Ekstrakcja i oczyszczanie białek pączkujących drożdży w celu badania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych

Summary

Przygotowanie wysokiej jakości ekstraktów z komórek drożdży jest niezbędnym pierwszym krokiem w analizie pojedynczych białek lub całych proteomów. Tutaj opisujemy szybki, wydajny i niezawodny protokół homogenizacji pączkujących komórek drożdży, który został zoptymalizowany w celu zachowania funkcji białek, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych.

Abstract

Homogenizacja przez ubijanie koralików to szybki i skuteczny sposób na uwolnienie DNA, RNA, białek i metabolitów z pączkujących komórek drożdży, które są niezwykle trudne do zakłócenia. W tym miejscu opisujemy zastosowanie homogenizatora perełkowego do ekstrakcji białek do zoptymalizowanych pod kątem utrzymania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych białek. Komórki rosnące logarytmicznie wyrażające białko będące przedmiotem zainteresowania są hodowane w płynnym pożywce z wyboru. Pożywki wzrostowe mogą być uzupełnione odczynnikami w celu indukowania ekspresji białek z indukowalnych promotorów (np. galaktozy), synchronizacji etapu cyklu komórkowego (np. nokodazol) lub hamowania funkcji proteasomu (np. MG132). Komórki są następnie granulowane i ponownie zawieszane w odpowiednim buforze zawierającym inhibitory proteazy i/lub fosfatazy i są natychmiast przetwarzane lub zamrażane w ciekłym azocie do późniejszego wykorzystania. Homogenizacja odbywa się w sześciu cyklach po 20 sekund ubijania kulek (5,5 m/s), po których następuje jednominutowa inkubacja na lodzie. Powstały homogenat jest oczyszczany przez wirowanie, a małe cząstki można usunąć przez filtrację. Otrzymany oczyszczony ekstrakt z całych komórek (WCE) wytrąca się przy użyciu 20% TCA w celu bezpośredniej analizy całkowitych białek za pomocą SDS-PAGE, a następnie Western blot. Ekstrakty nadają się również do oczyszczania powinowactwa określonych białek, wykrywania modyfikacji potranslacyjnych lub analizy białek współoczyszczających. Podobnie jak w przypadku większości protokołów oczyszczania białek, niektóre enzymy i białka mogą wymagać unikalnych warunków lub kompozycji buforowych do ich oczyszczania, a inne mogą być niestabilne lub nierozpuszczalne w określonych warunkach. W tym drugim przypadku przedstawiony protokół może stanowić użyteczny punkt wyjścia do empirycznego określenia najlepszej strategii ubijania kulek w celu ekstrakcji i oczyszczania białek. Pokazujemy ekstrakcję i oczyszczanie znakowanej epitopem ligazy SUMO E3, Siz1, białka regulowanego cyklem komórkowym, które ulega zarówno sumoilacji, jak i fosforylacji, a także podjednostki ligazy ubikwityny ukierunkowanej na SUMO, Slx5.

Introduction

Niesamowita moc genetyki drożdży jest legendarna, ale przygotowanie i analiza natywnych białek z pączkujących drożdży, Saccharomyces cerevisiae, jest często najeżona problemami. To ostatnie wynika ze znacznej wytrzymałości mechanicznej i elastyczności ściany komórkowej drożdży¹. Opisano różne sposoby enzymatycznego, chemicznego, mechanicznego i ciśnieniowego rozbijania komórek drożdży w celu uzyskania ekstraktu białkowego z całych komórek ^2-6. Techniki te różnią się znacznie pod względem skuteczności w celu uzyskania reprezentatywnych dla komórek, natywnych ekstraktów białkowych, które można wykorzystać do późniejszych analiz lub etapów oczyszczania. Na przykład ściana komórkowa drożdży może zostać usunięta za pomocą enzymów litycznych (np. Zymolyazy), a powstałe sferoblasty mogą zostać zakłócone przez ścinanie, detergenty lub lizę osmotyczną w celu uwolnienia białek. Podejście to zostało z powodzeniem zastosowane jako punkt wyjścia dla wielu frakcjonowań subkomórkowych, ale wymaga długich inkubacji, które nie są zgodne ze stabilnością niektórych białek⁷.

