Ilościowa ocena migracji neutrofili człowieka przez nabłonek pęcherza moczowego z hodowlą

Podsumowanie

Opracowaliśmy model in vitro, który naśladuje ważny składnik ostrej reakcji zapalnej podczas infekcji pęcherza moczowego uropatogennym Escherichia coli. Test migracji neutrofili przezuroepitelialnych umożliwia ilościową ocenę migracji neutrofili u ludzi przez nabłonek pęcherza moczowego, hodowanych na przepuszczalnych podporach, w odpowiedzi na infekcję bakteryjną lub substancje chemoatraktantowe.

Streszczenie

Rekrutacja komórek odpornościowych z peryferii do miejsca zapalenia jest niezbędnym krokiem w wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na każdej powierzchni błony śluzowej. Podczas infekcji pęcherza moczowego leukocyty wielojądrzaste (PMN; neutrofile) migrują z krwiobiegu i przechodzą przez nabłonek pęcherza moczowego. Niepowodzenie w ustąpieniu infekcji przy braku odpowiedzi neutrofilowej świadczy o znaczeniu PMN w obronie pęcherza moczowego. Aby ułatwić kolonizację nabłonka pęcherza moczowego, uropatogenna Escherichia coli (UPEC), czynnik wywołujący większość infekcji dróg moczowych (ZUM), tłumi ostrą reakcję zapalną za pomocą różnych częściowo zdefiniowanych mechanizmów. Aby dokładniej zbadać wzajemne oddziaływanie między gospodarzem a patogenem bakteryjnym, opracowaliśmy model in vitro tego aspektu wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na UPEC. W transuroepitelialnym teście migracji neutrofili, odmianie komory Boydena, hodowane komórki nabłonka pęcherza moczowego są hodowane do zbiegu na spodniej stronie przepuszczalnego podłoża. PMN są izolowane z ludzkiej krwi żylnej i są nakładane na podstawno-boczną stronę warstw komórek nabłonka pęcherza moczowego. Migrację PMN reprezentującą fizjologicznie istotny kierunek podstawno-boczny do wierzchołkowego w odpowiedzi na infekcję bakteryjną lub cząsteczki chemoatraktantu oblicza się za pomocą hemocytometru. Model ten może być wykorzystany do zbadania interakcji między UPEC a komórkami eukariotycznymi, a także do zbadania wymagań molekularnych dotyczących przechodzenia nabłonka pęcherza moczowego przez PMN. Model migracji neutrofili przez-nabłonkowych pozwoli nam lepiej zrozumieć początkową reakcję zapalną na UPEC w pęcherzu moczowym.

Wprowadzenie

Ruch komórek w całym ciele, często na duże odległości, jest niezbędny do wzrostu i rozwoju, gojenia się ran i odpowiedzi immunologicznej. Migracja komórek jest złożona i wymaga koordynacji wielu różnych procesów, w tym kaskad sygnalizacyjnych i przegrupowania składników cytoszkieletu. Komórki mogą poruszać się losowo (chemokineza), a także w kierunku zdefiniowanych gradientów chemicznych (chemotaksja). Opracowano wiele technik badania migracji komórek in vitro. Najstarsza i najbardziej powszechna technika, komora Boydena, składa się z pionowego systemu dwukomorowego, w którym substancja chemoatraktantowa jest umieszczana w dolnej komorze, a komórki będące przedmiotem zainteresowania są umieszczane w górnej komorze¹. Monitorowany jest ruch komórek w poprzek filtra przepuszczalnego, z porami o określonej wielkości, oddzielającymi dwie komory. Opracowano dodatkowe techniki badania migracji komórek, w tym komorę Zigmonda² i komorę Dunna³. Te zbiorowe podejścia dostarczyły istotnych informacji na temat ruchu wielu różnych typów komórek.

