Obserwacja i ilościowe określanie zagęszczenia fibryny w żelu za pośrednictwem fibroblastów

Podsumowanie

Techniki mikroskopii poklatkowej i przetwarzania obrazów zostały użyte do obserwacji i analizy zagęszczenia żelu za pośrednictwem fibroblastów i wyrównania włókien fibryny w bioreaktorze kontrolowanym przez środowisko przez okres 48 godzin.

Streszczenie

Komórki osadzone w żelach kolagenowych i fibrynowych przyłączają się i wywierają siły trakcyjne na włókna żelu. Siły te mogą prowadzić do lokalnej i globalnej reorganizacji i ponownego dostosowania mikrostruktury żelu. Proces ten przebiega w złożony sposób, który jest częściowo zależny od wzajemnego oddziaływania między lokalizacją komórek, geometrią żelu i mechanicznymi ograniczeniami żelu. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób te zmienne wytwarzają globalne wzorce wyrównania włókien, używamy mikroskopii poklatkowej różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) w połączeniu z bioreaktorem kontrolowanym środowiskowo, aby obserwować proces zagęszczania między geometrycznie rozmieszczonymi eksplantatami (klastrami fibroblastów). Obrazy są następnie analizowane za pomocą niestandardowego algorytmu przetwarzania obrazu w celu uzyskania map odkształcenia. Informacje uzyskane za pomocą tej techniki mogą być wykorzystane do badania mechanobiologii różnych interakcji komórka-macierz, co ma ważne implikacje dla zrozumienia procesów gojenia się ran, rozwoju chorób i zastosowań inżynierii tkankowej.

Wprowadzenie

Ważnym narzędziem do badania interakcji komórka-matryca jest wypełniony komórkami żel kolagenowy^1,2. Żel zapewnia środowisko 3D, które jest bliższe charakterowi tkanki in vivo i lepiej nadaje się do zrozumienia zachowania komórek niż jest to oferowane przez tradycyjne hodowle 2D³. Wczesne badania, w których fibroblasty były jednorodnie rozmieszczone w żelu kolagenowym, wykazały, że komórki szybko konsolidują włókna kolagenowe i zagęszczają żel^4,5. Kurczliwe fibroblasty w swobodnie pływających żelach przechodzą następnie w stan spoczynku wkrótce po tym, jak żel w pełni osiągnie zagęszczenie^1,6,7. Fibroblasty w żelach, które są ograniczone na granicach, pozostają w stanie aktywnym, syntetycznym⁸ i generują wyrównanie włókien w sposób zależny od geometrii żelu i ograniczeń zewnętrznych^5,9. Różnice w aktywności komórek wydają się być wynikiem wewnętrznego napięcia (lub jego braku), które rozwija się, gdy komórki wywierają siły trakcyjne poprzez integryny na włókna kolagenowe w żelu.

Wariant tej techniki polega na umieszczeniu eksplantatów fibroblastów (tj. zlepków komórek) w pewnej odległości od siebie w żelu kolagenowym i obserwowaniu interakcji komórka-macierz oraz stopniowego rozwoju wyrównania włókien między eksplantatami (czasami nazywanymi paskami przypominającymi więzadła)^10-12. Podstawową zaletą systemu eksplantacji jest to, że pozwala on na układanie komórek w proste wzory geometryczne, co ułatwia wizualizację i badanie mechanizmów leżących u podstaw wyrównania włókien napędzanych komórkami. Te wzorce wyrównania - które są zależne przede wszystkim od wzajemnego oddziaływania między siłami trakcyjnymi komórek, rozkładem przestrzennym komórek, geometrią żelu i ograniczeniami mechanicznymi żelu - są ważne do zrozumienia, ponieważ odgrywają kluczową rolę w globalnej organizacji tkanek, funkcjach mechanicznych i lokalnym środowisku mechanicznym¹³.

W dziedzinie inżynierii tkankowej, jedna ze strategii wytwarzania mechanicznie funkcjonalnych, inżynieryjnych tkanek polega na kontrolowaniu wzorca wyrównania włókien, który rozwija się w wyniku zagęszczenia komórek, tak aby zmodyfikowana tkanka posiadała wyrównanie włókien naśladujące to w tkance natywnej^14,15. Uważa się, że takie wyrównanie jest konieczne, aby zmodyfikowane tkanki mogły odtworzyć złożone mechaniczne zachowanie tkanek rodzimych. Modyfikacja tej strategii polega na zastąpieniu żelu kolagenowego żelem fibrynowym¹⁶. Żel fibrynowy rozwija podobny wzór wyrównania jak żel kolagenowy podczas zagęszczania. Z biegiem czasu fibryna ulega degradacji i jest zastępowana przez zsyntetyzowany w komórkach ECM, który podąża za początkowym wzorcem wyrównania włókien fibryny. Uzyskany w ten sposób konstrukt inżynieryjny znacznie poprawił właściwości mechaniczne w porównaniu z konstruktami pochodzącymi z żelu kolagenowego¹⁷.