Zastrzeżone odczynniki do lizy drożdży (takie jak detergenty) do chemicznej ekstrakcji białek komórek drożdży są dostępne na rynku, ale skuteczność tych odczynników w ekstrakcji białek i ich wpływ na późniejszą charakterystykę biochemiczną białek nie zawsze jest jasna⁸. Homogenizatory wysokociśnieniowe, często nazywane prasami francuskimi, skutecznie rozbijają komórki drożdży, najpierw poddając je działaniu wysokiego ciśnienia, a następnie wytłaczając przez mały otwór w komorze ciśnieniowej. Technika ta pozwala uzyskać wysokiej jakości ekstrakty, ale sprzęt jest bardzo drogi i może nie być odpowiedni dla małych ilości komórek lub wielu próbek⁹. W związku z tym mechaniczne rozbijanie komórek drożdży w młynie perełkowym jest często metodą z wyboru w przypadku natywnych preparatów białkowych^{drożdży 10}. Technika ta polega na mechanicznym rozbiciu ściany komórkowej drożdży za pomocą mytych kwasem kulek szklanych, co można przeprowadzić za pomocą różnych wytrząsarek, wirowników lub młynów perełkowych. Warto zauważyć, że metoda ta może być stosowana do jednoczesnego przetwarzania wielu mniejszych próbek (1 ml komórek lub mniej). Obecnie na rynku dostępnych jest wiele różnych koralików lub matryc do rozbijania prawie każdego rodzaju komórek w probówkach o pojemności 2 ml. Biorąc pod uwagę inne techniki i sprzęt, młyn perełkowy ma tę dodatkową zaletę, że rozerwanie komórek drożdży następuje bardzo szybko, co pomaga zachować modyfikacje potranslacyjne, takie jak sumoilacja, zwłaszcza gdy stosuje się odpowiednie z inhibitorami proteazy i / lub proteasomów oraz kontrolowana jest temperatura ekstraktów.

Ten protokół skupia się na szybkiej, efektywnej i niezawodnej ekstrakcji endogennych i nadmiernie eksprymowanych białek w łagodnych warunkach, a ostatecznym celem jest zachowanie funkcji białek, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych. Pożywki wzrostowe, kompozycje do lizy komórek i ustawienia młyna perełkowego są zoptymalizowane pod kątem utrzymania interakcji białek i modyfikacji potranslacyjnych, takich jak sumoilacja i ubikwitylacja.

Protocol

Oczyszczanie białek oznaczonych 6xHIS, wyrażonych w pączkujących komórkach drożdży w warunkach natywnych

1. Wzrost komórek drożdży i indukcja ekspresji białek

(zmodyfikowano z ²)

OPCJONALNIE: Użyj logarytmicznie rosnących kultur drożdży wyrażających białko będące przedmiotem zainteresowania zamiast kultur indukowanych galaktozą opisanych poniżej.