Oprócz badania podstawowych zasad chemokinezy i chemotaksji, testy dwukomorowe ułatwiły badanie migracji komórek przez składniki macierzy zewnątrzkomórkowej oraz warstwy komórek śródbłonka i nabłonka. Przewagą systemów dwukomorowych nad innymi technikami jest to, że porowata błona może być pokryta białkami, takimi jak kolagen lub fibrynogen, a także można ocenić migrację komórek przez barierę przypominającą macierz zewnątrzkomórkową. Dodatkowo hodowane linie komórkowe mogą być hodowane i różnicowane na przepuszczalnych podporach. Aby zbadać ruch komórek przez barierę śródbłonka, hodowane komórki śródbłonka są wysiewane i hodowane w górnym zbiorniku przepuszczalnych podpór. Komórki ruchome, takie jak komórki odpornościowe, są dodawane do górnego zbiornika i obserwuje się migrację do dolnego zbiornika przez barierę śródbłonkową w fizjologicznym kierunku wierzchołkowym do podstawno-bocznego. Model ten okazał się nieoceniony w zrozumieniu wynaczynienia komórek odpornościowych z krwiobiegu. W przeciwieństwie do migracji przezśródbłonkowej, ruch komórek przez barierę nabłonkową zwykle odbywa się w kierunku podstawno-bocznym do wierzchołkowego. Aby modelować te zdarzenia in vitro, naukowcy wysiewają i hodują hodowane komórki nabłonkowe na spodniej stronie przepuszczalnych podpór. Komórki ruchome są dodawane do górnego zbiornika i monitorowana jest migracja przez barierę nabłonkową, reprezentującą kierunek podstawno-boczny do wierzchołkowego. Takie modele migracji przeznabłonkowej znacząco przyczyniły się do naszego zrozumienia reakcji zapalnych na powierzchniach błon śluzowych, szczególnie w płucach i jelitach^4,5.

Natomiast transport komórek odpornościowych przez nabłonek dróg moczowych cieszy się znacznie mniejszym zainteresowaniem. Aby pogłębić naszą wiedzę na temat wrodzonych odpowiedzi immunologicznych w drogach moczowych podczas zakażenia uropatogenną Escherichia coli (UPEC), opracowaliśmy test in vitro, test migracji neutrofili przeznabłonkowych, który umożliwia badanie ruchu leukocytów wielojądrzastych (PMN; neutrofili) przez barierę nabłonkową pęcherza moczowego ^6-8. Podobnie jak w przypadku innych dwukomorowych modeli migracji przeznabłonkowej, hodowane ludzkie komórki nabłonka pęcherza moczowego są hodowane na spodniej stronie przepuszczalnego podłoża i tworzą zlewające się warstwy nabłonka. Ludzkie neutrofile, wyizolowane z krwi żylnej, są umieszczane po podstawno-bocznej stronie warstwy nabłonka, a migracja przez nabłonek w fizjologicznie istotnym kierunku podstawno-bocznym do wierzchołkowego jest określana ilościowo w odpowiedzi na zakażenie różnymi szczepami E. coli lub obecność cząsteczek chemoatraktantu. Wiele badań koncentrowało się na ruchu neutrofili, zarówno chemokinezy, jak i chemotaksji, przy braku dodatkowych typów komórek. Test migracji neutrofili przeznabłonkowych jest korzystny, ponieważ uwzględnia złożone interakcje między komórkami nabłonka pęcherza moczowego a komórkami odpornościowymi podczas infekcji. Ten elastyczny model in vitro może potencjalnie umożliwić szczegółowe badanie odpowiedzi immunologicznych na powierzchniach nabłonka moczowego.

Protokół

1. Hodowla 5637 komórek nabłonka pęcherza moczowego

Wykonaj następujące kroki w kapturze do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, przygotowanym za pomocą promieniowania UV i przetartym 70% etanolem.

1. Przygotować pożywkę RPMI-1640 zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) [określaną jako RPMI+], przefiltrować wysterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i ogrzać do 37 °C w łaźni wodnej.
2. Rozmrozić kriowial składający się z 5637 komórek (American Type Culture Collection HTB-9; pochodzący z raka pęcherza moczowego) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Szybko przenieś rozmrożone komórki do kolby do hodowli tkankowych o długości 75^cm2 zawierającej 20 ml RPMI+.
3. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO_{2 do} momentu, gdy komórki zlewają się w około 95% (~6 x 10⁶ komórek na kolbę), około 4 dni.
4. Aby przeprowadzić subkulturę 5637 komórek:
   1. Usunąć podłoże z kolby. Umyj komórki 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco w temperaturze pokojowej.
   2. Dodać 6 ml ciepłego (37 °C) 0,05% roztworu trypsyny, 0,02% EDTA do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 15 minut.
   3. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i osadzać przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć roztwór trypsyny/EDTA.
   4. Ponownie zawiesić komórki w 6 ml RPMI+ (10⁶ komórek/ml) i przenieść 1 ml (10⁶ komórek) do nowej kolby o długości 75^cm2 zawierającej 20 ml RPMI+.
5. Powtórz krok 1.4 dla subhodowli komórek co 4 dni lub gdy komórki osiągną 95% konfluencji.

