Artykuł metodologiczny

Ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg

DOI:

10.3791/50934

⸱

12 listopada 2013

 , 
1Australian Centre for Blood Diseases, Monash University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stworzenie ludzkich modeli bariery krew-mózg (BBB) może przynieść korzyści badaniom nad chorobami mózgu związanymi z niewydolnością bariery krew-mózg. Opisujemy tutaj ulepszoną technikę przygotowania kontaktowego modelu BBB, która umożliwia kokulturację ludzkich astrocytów i komórek śródbłonka mózgu po przeciwnych stronach porowatej błony.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bariera krew-mózg (BBB) składa się z nieprzepuszczalnych, ale elastycznych naczyń włosowatych mózgu, które ściśle kontrolują środowisko mózgu. Niepowodzenie bariery krew-mózg zostało zasugerowane w etiologii wielu patologii mózgu, co stwarza potrzebę opracowania ludzkich modeli BBB in vitro, aby pomóc w klinicznie istotnych badaniach. Wśród licznych opisanych do tej pory modeli BBB, statyczny (bez przepływu), kontaktowy model BBB, w którym astrocyty i komórki śródbłonka mózgu (BEC) są hodowane po przeciwnych stronach porowatej błony, wyłonił się jako uproszczony, ale autentyczny system symulujący barierę krew-mózg z wysoką przepustowością badań przesiewowych. Niemniej jednak wygenerowanie takiego modelu wiąże się z niewielkimi wyzwaniami technicznymi. W tym miejscu opisujemy protokół przygotowania kontaktowego modelu ludzkiego BBB wykorzystującego nowatorską kombinację pierwotnych ludzkich BEC i unieśmiertelnionych ludzkich astrocytów. W szczególności szczegółowo opisujemy innowacyjną metodę wysiewu komórek na odwróconych wkładkach, a także określamy techniki barwienia wkładek i pokazujemy, w jaki sposób wykorzystujemy nasz model do badań związanych z BBB.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BBB to wyspecjalizowany interfejs między obwodowym krążeniem krwi a ośrodkowym układem nerwowym, odpowiedzialny za utrzymanie hemostazy mózgu. Składa się z odrębnych komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BEC), na które funkcjonalnie wpływa kilka składników komórkowych i bezkomórkowych (poniżej), tworząc ciasną i dynamiczną bramę do mózgu. W warunkach fizjologicznych bariera krew-mózg ogranicza przepływ komórek krwi, składników osocza i substancji szkodliwych, potencjalnie neurotoksycznych, do mózgu. Równolegle BBB selektywnie wymienia kluczowe jony i składniki odżywcze (glukozę i aminokwasy) oraz produkty przemiany materii między mózgiem a krążeniem, aby precyzyjnie utrzymać środowisko mózgowe1,2. W ostatnich latach staje się oczywiste, że niewydolność bariery krew-mózg występuje w różnych przewlekłych patologiach mózgu, takich jak choroby neurodegeneracyjne lub związane ze stanami zapalnymi (np. odpowiednio choroba Alzheimera i stwardnienie rozsiane)3, a także w stanach ostrych, takich jak udar niedokrwienny4.

Unikalne właściwości BBB komórek śródbłonka mózgu (BEC) są w dużej mierze indukowane przez ich środowisko mózgowe5, a w szczególności przez astrocyty6,7. Coraz powszechniejsze staje się zrozumienie, że inne typy komórek, takie jak perycyty8, neurony i mikroglej1,3, a także błona podstawna9, wspierają BEC i tworzą razem jednostkę funkcjonalną zwaną "jednostką nerwowo-naczyniową" (NVU), która jednocześnie łączy neuronalne zapotrzebowanie metaboliczne z ich naczyniami włosowatymi10.

Udział BBB w sytuacjach patologicznych leży u podstaw licznych prób opracowania in vitro modeli BBB, które mają pomóc w badaniach związanych z BBB11,12. Modele te mają na celu jak najwierniejsze naśladowanie charakterystyki BBB in vivo zgodnie z zasadą NVU. Metody in vitro Modele BBB na ogół opierają się na monowarstwie BEC tworzących ścisłe połączenia (głównie pochodzące od bydła13, człowieka14, szczura15, myszy16 i świni17,18), hodowanych na porowatej błonie wraz z podporowymi astrocytami (szeroko analizowane przez Deli i in. 200511).

