Artykuł metodologiczny

Analiza wad mięśni szkieletowych u larw danio pręgowanego za pomocą testów dwójłomności i reakcji ucieczki wywołanej dotykiem

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50925

⸱

13 grudnia 2013

 ,  , 
1Division of Genetics and Genomics, Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Danio pręgowany jest teraz sprawdzonym i potężnym narzędziem do modelowania dystrofii mięśniowych, wrodzonych miopatii i pokrewnych chorób nerwowo-mięśniowych. Dwójłomność i zachowanie ucieczki wywołane dotykiem to dwa powszechne nieinwazyjne testy stosowane do określenia stopnia dezorganizacji mięśni i upośledzenia lokomocji zarodków danio pręgowanego we wczesnym okresie rozwoju.

Streszczenie

Danio rerio) danio pręgowany (Danio rerio) stały się szczególnie skutecznym narzędziem do modelowania ludzkich chorób wpływających na mięśnie szkieletowe, w tym dystrofii mięśniowych1-3, wrodzonych miopatii4,5 i zakłóceń w składaniu sarkomerycznym6,7, ze względu na wysoką ochronę genomiczną i strukturalną u ssaków8. Dezorganizację mięśni i upośledzenie lokomocji można szybko ocenić u danio pręgowanego w ciągu pierwszych kilku dni po zapłodnieniu. Dwa testy, które pomagają scharakteryzować defekty mięśni szkieletowych u danio pręgowanego, to dwójłomność (strukturalna) i reakcja ucieczki wywołana dotykiem (behawioralna).

Dwójłomność to fizyczna właściwość, w której światło jest obracane, gdy przechodzi przez uporządkowaną materię, taką jak pseudokrystaliczna tablica mięśniowych sarkomerów9. Jest to proste, nieinwazyjne podejście do oceny integralności mięśni u przezroczystych larw danio pręgowanego na wczesnym etapie rozwoju. Danio pręgowany typu dzikiego z wysoce zorganizowanymi mięśniami szkieletowymi wydaje się bardzo jasny na ciemnym tle, gdy jest wizualizowany między dwoma spolaryzowanymi filtrami światła, podczas gdy mutanty mięśni mają wzorce dwójłomności specyficzne dla pierwotnego zaburzenia mięśniowego, które modelują. Danio pręgowany modelujący dystrofie mięśniowe, choroby charakteryzujące się zwyrodnieniem włókien mięśniowych, po którym następują powtarzające się rundy regeneracji, wykazują zwyrodnieniowe ciemne plamy w mięśniach szkieletowych w spolaryzowanym świetle. Miopatie niedystroficzne nie są związane z martwicą ani zmianami regeneracyjnymi, ale powodują dezorganizację włókien mięśniowych i osłabienie mięśni szkieletowych. Miopatyczne danio pręgowane zazwyczaj wykazują ogólne zmniejszenie dwójłomności, co odzwierciedla dezorganizację sarkomerów.

Test ucieczki wywołany dotykiem polega na obserwacji zachowania embrionu podczas pływania w odpowiedzi na stymulację dotykową10-12. W porównaniu z larwami typu dzikiego, zmutowane larwy często wykazują słaby skurcz ucieczki, po którym następuje powolne pływanie lub inny rodzaj upośledzonego ruchu, który nie jest w stanie wypchnąć larw na większą odległość niż na niewielką odległość12. Zaletą tych testów jest to, że postęp choroby u tego samego typu ryb może być monitorowany in vivo przez kilka dni oraz że duża liczba ryb może być analizowana w krótkim czasie w porównaniu z wyższymi kręgowcami.