2. Siew i uprawa 5637 komórek na przepuszczalnych podporach

Wykonaj następujące kroki w kapturze do hodowli tkanek przy użyciu techniki aseptycznej. Aby uzyskać optymalne wyniki, użyj 5637 komórek, które przeszły mniej niż 10 subkultur.

1. Za pomocą sterylnych kleszczy odwróć przepuszczalne podpory w sterylnym naczyniu do hodowli tkanek o głębokości 25 mm.
2. Trypsynizować kolbę o długości 75^cm2 zawierającą 5637 komórek przy 95% zbiegu zgodnie z krokami 1.4.1-1.4.3.
3. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl delikatnie zawiesić komórki w ~2 ml RPMI+ do stężenia 3 x 10⁶ komórek/ml, oznaczonego przez zliczanie komórek za pomocą hemocytometru.
4. Nanieść 50 μl zawiesiny komórek (1,5 x 10⁵ komórek) na każde przepuszczalne podłoże bez dotykania błony. Umieść pokrywkę na naczyniu i ostrożnie umieść naczynie w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ na nie dłużej niż 16 godzin.
5. Za pomocą sterylnych kleszczyków umieść przepuszczalne podpory w 24-dołkowej płytce zawierającej 0,6 ml RPMI+ na studzienkę. Dodaj 0,1 ml RPMI+ do górnego zbiornika każdego przepuszczalnego nośnika. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
6. Wymieniaj podłoże co 2 dni. Najpierw należy zassać pożywkę z górnego zbiornika, a następnie dolnego zbiornika, a następnie nanieść świeży RPMI+ w odwrotnej kolejności do dolnego zbiornika (0,6 ml), a następnie do górnego zbiornika (0,1 ml).
7. Siedem dni po wysianiu przepuszczalnych podpór z 5637 komórkami oceń zbieg komórek. Napełnij górny zbiornik RPMI+ (~0,35 ml). Komórki są wystarczająco zlewne, gdy podłoże nie znajduje równowagi między górnym i dolnym zbiornikiem.

3. Przygotowanie inokulum bakteryjnego

1. Stosując technikę aseptyczną, dodać 20 ml odpowiedniego bulionu hodowlanego do kolby o pojemności 250 ml z nakrętką. Do hodowli bakterii E. coli należy używać bulionu Luria-Bertani (LB) i w razie potrzeby dodawać antybiotyki do bulionu.
2. Za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej zaszczepij bulion bakteriami z bulionu glicerolowego lub płytki smugowej. W przypadku szczepów UPEC inkubować kulturę bakteryjną w temperaturze 37 °C przez około 16 godzin, bez wstrząsania (w celu pobudzenia produkcji pilusów typu 1).
3. Przenieś kulturę bakteryjną do probówki wirówkowej. Osadzać bakterie przez odwirowanie przy 8 000 x g przez 10 minut.
4. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić bakterie w PBS do OD₆₀₀ = 1.000, co odpowiada ~10⁹ CFU/ml.
   1. Aby wytworzyć bodziec bakteryjny zabity termicznie, należy inkubować podwielokrotność (np. ~1,5 x 10⁸ CFU w 150 μl) zawieszonych bakterii w temperaturze 55 °C przez 30 minut. Umieścić na płytce podwielokrotność zawiesiny zabitej termicznie w celu potwierdzenia śmierci bakterii.
5. Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć zawieszone bakterie (żywe lub zabite termicznie) 10-krotnie do 10⁸ CFU/ml w ciepłym RPMI bez surowicy [zwanym RPMI-] w probówce do mikrofuge.

4. Izolacja ludzkich neutrofili od krwi obwodowej

Pobieranie krwi od dorosłych ochotników wymaga wcześniejszego przeglądu i zatwierdzenia przez instytucjonalną komisję rewizyjną. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i odpowiednio utylizować materiały niebezpieczne, aby uniknąć narażenia na kontakt z ludzką krwią.