Astrocyty mogą być hodowane w warunkach bezkontaktowych na dnie dobrze hodowanej tkanki, oddzielone od BEC (hodowanych na górnej powierzchni błony) przez pożywkę hodowlaną, ale komunikujące się z BEC za pomocą rozpuszczalnych czynników16. W bardziej zaawansowanych modelach, które lepiej przypominają strukturę anatomiczną BBB in vivo, astrocyty są utrzymywane w warunkach kontaktowych i hodowane bezpośrednio po przeciwnej stronie błony w bliskiej odległości od BECs13,15,17 (ryc. 1). Ta konfiguracja umożliwia fizyczny kontakt między BEC a astrocytami, nawiązywany, gdy astrocyty projektują swoje procesy przez porowatą błonę. Co ważne, aby doszło do prawdziwego kontaktu, pory powinny mieć średnicę ≥1 μm, ponieważ astrocyty nie mogą przechodzić przez pory o mniejszych rozmiarach (tj. 0,4 μm)14,15. Warto zauważyć, że w niektórych badaniach wykazano, że kontaktowe systemy BBB są lepsze od ich bezkontaktowych odpowiedników pod względem wartości trans-śródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) i przepuszczalności śródbłonka różnych znaczników13,17,18. Dodatkowy wymiar przepływu pożywki został niedawno dodany w wielu modelach BBB in vitro w celu przyłożenia sił ścinających do śródbłonka w celu dokładniejszej symulacji układu naczyniowego mózgu12,19.

Jedną z przeszkód technicznych do pokonania podczas generowania kontaktowego modelu BBB jest umieszczanie astrocytów wbrew grawitacji na powierzchni abluminalnej porowatej błony. Poprzednie protokoły13,20, w których astrocyty były po prostu wysiewane w kropli pożywki na wierzchu odwróconej wkładki, pozwalały tylko na krótkie czasy wysiewu (tj. 10 min13 lub 2 godz.20), które w naszych rękach okazały się niewystarczające do prawidłowego przyłączenia komórek. Stosując tę podstawową metodę, dłuższy okres przyłączania astrocytów wymaga stałego monitorowania wkładek poprzez częste otwieranie inkubatora (powodując wahania temperatury, pH i wilgotności), a także jest podatny na nierównomierne wysiewanie komórek z powodu wycieku pożywki przez pory, zwłaszcza jeśli stosowane są pory większe niż 1 μm.

Tutaj opisujemy ogólny protokół przygotowania kontaktowego modelu BBB. Nasza procedura obejmuje alternatywną metodę wysiewu komórek na odwróconych wkładach, która rozwiązuje wyżej wymienione ograniczenia. Metoda ta pozwala na niezakłócone przyleganie astrocytów do powierzchni błony brzusznej w inkubatorze w równowadze przez dłuższy czas. W rezultacie uzyskuje się równomierne wysiewanie astrocytów, co zwiększa jakość bariery i minimalizuje różnice w przepuszczalności podstawy między insertami.

Ponieważ wykorzystanie ludzkich komórek jest ważne dla badań istotnych dla ludzi21, dodatkowo pokazujemy w tym artykule konkretne zastosowanie nowej kombinacji pierwotnych ludzkich BEC i unieśmiertelnionych ludzkich astrocytów do stworzenia kontaktowego modelu ludzkiej bariery krew-mózg o wysokiej przepustowości badań przesiewowych. Ponieważ oglądanie komórek na porowatych błonach może być trudne, szczegółowo opisujemy również techniki barwienia, które mogą pomóc w określeniu konfluencji i morfologii komórek na porowatych błonach. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób nasz ludzki model BBB może być wykorzystany do zbadania wpływu tkankowego aktywatora plazminogenu (t-PA) - enzymu rozbijającego skrzepy, który służy jako jedyna opcja leczenia ostrego udaru niedokrwiennego - na BBB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa (3-7 dni przed montażem BBB)

1.1. Pierwotne komórki śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu (BECs)

BECs zostały uzyskane komercyjnie. Komórki zostały wytworzone w wyniku dysocjacji normalnej tkanki ludzkiej kory mózgowej i zostały zamrożone w pasażu 3 (<12 podwojenia populacji).

  1. Podłoże: Pokryj naczynia do hodowli tkankowej "Czynnikiem przywiązania" zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Utrzymanie komórek: Utrzymuj BEC w kompletnym pożywce zawierającej surowicę. W celach eksperymentalnych posaz BEC w kompletnym pożywce wolnej od surowicy. Utrzymuj komórki w nawilżonym inkubatorze 5%CO2, 21%O2 w temperaturze 37 °C
    Uwaga: Jako alternatywa dla specjalistycznych odczynników, 0,1% (w/v) roztwór żelatyny może służyć jako odczynnik powlekający, podczas gdy DMEM/F-12 uzupełniony 15 mM HEPES, 10% (v/v) płodową surowicę cielęcą (FCS), 2 mM L-glutaminy, 50 μg/ml gentamycyny, 20 μg/ml heparyny i 20 μg/ml suplementu wzrostu komórek śródbłonka może być stosowany do utrzymania BEC.
  3. Podkultura do eksperymentów: Podziel zlewające się BEC w stosunku 1:3 do 1:6, w zależności od zamierzonego czasu na następne użycie (3-7 dni). Zmieniaj podłoże konserwacyjne co 3 dni. Używaj BEC do 15 fragmentów.

