bibuła niestrzępiąca V	& P Scientific	VP 540DB
Biomek Uszczelka i próbka Pokrywki z folii aluminiowej	Beckman Coulter	538619