Proces wyrównywania i następujące po nim zdarzenia przebudowy w żelach fibrynowych przebiegają w skomplikowany i słabo zrozumiały sposób. Aby lepiej scharakteryzować te interakcje i ich wpływ na zachowanie komórek i przebudowę ECM, opracowaliśmy procedurę opartą na metodzie eksplantatu. W tej metodzie eksplantaty fibroblastów umieszcza się na żelu fibrynowym w różnych wzorach geometrycznych. Żele są przechowywane w kontrolowanym środowiskowo, zamontowanym pod mikroskopem bioreaktorze¹⁸, a proces zagęszczania i ponownego ustawiania włókien jest monitorowany za pomocą mikroskopii poklatkowej z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC). Pola przemieszczeń są określane ilościowo za pomocą niestandardowych algorytmów. Dane uzyskane z tych eksperymentów mają szerokie implikacje dla wielu procesów, w tym optymalizacji strategii inżynierii tkankowej, poprawy gojenia się ran i leczenia patologicznej przebudowy tkanek.

Protokół

1. Przygotowanie szablonu

Przygotuj szablon na Parafilm, aby ułożyć lokalizację każdego eksplantu, zgodnie z pożądaną geometrią (Rysunki 1A i 1B). Odstęp między każdym eksplantatem a około 1-2 mm odstępem. Odległość ta odpowiada idealnemu odstępowi do generowania wyrównania włókien między eksplantatami. Przymocuj szablon pod obszarem szkła nakrywkowego, w którym próbka zostanie przygotowana za pomocą taśmy.

2. Sterylizacja

Dokładnie wyczyść wszystkie elementy bioreaktora przy użyciu 70% etanolu i sterylizuj przez 2-3 godziny w świetle UV przed eksperymentem. Jeśli zamiast bioreaktora używane jest alternatywne naczynie, należy zastosować odpowiednie techniki sterylizacji. Zobacz krok 4.12, aby zapoznać się z uwagami na temat używania szalki Petriego ze szklanym dnem.

3. Przygotowanie żelu fibrynowego

Po wysterylizowaniu elementów bioreaktora, nałóż cienką warstwę żelu fibrynowego na powierzchnię szkła nakrywkowego. Szczegóły dotyczące przygotowania roztworów podstawowych fibrynogenu i trombiny do wytwarzania żeli fibrynowych 6,6 mg/ml opisano w Sander i wsp. ¹³ Podobny protokół opracowany przez Ye i wsp. ¹⁹ do wytwarzania żeli fibrynowych 3,3 mg/ml można również zobaczyć na stronie internetowej JoVE.

1. Przygotować roztwór mikrogranulek fluorescencyjnych w DMEM o stężeniu 10 milionów kulek/ml. Koraliki będą używane do śledzenia przemieszczeń żelu. Aby osiągnąć to stężenie, należy połączyć 0,017 ml roztworu podstawowego mikrogranulek i 0,149 ml DMEM w probówce do mikrowirówki.
2. Sonikować tę zawiesinę przez 10 minut, aby rozproszyć kulki i homogenizować roztwór.
3. Roztwór fibryny — W 15 ml probówce c wymieszać 0,22 ml roztworu podstawowego fibrynogenu z 0,44 ml 20 mM buforu HEPES. Dodać 0,1667 ml DMEM z mikrogranulkami utworzonymi w kroku 3.1.
4. Roztwór trombiny — W oddzielnej 15 ml probówce C wymieszać 0,0328 ml roztworu podstawowego trombiny, 0,131 ml 20 mM buforu HEPES i 0,00246 ml 2 M CaCl₂.
5. Ostrożnie wymieszać roztwór trombiny (krok 3.4) z roztworem fibrynogenu (krok 3.3), pipetując w górę i w dół 5-10 razy, aż roztwór zostanie równomiernie rozprowadzony. Unikaj wprowadzania bąbelków tak bardzo, jak to możliwe. Aby zmniejszyć ilość wytwarzanych pęcherzyków, należy uważać, aby nie rozładować całkowicie pipety podczas mieszania.
6. Dodanie trombiny spowoduje, że roztwór szybko się zżeluje (~30 sekund). Odpipetować wymieszany roztwór na szkło nakrywkowe tak szybko, jak to możliwe. Pozostawić żel do polimeryzacji w temperaturze pokojowej.
7. Uszczelnij bioreaktor, włóż bloki grzewcze i podłącz termopary do regulatora temperatury. Inkubować żel w temperaturze 37 °C przez 15-30 min.