1. Przekształć komórki szczepu drożdży Gal⁺ za pomocą plazmidu kodującego wybrane białko znakowane galaktozą 6xHIS. Na przykład zobacz listę odczynników.
2. Zaszczepić transformanty w 5 ml odpowiednich pożywek selektywnych (np. SD-uracyl) zawierających 2% sacharozy. Inkubować w temperaturze 30 °C O/N, obracając się.
3. Rozcieńczyć kulturę O/N tak, aby gęstość optyczna przy 600 nm wynosiła 0,3 (OD₆₀₀ = 0,3) w 33 ml selektywnej pożywki z 2% sacharozą. Rosnąć w temperaturze 30 °C, wytrząsając (Δ150 obr./min).
4. Gdy hodowla osiągnie OD₆₀₀ = 0,8-1,5, wywołaj ekspresję pożądanego białka, dodając 17 ml 3x YEP z 6% galaktozą (przepis w tabeli 1), aby uzyskać końcowe stężenie 1x YEP z 2% galaktozą. Całkowita objętość kultury wynosi teraz 50 ml. Inkubować, wstrząsając, w temperaturze 30 °C przez dodatkowe 5-6 godzin.
   Uwaga: objętość kultury można zmieniać. W kroku 1.3 rozcieńczyć do dwóch trzecich pożądanej objętości końcowej. W kroku 1.4 dodaj jedną trzecią końcowej objętości 3x YEP/6% galaktozy.
5. Zmierzyć OD₆₀₀ indukowanej kultury i odwirować Δ150-200 OD₆₀₀ jednostek komórek przez 5 minut przy 5 000 obr./min w temperaturze 4 °C.
6. Zawiesić osad komórkowy z 1 ml lodowatego lodu, 1x PBS z 1x koktajlem inhibitorów proteazy i przenieść do probówki z zakrętką o pojemności 2 ml.
7. Odwirować komórki przez 1 minutę przy 15 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Dekantacja supernatantu.
8. Zatrzaskowo zamrozić osad komórkowy w ciekłym azocie, a następnie natychmiast poddać go lizie komórek lub przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

2. Homogenizacja komórek drożdży i ekstrakcja białek

1. Do zamrożonego osadu komórkowego z poprzedniego etapu dodać 200 μl szklanych kulek przemytych kwasem i 500 μl lodowatego buforu do lizy (przepis w tabeli 1 lub użyć wybranego buforu do lizy komórek).
2. Na krótko pipetować w górę i w dół. Nie jest wymagane całkowite ponowne zawieszenie osadu ogniwa. Utrzymuj probówki na lodzie przez cały czas.
   Uwaga: Końcówka końcówki pipety może zostać odcięta przed pipetowaniem w górę i w dół.
3. W temperaturze 4 °C umieść probówkę (ryby) z komórkami w młynku do perełek, zrównoważ, zablokuj i uruchom maszynę zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Uruchom ubijak do kulek zawierający rurkę (rurki) na 20 sekund z prędkością 5,5 m/s, a następnie umieść na błotnistym lodzie na 1 minutę. Powtórz w sumie 6 razy.
5. Wyekstrahowane białka należy oczyścić przez odwirowanie przez 15 minut przy prędkości 15 000 obr./min w temperaturze 4 °C. OPCJONALNIE: usunąć drobne cząstki poprzez odwirowanie przez filtr SpinX.
6. Przygotować próbkę ekstraktu z całych komórek (WCE) w celu potwierdzenia obecności białka będącego przedmiotem zainteresowania przez Western Blot:
   1. Dodać WCE odpowiadające 2 OD₆₀₀ jednostek komórek (np. 5 μl oczyszczonego ekstraktu, jeśli zebrano 200 OD₆₀₀ jednostek komórek) do 800 μl 20% kwasu trichlorooctowego (TCA). Wirować do mieszania.
   2. Wirować przez 2,5 minuty przy 15 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant, ale należy uważać, aby zatrzymać osad.
   3. Dodać 800 μl 2% TCA do osadu i przetrząsnąć probówkę, a następnie odwirować przez 2,5 minuty przy 15 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant, ale należy uważać, aby zatrzymać osad.
   4. Dodać 100 μl buforu do próbek TCA (przepis w tabeli 1), odwirować w celu rozpuszczenia osadu. Uwaga: Jeżeli bufor próbki stanie się kwaśny (zmieni kolor na żółty) po dodaniu do osadu, należy dodawać porcje Δ10 μl zasady Tris [1M], aż próbka ponownie zmieni kolor na niebieski.
   5. Inkubować w bloku grzewczym o temperaturze 100 °C przez 2-5 minut.
   6. Ponownie odwiruj, aby całkowicie się rozpuścić, jeśli resztki osadu są nadal obecne. Granulki przygotowane tą metodą są notorycznie trudne do całkowitego rozpuszczenia. Całkowite rozpuszczenie granulek może zająć Δ10 minut wirowania.
   7. Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
7. Resztki pozostałego oczyszczonego WCE należy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

3. Oczyszczanie wsadowe białek z homogenatów komórek drożdży

Uwaga: Ta metoda oczyszczania została zoptymalizowana do oczyszczania białek znakowanych 6xHIS na żywicy o powinowactwie do metalu Co²⁺.

