Techniki mikroskopii poklatkowej i przetwarzania obrazów zostały użyte do obserwacji i analizy zagęszczenia żelu za pośrednictwem fibroblastów i wyrównania włókien fibryny w bioreaktorze kontrolowanym przez środowisko przez okres 48 godzin.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obserwacja i ilościowe określanie zagęszczenia fibryny w żelu za pośrednictwem fibroblastów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki osadzone w żelach kolagenowych i fibrynowych przyłączają się i wywierają siły trakcyjne na włókna żelu. Siły te mogą prowadzić do lokalnej i globalnej reorganizacji i ponownego dostosowania mikrostruktury żelu. Proces ten przebiega w złożony sposób, który jest częściowo zależny od wzajemnego oddziaływania między lokalizacją komórek, geometrią żelu i mechanicznymi ograniczeniami żelu. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób te zmienne wytwarzają globalne wzorce wyrównania włókien, używamy mikroskopii poklatkowej różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) w połączeniu z bioreaktorem kontrolowanym środowiskowo, aby obserwować proces zagęszczania między geometrycznie rozmieszczonymi eksplantatami (klastrami fibroblastów). Obrazy są następnie analizowane za pomocą niestandardowego algorytmu przetwarzania obrazu w celu uzyskania map odkształcenia. Informacje uzyskane za pomocą tej techniki mogą być wykorzystane do badania mechanobiologii różnych interakcji komórka-macierz, co ma ważne implikacje dla zrozumienia procesów gojenia się ran, rozwoju chorób i zastosowań inżynierii tkankowej.
Wprowadzenie
Ważnym narzędziem do badania interakcji komórka-matryca jest wypełniony komórkami żel kolagenowy1,2. Żel zapewnia środowisko 3D, które jest bliższe charakterowi tkanki in vivo i lepiej nadaje się do zrozumienia zachowania komórek niż jest to oferowane przez tradycyjne hodowle 2D3. Wczesne badania, w których fibroblasty były jednorodnie rozmieszczone w żelu kolagenowym, wykazały, że komórki szybko konsolidują włókna kolagenowe i zagęszczają żel4,5. Kurczliwe fibroblasty w swobodnie pływających żelach przechodzą następnie w stan spoczynku wkrótce po tym, jak żel w pełni osiągnie zagęszczenie1,6,7. Fibroblasty w żelach....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie szablonu
Przygotuj szablon na Parafilm, aby ułożyć lokalizację każdego eksplantu, zgodnie z pożądaną geometrią (Rysunki 1A i 1B). Odstęp między każdym eksplantatem a około 1-2 mm odstępem. Odległość ta odpowiada idealnemu odstępowi do generowania wyrównania włókien między eksplantatami. Przymocuj szablon pod obszarem szkła nakrywkowego, w którym próbka zostanie przygotowana za pomocą taśmy.
2. Sterylizacja
Dokładnie wyczyść wszystkie elementy bioreaktora przy użyciu 70% etanolu i sterylizuj przez 2-3 godziny w świetle UV p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przebudowa tkanek to złożony proces napędzany częściowo przez wzajemne oddziaływania fizyczne między komórkami a otaczającą je macierzą. Komórki reorganizują otaczające włókna i generują napięcie w sieci włókien. Z kolei orientacja włókien i środowisko mechaniczne kontrolują zachowanie komórek, dzięki czemu zarówno komórki, jak i macierz reorganizują się globalnie, prowadząc do przebudowy tkanki. W tym eksperymencie komórki eksplantów, początkowo o okrągłej morfologii, zaczęły wnikać w żel i przylegać do włókien fibryny .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten został opracowany w celu obserwacji i ilościowego określenia mechaniki zaangażowanej w przebudowę ECM za pośrednictwem komórki. Takie procesy leżą u podstaw wielu zjawisk biologicznych i mają ważne implikacje dla inżynierii tkanek2,22, redukcji blizny1,23 i zrozumienia patologicznej przebudowy tkanek12,24. Zastosowanie poklatkowej mikroskopii DIC pozwala na określenie i ilościowe określenie przemieszczenia i wyrównania włókien fibryny, które zachodzi w wyniku działania sił tr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy George'owi Giudice i Stevenowi Eliasonowi za przekazanie ludzkich fibroblastów skórnych oraz Rameshowi Raghupathy'emu za pomoc w algorytmie śledzenia szczepów. Wsparcie dla tej pracy zostało zapewnione przez U.S. Department of Education Graduate Assistance in Areas of National Need Fellowship (GAANN P200A120071).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Sondy molekularne | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Bioreaktor biotense | ADMET | ||
| Ti-Eclipe Mikroskop | Nikon | ||
| # 0 35 mm Szklana płytka Petriego z dnem | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Szklana szalka Petriego | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Plastikowe złączki Luer, rurki PVC z końcówkami Luer | Cole-Parmer | 30600-65 |
Bibliografia
- Grinnell, F., Petroll WM, Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).
- Sander, E. A., Barocas, V. H. Biomimetic collagen tissues: collagenous tissu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