4. Przygotowanie eksplantatu komórkowego

1. Usunąć pożywkę z kolby T-75 zawierającej ludzkie komórki fibroblastów skóry właściwej.
2. Ostrożnie spłukać powierzchnię około 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu usunięcia białek surowicy. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA i inkubować przez 3 minuty lub do momentu, gdy komórki się uniosą.
3. Po podniesieniu komórek odwirować zawiesinę w wirówce o sile 200 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w objętości DMEM, która pozwoli na uzyskanie końcowego stężenia 20 milionów komórek/ml.
4. Podczas gdy komórki wirują w wirówce, odłącz bioreaktor od bloków grzewczych i termopar. Przenieś bioreaktor do komory bezpieczeństwa biologicznego i ostrożnie zdejmij pokrywę zgodnie z technikami asceptycznymi.
5. Egplantaty należy stworzyć, pipetując 0,3 μl zawiesiny komórkowej na spolimeryzowany żel fibrynowy, postępując zgodnie ze wzorem na szablonie. Każdy eksplant powinien zawierać około 6 000 komórek. Upewnij się, że używane są końcówki do mikropipet o małej objętości (0,1-10 μl).
6. Pozostawić komórki do osadzenia się i przyłączyć do matrycy fibrynowej na 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
7. Gdy bioreaktor jest nadal otwarty, dodać około 5 ml DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliny-streptomycyny, 0,1% amfoterycyny B i 10 mg/ml aprotyniny bezpośrednio do komory bioreaktora. DMEM jest buforowany wodorowęglanem i wymaga 5% CO₂ do utrzymania neutralnego pH. Ponieważ bioreaktor nie jest zasilany w CO₂ , przed użyciem kondycjonuj pożywkę w inkubatorze z 5% CO₂ przez 2-3 godziny. Aprotynina jest inhibitorem proteazy seryny, który jest szeroko stosowany w celu zmniejszenia szybkości degradacji fibryny²⁰.
8. Ponownie uszczelnić bioreaktor. Za pomocą strzykawki dostarczyć dodatkowe 5 ml pożywki kondycjonowanej CO₂ przez złączkę kolczastą na porcie wlotowym. Powoli dozuj pożywkę i upewnij się, że cała objętość komory bioreaktora jest wypełniona. Ostrożnie usuń pęcherzyki, które tworzą się w bioreaktorze.
9. Dostarczaj świeżą, kondycjonowaną pożywkę o stężeniu 5% CO₂ do bioreaktora przez cały czas trwania eksperymentu, aby utrzymać pH, dostarczyć składniki odżywcze i usunąć produkty przemiany materii. Ustawić pompę strzykawkową ze strzykawką o pojemności 10 ml lub 30 ml wypełnioną pożywką kondycjonowaną w 5% CO_{2 .} Podłączyć strzykawkę bezpośrednio do portu wlotowego na pokrywie bioreaktora za pomocą sterylnego przewodu dopasowanego do Luer-lock. Zdejmij złączkę męską i przymocuj rurkę do złączki kolczastej w bioreaktorze (patrz rysunek 1C).
10. Ustaw szybkość perfuzji na 0,01 ml/min. Podłącz zmodyfikowane kawałki rurki do obu portów wylotowych i umieść końce w zlewce o pojemności 100 ml, aby zebrać odpady.
11. Użyj podnośnika laboratoryjnego, aby ustawić wysokość kanałów wlotowych i wylotowych, aby w bioreaktorze nie powstała różnica ciśnień (patrz rysunek 1D w celach informacyjnych).
12. Jeżeli bioreaktor nie jest dostępny, należy przygotować próbki na szalkach Petriego ze szklanym dnem o średnicy 35 mm ze szklanymi pokrywami. Użyj szkiełka nakrywkowego o rozmiarze zoptymalizowanym pod kątem konkretnego zestawu celów, które mają być użyte. Próbki przygotowane na płytkach Petriego powinny być przechowywane w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
    Uwaga: Polistyren depolaryzuje światło i zakłóca obrazowanie DIC, dlatego jeśli ma być przeprowadzane obrazowanie DIC, należy używać szklanych blatów. Kontrast fazowy jest odpowiednią alternatywną metodą obrazowania. Przenoszenie szalek między inkubatorem a mikroskopem utrudni rejestrację obrazu. Jeśli obrazy nie zostaną prawidłowo zarejestrowane, obciążenie obliczone w sekcji 6 nie będzie dokładne.