1. Równowaga żywicy
   1. Dla próbki oczyszczonego WCE przygotowanej z Δ20-40 OD₆₀₀ jednostek komórek, dodać 50-100 μl żywicy powinowactwa do probówki mikrowirówkowej. Białka wyekstrahowane z komórek, które nie wykazywały ekspresji pożądanego białka lub niespecyficznej żywicy, takiej jak amyloza, mogą być używane jako kontrola niespecyficznego wiązania.
   2. Przepłukać żywicę 5x 1 ml buforu do płukania: odwrócić od góry do dołu, aż żywica zostanie ponownie zawieszona, a następnie wirować przez 1 minutę z prędkością 5 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
      Uwaga: w przypadku ekstrakcji i oczyszczania tego samego dnia, równoważenie żywicy można przeprowadzić przed ekstrakcją.
2. Wiązanie białek w celu oczyszczenia powinowactwa
   1. Dodać 100-200 μl oczyszczonego lizatu (Δ20-40 OD₆₀₀ jednostek) do 50-100 μl przemytych kulek i doprowadzić całkowitą objętość do 1 ml za pomocą buforu do lizy.
   2. Inkubować z nutacją lub kołysaniem w temperaturze 4 °C przez 2-5 godzin.
   3. Wirować przez 1 minutę z prędkością 5 000 obr./min w temperaturze 4 °C.
   4. W razie potrzeby należy zachować próbkę pozostałego supernatantu do późniejszej analizy niezwiązanych białek. Osad TCA wytrąca się zgodnie z opisem powyżej dla WCE (krok 2.6).
   5. Przemyć żywicę z białkami związanymi 5x 1 ml buforu do płukania, a następnie wirować przez 1 minutę z prędkością 5 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Podczas mycia próbki należy przechowywać w chłodnym miejscu.
3. Elucja związanych białek
   1. Dodać 150 μl buforu elucyjnego do żywicy, nutować w temperaturze 4 °C przez 5 minut, wirować przez 1 minutę przy 5 000 obr./min w temperaturze 4 °C i zachować supernatant w nowej probówce. OPCJONALNIE: Powtórz 2x i elucjacje w puli.
   2. Przygotować eluowaną próbkę do Western blot: Do 25 μl eluowanych białek dodać 25 μl buforu próbki 2x dodecylosiarczanu litu (LDS) z 2 μl β-merkaptoetanolu (BME) i inkubować w bloku grzewczym o temperaturze 100 °C przez 2 min.
      Uwaga: Można również użyć standardowego 2-krotnego bufora do próbek Laemmli.
   3. Szybkie zamrażanie nadmiaru eluowanego białka w ciekłym azocie.
      OPCJONALNIE: usunąć pozostałe białka z żywicy o równej objętości 2x buforu próbki LDS w temperaturze 65 °C przez 5 minut, usunąć białka eluowane LDS do nowej probówki, a następnie dodać 2 μl BME do eluowanych białek, a nie do żywicy. Ta kolejność ma na celu zapobieżenie usunięciu jakichkolwiek jonów lub przeciwciał, które są sprzężone z kulkami.
   4. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
4. Western Blot i sondę z odpowiednimi przeciwciałami w celu wizualizacji białek.
   1. Załadować 10-20 μl (Δ1-3 OD₆₀₀ jednostek) każdej próbki i 3-10 μl drabinki białkowej do wybranego żelu SDS-PAGE. Żele rutynowo stosowane w tym protokole zawierają 4-12% Bis-Tris i 8% Tris-Glycine.
   2. Uruchom żel pod napięciem 200 V przez 50 min.
   3. Przenieść białka z żelu do membrany PVDF przez półsuchy transfer pod napięciem 19 V przez 20-30 minut (przepis w Tabeli 1).
   4. Błona blokowa w 4% mleku/1x Tris buforowana sól fizjologiczna-TWEEN (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C (przepis w tabeli 1).
   5. Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko białku znakowanemu epitopem w 4% mleku/1x TBST przez 1-3 godziny w temperaturze RT lub O/N w temperaturze 4 °C.
   6. Umyj membranę 3x po 5 minut za pomocą 1x TBST.
   7. Inkubować błonę z odpowiednim wtórnym przeciwciałem sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) przez 1-3 godziny w temperaturze pokojowej.
   8. Umyj membranę 3x po 15 min w dużej objętości 1x TBST.
   9. Przykryj membranę podłożem ECL i zawiń w folię saran.
   10. Wystaw błonę na film i rozwiń, aby uwidocznić białka.