1. Około 25 ml krwi żylnej od zdrowego dorosłego ochotnika powinno zostać pobrane do 3 sterylnych probówek do pobierania krwi zawierających heparynę sodową przez personel przeszkolony w zakresie upuszczania krwi.
   1. Szczelnie owiń gumową opaskę uciskową wokół ramienia, powyżej łokcia.
   2. Zdezynfekuj miejsce wejścia, dół przedłokciowy, za pomocą sterylnej chusteczki nasączonej 70% alkoholem.
   3. Przymocuj plastikowy uchwyt na rurkę do systemu skrzydeł motylkowych.
   4. Wbić igłę do żyły łokciowej pod kątem 30° lub mniejszym, skosem skierowanym do góry. Igła przebiła żyłę, gdy w plastikowej rurce pojawia się tryskająca krew.
   5. Włóż probówkę do pobierania krwi do plastikowego uchwytu probówki. Gdy pierwsza probówka zbiorcza jest pełna, wymień ją na drugą. Powtórz z trzecią tubką.
   6. Gdy trzecia probówka jest wypełniona mniej więcej do połowy, zdejmij opaskę uciskową.
   7. Przykryj miejsce wkłucia sterylnym wacikiem i powoli wyjmij igłę z żyły. Nasuń osłonę ochronną na igłę i umieść w pojemniku na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne.
   8. Uciskaj miejsce nakłucia. Przykryj miejsce nakłucia i wacik bandażem samoprzylepnym.
   9. Delikatnie odwróć probówki do pobierania krwi, aby rozproszyć heparynę.

Wykonaj następujące kroki w kapturze do hodowli tkanek przy użyciu techniki aseptycznej.

2. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml delikatnie przenieś krew do świeżej, sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Dodaj równoważną objętość 3% (w/v) dekstranu w 0,9% NaCl i wymieszaj przez inwersję. Inkubować probówkę w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
3. Nie naruszając dolnej warstwy, ostrożnie zassać górną warstwę i przenieść ją do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Granulować komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 min. Odrzucić supernatant.
4. Zawiesić osad komórkowy w objętości 0,9% NaCl odpowiadającej początkowej objętości krwi.
5. Warstwę 10 ml gęstego roztworu wirującego pod zawiesinę komórkową, zachowując granicę faz między dwiema fazami. Wirować przy 400 x g przez 30 minut bez hamulca. Odrzucić supernatant.
6. Aby zlizować pozostałe czerwone krwinki, ponownie zawieś osad komórkowy w 10 ml zimnego 0,2% NaCl. Inkubować przez 30 sekund, a następnie natychmiast dodać 10 ml zimnego 1,6% NaCl, aby przywrócić izotoniczność.
7. Osadzać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 6 minut. Odrzucić supernatant.
8. Powtarzaj kroki 4.6-4.7, aż osadek komórkowy wydaje się być wolny od czerwonych krwinek, zwykle 3 rundy lizy.
9. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl zawiesić osad komórek, głównie PMN, w ciepłym (37 °C) RPMI- do stężenia 10⁷ komórek/ml, oznaczonego przez zliczanie komórek za pomocą hemocytometru. Przechowywać ogniwa w temperaturze 37 °C do momentu użycia. Zazwyczaj żywotność i czystość PMN wynoszą >99%, co ocenia się odpowiednio za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego i wizualizacji morfologii jądra po barwieniu.

5. Test migracji neutrofili przezuroepitelialnych

Wykonaj następujące kroki w kapturze do hodowli tkanek przy użyciu techniki aseptycznej. Używaj tylko przepuszczalnych podpór zawierających zlewające się warstwy komórek 5637, jak określono w kroku 2.7. Płytki 24-dołkowe zawierające RPMI- można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ do momentu użycia.