5. Obrazowanie poklatkowe

1. Po przygotowaniu próbki należy ponownie uszczelnić bioreaktor, ponownie podłączyć bloki grzewcze i termopary, a następnie ustawić temperaturę bioreaktora na 37 °C.
2. Ustaw bioreaktor na zmotoryzowanym stoliku zamontowanym pod mikroskopem. Ustaw obiektyw 20X DIC pod view-port. Obiektyw o mniejszym powiększeniu jest dopuszczalny, szczególnie jeśli precyzyjny stolik z napędem silnikowym nie jest dostępny. Upewnij się, że polaryzator, analizator i pryzmat są na swoim miejscu. Alternatywnie, próbki mogą być również obrazowane przy użyciu kontrastu fazowego.
3. Otwórz oprogramowanie do obrazowania.
4. Skoncentruj cel na obszarze między trzema eksplantacjami.
5. Zapisz współrzędne (x, y i z) tej lokalizacji w oprogramowaniu do obrazowania.
6. Aby zobrazować cały obszar pomiędzy eksplantatami i wokół nich, wybierz opcję uzyskania dużego obrazu i określ rozmiar obszaru. Umożliwi to uzyskanie wielu obrazów wokół określonego obszaru i utworzenie obrazu kafelkowego, który reprezentuje większy region próbki.
7. Ustaw czas ekspozycji i natężenie światła na najniższe możliwe wartości, aby uniknąć śmierci komórki spowodowanej fototoksycznością, jednocześnie zapewniając wystarczającą rozdzielczość do rozróżnienia komórek, mikrogranulek i włókien fibrynowych.

6. Śledzenie szczepów

Aby uzyskać szczegółowe informacje i instrukcje dotyczące używanego oprogramowania do śledzenia odkształceń (Rysunek 2), zobacz Raghupathy et al.²¹ Algorytm jest niestandardowym kodem MATLAB, który można pobrać ze strony http://www.license.umn.edu/default.aspx. Należy pamiętać, że obrazy DIC często mają wystarczającą ilość tekstur do śledzenia odkształceń. Mikrokulki są dołączone, aby służyć jako kontrola obliczonych pól odkształceń. Jeśli śledzenie odkształcenia ma być wykonywane, bardzo ważne jest, aby uzyskane obrazy zostały wykonane dokładnie w tym samym miejscu, aby obrazy zostały zarejestrowane. Niezarejestrowane obrazy będą wytwarzać fałszywe szczepy.

Wyniki

Przebudowa tkanek to złożony proces napędzany częściowo przez wzajemne oddziaływania fizyczne między komórkami a otaczającą je macierzą. Komórki reorganizują otaczające włókna i generują napięcie w sieci włókien. Z kolei orientacja włókien i środowisko mechaniczne kontrolują zachowanie komórek, dzięki czemu zarówno komórki, jak i macierz reorganizują się globalnie, prowadząc do przebudowy tkanki. W tym eksperymencie komórki eksplantów, początkowo o okrągłej morfologii, zaczęły wnikać w żel i przylegać do włókien fibryny ...

Dyskusja

Protokół ten został opracowany w celu obserwacji i ilościowego określenia mechaniki zaangażowanej w przebudowę ECM za pośrednictwem komórki. Takie procesy leżą u podstaw wielu zjawisk biologicznych i mają ważne implikacje dla inżynierii tkanek^2,22, redukcji blizny^1,23 i zrozumienia patologicznej przebudowy tkanek^12,24. Zastosowanie poklatkowej mikroskopii DIC pozwala na określenie i ilościowe określenie przemieszczenia i wyrównania włókien fibryny, które zachodzi w wyniku działania sił tr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sigma-Aldrich	F8630
Sigma-Aldrich	T4648
Gibco	11965-092
Gibco	15140-122
Sigma-Aldrich	A2942
Sigma-Aldrich	H0887
Sigma-Aldrich	223506
Gibco	25200-056
Invitrogen	3000
Lonza	DE14-701F
Sondy molekularne	F8858
GIBCO	A10483-01
GIBCO	11430-030
Fisher-Scientific	SS264-1
Sigma-Aldrich	A3428-25MG
Bioreaktor biotense	ADMET
Ti-Eclipe Mikroskop	Nikon
# 0 35 mm Szklana płytka Petriego z dnem	MatTek	P35G-0-20-C
# 0 35 mm Szklana szalka Petriego	MatTek	P35GTOP-0-20-C
Plastikowe złączki Luer, rurki PVC z końcówkami Luer	Cole-Parmer	30600-65