Results

Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że opisany protokół bicia koralików i ekstrakcji białek jest przydatny do powtarzalnego przygotowania białek do różnych dalszych zastosowań (podsumowane w Tabeli 2). SDS-PAGE, a następnie barwienie Coomassie WCE pokazują, że szeroki zakres białek (~12 do >250 kDa) można odtwarzalnie ekstrahować z komórek drożdży (Figura 1A). Dyskretne prążki o różnych masach cząsteczkowych wskazują na wysoką jakość ekstraktów białkowych. Jakość ekstraktów można p...

Discussion

Protokół ten koncentruje się na przygotowaniu nienaruszonych, natywnych i zmodyfikowanych potranslacyjnie białek z pączkujących komórek drożdży do dalszych zastosowań. Przed przystąpieniem do stosowania tego protokołu należy ustalić, czy białko będące przedmiotem zainteresowania można łatwo wykryć w ekstraktach białkowych przygotowanych w warunkach denaturacji¹². Jeśli przeciwciała poliklonalne nie są dostępne, korzystne może być oznaczenie epitopem białka będącego przedmiotem zainteresowania, tak aby białko f...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Omni Bead Ruptor 24	Omni International	19-010
Szczep drożdży ORF w BG1805	ThermoScientific	YSC3869	Szczep drożdży GAL+, który może być stosowany do indukcji i ekstrakcji
pYES2.1 Wektor TOPO	Life Technologies	K4150-01	Szczep drożdży GAL+, który może być stosowany do indukcji i ekstrakcji; zawiera jednorazowy koktajl V5/6xHIS
tag Halt Protease Inhibitor ( 100x)	Thermo Scientific	1860932
2,0 ml Probówka z listwą z nakrętką na uwięzi	BioExpress	C-3369-3	Upewnij się, że tubka prawidłowo pasuje do rowka koralików
Koraliki szklane, myte kwasem, 425-600 &mikro; m (sito 30-40 US)	Sigma-Aldrich	G8772
Filtry probówkowe wirówki Corning Costar Spin-X	Sigma-Aldrich	CLS8161	Służy do dodatkowego filtrowania oczyszczonego lizatu
Żywica powinowactwa do metalu TALON	Clontech	635502	Do oczyszczania białek oznaczonych 6xHIS
Bufor do próbek NuPAGE LDS (4x)	Life Technologies	NP0007	Do przygotowania i/lub elucji próbek przed SDS-PAGE i Western Blotting
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Life Technologies	NP0321BOX	Prefabrykowane żele często używane do SDS-PAGE przed Western Blotting
Simply Blue	Life Technologies	#LC6060	Białkowe barwienie żelowe
Bufor do lizy ssaków	Promega	G9381	Alternatywny komercyjny bufor do lizy
Anty-V5 agaroza	Sigma	A7345	Metoda immunoprecypitacji
ECL	Millipore	WBKL S0 050
Membrana PVDF	Milipore	IPVH00010
BIS-TRIS żele	Life Technologies	NP0321BOX
przeciwciało anty-myc	Covance	mms-150R
drugorzędowe	Abcam	ab97040	Kozi pAb do mysiej IgG (HRP)