Protokół

1. Analiza in vivo struktury mięśni szkieletowych przez dwójłomność

  1. Późnym popołudniem po karmieniu należy przygotować klatki godowe oddzielające samca (samce) od samicy (samic) pożądanej linii (linii) danio pręgowanego.
    1. Odróżniaj samice po ich większym podbrzuszu i lekkim niebiesko-białym ubarwieniu, a samce po smukłym kształcie ciała i różowo-żółtych odcieniach.
    2. Sukces w krzyżowaniu par (jeden samiec i jedna samica) może wynosić tylko około 50%. Aby uzyskać wyższy wskaźnik sukcesu, skryj jednego samca z 2-3 samicami.
  2. Usuń przegrody klatkowe następnego ranka, wkrótce po nadejściu światła i pozwól rybom na tarło bez przeszkód.
  3. Zbierz jaja za pomocą sitka, gdy na dnie zbiornika złożona zostanie wystarczająca liczba zapłodnionych jaj.
  4. Przenieś zarodki na głęboką szalkę Petriego, przepłukując sitko wodą dla ryb i włóż ryby rodzicielskie z powrotem do ich zbiorników. Umieścić szalki z zarodkami w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C.
  5. Usuń niezdolne do życia jaja i resztki później tego samego dnia lub następnego ranka i zwróć zarodki do inkubatora w celu dalszego wzrostu.
  6. Zarodki/larwy osiągają odpowiedni wiek, aby zaobserwować dwójłomność po 3-7 dniach od zapłodnienia (dpf), ponieważ wyniki przed 3 dpf mogą potencjalnie mieć ograniczony kontrast. Zarodki typu dzikiego wykluwają się z kosmówki między 48-60 godzinami po zapłodnieniu (hpf), po których następuje wyprostowanie osi ciała. Późno wykluwające się zarodki typu dzikiego lub zmutowane mogą wymagać ręcznej dechorionacji.
    1. Delikatnie rozerwij kosmówkę ostrymi kleszczami i odwróć ją do góry nogami, aby zarodek wypadł.
    2. Pozwól, aby zarodki z odkorionowaną skórką wyprostowały się przed rozpoczęciem testu.
    3. Znieczulij zarodek (zarodki) trikainą (0,04% w wodzie dla ryb), aby pomóc w ich prawidłowym ułożeniu.
  7. Zamontuj mikroskop preparacyjny z soczewką spolaryzacyjną, którą można obracać w celu regulacji kąta światła spolaryzowanego (Rysunek 1A).
  8. Umieść zdekorionowany, znieczulony zarodek (zarodki) bezpośrednio na drugiej soczewce polaryzacyjnej wzdłuż bocznej osi ciała. Druga soczewka powinna być umieszczona poniżej górnej soczewki, na stoliku mikroskopu (rysunek 1B). Nie należy używać plastikowych szalek Petriego w żadnym momencie podczas próby dwójłomności, ponieważ plastik nie jest odpowiednim medium do transmisji załamanego światła.
  9. Obracaj górną soczewkę tak, aby interesujący Cię zarodek był w zasięgu wzroku, aż osie polaryzacji obu soczewek zostaną zorientowane pod kątem 90° od siebie, a tło będzie całkowicie ciemne.
  10. Optymalna wydajność testu zależy od orientacji ryb między dwiema soczewkami polaryzacyjnymi. Przesuwaj ryby, aby upewnić się, że leżą tak płasko, jak to możliwe.
    1. Jeśli ryba jest zakrzywiona, tylko segmenty o tej płaskiej orientacji przejdą przez spolaryzowane światło i będą wykazywać dwójłomność. W takich przypadkach należy zmierzyć dwójłomność na obszarach płaskich i zarejestrować dwójłomność odpowiedniego obszaru u ryb typu dzikiego (np. somity 1–10 zarówno u ryb typu dzikiego, jak i zmutowanych).
  11. Obserwuj fenotyp dwójłomności ryby.
    1. Ryby typu dzikiego z wysoce zorganizowanymi mięśniami szkieletowymi wykazują jasną dwójłomność, ponieważ współczynnik załamania światła dla światła równoległego do miofilamentów jest wyższy niż światło spolaryzowane prostopadłe do tych struktur.
    2. Ryby ze zdezorganizowanymi mięśniami szkieletowymi sugerującymi miopatię niezwyrodnieniową lub wadę rozwojową zazwyczaj wykazują ogólne zmniejszenie dwójłomności.
    3. Ryby ze zdezorganizowanymi mięśniami szkieletowymi charakterystycznymi dla dystrofii mięśniowej często wykazują łatkowaty wzór dwójłomności, z ciemnymi obszarami reprezentującymi zwyrodnienie mięśni wśród jasnych obszarów normalnej architektury mięśni.
  12. Określ ilościowo dwójłomność, robiąc zdjęcia dzikich i zmutowanych ryb w świetle spolaryzowanym przy tych samych ustawieniach ekspozycji i powiększeniu. Zapisuj obrazy jako pliki .tiff.
    1. Otwórz obrazy dwójłomności w oprogramowaniu ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
    2. Dla każdego obrazu wybierz obszar mięśnia danio pręgowanego, rysując linię wokół ciała za pomocą opcji "Wielokątne zaznaczenia" na pasku narzędzi.
    3. Użyj opcji "Ustaw pomiary" w menu rozwijanym "Analizuj", aby wybrać wymagane statystyki dla obrazu.
      1. Minimalny wybór wymaga, aby pola "Obszar", "Średnia wartość szarości" i "Min i maksymalna wartość szarości" były zaznaczone.
      2. Maksymalna wartość szarości >255 będzie wskazywać na nasycenie pikseli. Dlatego należy używać obrazów o maksymalnych wartościach szarości mniejszych niż 255.
    4. Znormalizuj średnią intensywność z wybranym obszarem i powtórz tę samą procedurę kwantyfikacji dla każdego obrazu dwójłomności.