1. Podwielokrotność 1 ml ciepłego RPMI- na studzienkę w 24-dołkowej płytce; przygotować 3 dołki na przepuszczalne podłoże.
2. Zassać pożywkę z górnego i dolnego zbiornika przepuszczalnych podpór.
3. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś przepuszczalne podpory na 24-dołkową płytkę przygotowaną w kroku 5.1. Umyj przepuszczalne podpory trzykrotnie, przenosząc podpory ze studni do studni.
4. Jeśli ma być użyty inokulum bakteryjne, należy odwrócić przepuszczalne podpory w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowych o głębokości 25 mm. Jeżeli ma być użyty chemoatraktant (np. N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) lub IL-8), należy przejść do kroku 5.6.
5. W przypadku eksperymentów z żywymi lub zabitymi bodźcami bakteryjnymi, należy zaszczepić wierzchołkową stronę każdego przepuszczalnego podłoża 60 μl RPMI- (pozorowana infekcja) lub inokulum bakteryjnym (6 x 10⁶ CFU) przygotowanym w kroku 3.5. Umieścić pokrywkę na naczyniu i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 1 godzinę.
6. Dodać 0,6 ml RPMI- na studzienkę do 24-dołkowej płytki o niskim mocowaniu; przygotować 1 dołek na przepuszczalne podłoże. Przygotuj 3 studzienki zawierające 0,5 ml RPMI- w celu wyliczenia danych wejściowych PMN.
   1. Jeśli zamiast bakterii stosuje się chemoatraktant, dodać chemoatraktant do 0,6 ml RPMI- w 24-dołkowej płytce przygotowanej w kroku 5.6.
7. Umieść przepuszczalne podpory w 24-dołkowej płycie o niskim mocowaniu.
8. Dodać 0,1 ml PMN (10⁶ PMN), przygotowanego w kroku 4.9, do górnego zbiornika (strona podstawno-boczna) każdej przepuszczalnej podpory. Dodać 100 μl PMN bezpośrednio do studzienek zawierających 500 μl RPMI-. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 1 godzinę.
9. Za pomocą sterylnych kleszczyków delikatnie zeskrob membranę przepuszczalnego podłoża o krawędź studzienki, aby usunąć dodatkowy PMN od strony wierzchołkowej, a następnie wyrzuć podporę.
10. Zebrać PMN, delikatnie zeskrobując dno każdej studzienki za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl, a następnie przenieść zawiesiny PMN do probówek do mikrofuge.
11. Wylicz PMN za pomocą hemocytometru.
12. Aby obliczyć całkowitą liczbę PMN w dolnym zbiorniku, pomnóż liczbę PMN w 1 mm² (100 nl) przez 6 000. Dane mogą być raportowane jako procent wejściowego PMN lub jako liczby PMN znormalizowane do 10⁶ wejściowych PMN.

Wyniki

Test transurotelialnej migracji neutrofili umożliwia ilościową ocenę migracji ludzkich PMN przez hodowlane warstwy komórek nabłonka pęcherza moczowego w odpowiedzi na różne bodźce (Rycina 1B). Choć protokół jest prosty, istnieje szereg zmiennych, które mogą wpływać na migrację PMN, a w konsekwencji na powtarzalność tego testu. Podczas przygotowania wkładów przepuszczalnych oraz PMN należy podjąć odpowiednie środki w celu zmniejszenia zmienności między powtórzeniami technicznymi i biologicznymi. Na przykł...

Dyskusja

Korzystając z hodowli linii komórek nabłonka pęcherza moczowego i świeżo wyizolowanego ludzkiego PMN, stworzyliśmy model migracji międzynabłonkowych neutrofili in vitro . Model ten odegrał zasadniczą rolę w rozpoczęciu analizy złożoności wrodzonej odpowiedzi immunologicznej podczas infekcji dróg moczowych (ZUM), niezwykle powszechnej infekcji bakteryjnej zwykle wywoływanej przez UPEC⁹. Podczas zakażenia pęcherza moczowego lub zapalenia pęcherza moczowego rekrutacja PMN do światła pęcherza moczowego je...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wkłady Transwell (i.e.  podpory przepuszczalne)	Corning	3472	6,5 mm, 3 μ m por, wkład z membrany poliestrowej
Probówki do pobierania krwi BD Vacutainer	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	16 mm x 100 mm x 10 ml zielone probówki z nakrętką zawierające heparynę sodową
BD Safety-Lok Zestaw do pobierania i infuzji krwi	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 G x 0,75 cala igła x 12 cali rurka
BD Vacutainer jednorazowego użytku, Uchwyt niesztaplowany	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	Z Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS roztwór do wirowania o gęstości	GE Healthcare	17-1440-02
Płytki o ultraniskim mocowaniu	Corning	3473	24-dołkowe, przezroczyste płaskie dno
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	Rozpuszczony w DMSO do 10 mM
Rekombinowany ludzki CXCL8/IL-8	R& Systemy D	208-IL	Rozpuszczony w PBS do 100 μ g/ml