2. Test zachowań ucieczki wywołany dotykiem

  1. Ustaw pary godowe odpowiednich linii (linii) danio pręgowanego i zbierz zarodki zgodnie z powyższym opisem w krokach 1.1–1.5.
  2. Po 2-7 dniach od zapłodnienia należy umieścić zdechorionowane zarodki/larwy pojedynczo na głębokiej szalce Petriego lub w komorach z płytkami wielodołkowymi.
  3. Pracując tylko z jednym zarodkiem na raz, wyśrodkuj zarodek w polu view mikroskopu stereoskopowego Nikon SMZ1500 z systemem aparatu cyfrowego SPOT RT3 lub podobnym i rozpocznij obrazowanie sekwencyjne.
    1. Taką samą częstotliwość obrazowania należy stosować zarówno w przypadku ryb typu dzikiego, jak i zmutowanych. Zalecana jest częstotliwość odświeżania >30 Hz, ponieważ wolniejsze częstotliwości zazwyczaj nie wystarczą, aby uchwycić szybkie pływanie dzikich ryb.
  4. Dostarczaj bodźce mechanosensoryczne do zarodka, dotykając ogona szpilką do owadów.
  5. Przerwij obrazowanie, gdy zarodek przestał pływać lub wypłynął poza pole widzenia.
  6. Konwertuj sekwencyjne obrazy na plik wideo lub analizuj pojedyncze klatki obrazów poklatkowych w trybie off-line, korzystając z oprogramowania SPOT 5.1 Advanced. Podobne pakiety oprogramowania obejmują Open Lab, NIS Elements lub ogólnodostępny ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
  7. Określ ilościowo zachowanie podczas pływania, wykonując reakcję wywołaną dotykiem w wielu zarodkach.
    1. Można to osiągnąć, uśredniając odległość, jaką zarodki są w stanie przepłynąć w ustalonym przedziale czasu, za pomocą oprogramowania lub linijki metrycznej do oznaczania punktów początkowych i końcowych zawodów pływackich.
    2. Unikaj przyzwyczajania się zarodków do bodźca dotykowego z upływem czasu, wykonując test z nowym zarodkiem dla każdego powtórzenia eksperymentalnego. Zachowania w modelach dzikich i wiarygodnych mutantów są zwykle wysoce powtarzalne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dwójłomność może służyć jako wydajny, nieinwazyjny test pozwalający ocenić stan organizacji miofibrylarnej w żywych embrionach danio pręgowanego. Przedstawiono przykłady ryb danio pręgowanego typu dzikiego, a także osobników z obniżoną ekspresją genów kluczowych dla rozwoju i funkcji mięśni szkieletowych. Ryby danio pręgowanego typu dzikiego w 5 dpf wykazują silną dwójłomność mięśni szkieletowych w świetle spolaryzowanym, co wynika z uporządkowanego układu miofilamentów (Figures 2A-B). W przeciwieństwie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pierwotne zaburzenia nerwowo-mięśniowe są tradycyjnie klasyfikowane jako procesy dystroficzne lub niedystroficzne. Dystrofie mięśniowe charakteryzują się zwyrodnieniem włókien mięśniowych, po którym następują powtarzające się rundy regeneracji, co ostatecznie prowadzi do procesu końcowego etapu typowego dla zwłóknienia i zastąpienia przez tkankę tłuszczową14. Natomiast miopatie niedystroficzne nie są związane z martwicą lub zmianami regeneracyjnymi, ale powodują zdezorganizowane włókna mięśniowe i ogólne osłab...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Behzadowi Moghadaszadehowi za jego wspaniałą pomoc w kwantyfikacji obrazów dwójłomności. Praca ta została sfinansowana przez Muscular Dystrophy Association USA (MDA201302) oraz National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01 AR044345), a także hojne wsparcie od A Foundation Building Strength, Cure CMD i AUism Charitable Foundation. VAG jest wspierany przez K01 AR062601 z National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, a LLS jest wspierany przez F31 NS081928 z National Institute of Neurological Disorders and Stroke.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tricaine SigmaA5040
Szalki PetriegoFischer Scientific0875711Z
KleszczeFischer Scientific100189-588
Szpilka do owadówFischer ScientificS67375
Soczewki polaryzacyjne KameraRitz Quantaray Tristar Optics C-PL 72mm
InkubatorFischer Naukowyinkubator izotemperaturowy model mikroskopu 630D
firmy Nikon Instruments Inc.Przyrządy diagnostyczne do kamer SMZ 1500
Inc.Oprogramowanie do obrazowania SPOT RT3
Diagnostic Instruments Inc.SPOT 5.1 Zaawansowany

Bibliografia

  1. Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
  2. Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
  3. Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (17), 7092-7097 (2007).
  4. Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5 (2), e1000372(2009).
  5. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
  6. Ferrante, M. I., Kiff, R. M., Goulding, D. A., Stemple, D. L. Troponin T is essential for sarcomere assembly in zebrafish skeletal muscle. J. Cell Sci. 124 (4), 565-577 (2011).
  7. Hawkins, T. A., et al. The ATPase-dependent chaperoning activity of Hsp90a regulates thick filament formation and integration during skeletal muscle myofibrillogenesis. Development. 135 (6), 1147-1156 (2008).
  8. Barbazuk, W. B., et al. The syntenic relationship of the zebrafish and human genomes. Genome Res. 10 (9), 1351-1358 (2000).
  9. Schapira, G., Dreyfus, J. C., Joly, M. Changes in the flow birefringence of myosin as a result of muscular atrophy. Nature. 170 (4325), 494-495 (1952).
  10. Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. The development and behavioral characteristics of the startle response in zebrafish. Dev. Psychobiol. 7, 47-60 (1974).
  11. Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The Mauthner-initiated startle response in teleost fish. J. Exp. Biol. 66, 65-81 (1977).
  12. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
  13. Hirata, H., et al. Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease. Development. 134 (15), 2771-2781 (2007).
  14. Wallace, G. Q., McNally, E. M. Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies. Annu. Rev. Physiol. 71, 37-57 (2009).
  15. Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
  16. Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (4), 785-788 (2012).
  17. Low, S. E., et al. TRPM7 is required within zebrafish sensory neurons for the activation of touch-evoked escape behaviors. J. Neurosci. 31 (32), 11633-11644 (2011).
  18. Liu, D. W., Westerfield, M. Function of identified motoneurones and co-ordination of primary and secondary motor systems during zebrafish swimming. J. Physiol. 403, 73-89 (1988).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Larwy zebrafishtest dw j omno ciucieczka wywo ana dotykiemanaliza struktury mi nimikroskopia w wietle spolaryzowanymilo ciowe okre lanie integralno ci mi nipomiar reakcji ucieczkowejmonitorowanie in vivowysokoprzepustowy screening

Powiązane artykuły