1.2. SVG Ludzka linia komórkowa astrogleju płodu

SVG ludzkie płodowe komórki astroglejowe22 pierwotnie pochodziły z pierwotnych kultur ludzkiego mózgu płodu przekształconego za pomocą małpiego wirusa z niedoborem replikacji 40.

  1. Utrzymanie: Hodowla komórek SVG w minimalnej ilości niezbędnej pożywki ze zrównoważonym roztworem soli Earle'a uzupełnionym 20% (v/v) FCS (ten sam procent surowicy, który jest używany do utrzymania ich rodzicielskich komórek pierwotnych 22), 2 mM L-glutaminy, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny. Utrzymuj komórki w nawilżonym inkubatorze 5% CO2 i 21% O2 w temperaturze 37 °C.
  2. Podkultura do eksperymentów: Podziel zlewające się SVG w stosunku 1:5 do 1:10, w zależności od zamierzonego czasu na następne użycie (3-7 dni). Usunięcie trypsyny nie jest wymagane ze względu na dużą zawartość surowicy w pożywce. Zmieniaj podłoże co 3 dni. Używaj plików SVG do 20 fragmentów.

2. Montaż i hodowla ludzkiego modelu BBB in vitro (Dzień 0)

Komentarz: Model ludzkiego kontaktu z BBB in vitro jest przygotowany zgodnie z opublikowanymi protokołami 13,23, z modyfikacjami.

2.1. Powlekanie wkładek

  1. Umieść wkładki do hodowli tkankowych (o średnicy 6,5 mm z porowatą membraną poliestrową, wielkość porów 3 μm) w dołkach dostarczonej płytki 24-dołkowej. Powierzchnię świecącą wkładek pokryć przez noc w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C kolagenem szczurzym I (20 μg/cm2; 50 μl 132 μg/ml kolagenu I w 0,02% kwasie octowym w wodzie Milli-Q (MQH2O)). Umyj wkładki raz (zarówno od strony abluminalnej, jak i luminalnej) za pomocą MQH2O, aby usunąć resztki kwasu.
    nuta: Błona podstawna naczyń włosowatych mózgu nie zawiera kolagenu I, ale głównie lamininy, izoformy kolagenu typu IV, nidogeny i proteoglikany siarczanu heparanu9. Z tego powodu niektórzy badacze stosują środki powlekające, takie jak kolagen IV, fibronektyna13 lub Matrigel (BD biosciences)16, aby uzyskać bardziej autentyczne modelowanie BBB.

2.2. Wysiewanie SVG na spodniej (abluminalnej) powierzchni membrany

  1. Odwróć wkładkę i delikatnie dopasuj do krawędzi porowatej membrany krótki kawałek elastycznej rurki silikonowej ("rurka zewnętrzna"; ~10 mm długości, 8 mm średnicy wewnętrznej, 1,6 mm ścianki), tworząc zasadniczo nową studnię nad powierzchnią abluminalną (rysunek 2A).
  2. Spód wkładki musi być uszczelniony, aby uniknąć wycieku mediów. Najpierw przygotuj korek (Rysunek 2A i 2B) wykonany z rurki silikonowej (określanej jako "rurka wewnętrzna"; ~8 mm długości, 3,2 mm średnicy wewnętrznej, 1,6 mm ścianki; Rysunek 2B), zapieczętowany na jednym end with plastic sealing cane (~3mm długości; przygotowany przez przecięcie dna probówki z 0,2 ml polimerazy chain reaction (PCR); Rysunek 2B). Stożek ten nie tylko uszczelnia wewnętrzny prześwit rurki, ale także poszerza jego krawędź, aby zapewnić ściślejsze dopasowanie do wkładu. Następnie, za pomocą sterylnych kleszczyków, włóż silikonową zatyczkę do wnęki luminalnej i przesuwaj ją, aż dotrze do ~1-2 mm od membrany (Rysunek 2A).
  3. Następnie wysiewaj 4 x 104 komórki SVG w 200 μl pożywki konserwacyjnej SVG (sekcja 1.2.2 powyżej) bezpośrednio do silikonu znacznie powyżej powierzchni membrany abluminalnej (rysunek 2A). Pozwól plikom SVG przylegać w inkubatorze przez co najmniej 4 godziny.
    nuta: Aby zachować sterylność, należy transportować zmontowane wkładki pomiędzy dwiema płytkami 6-dołkowymi (jedna płytka odwrócona nad drugą; Rysunek 2C) aby zminimalizować narażenie na niefiltrowane powietrze podczas zabiegu. Silikonowe rurki i zatyczki są myte w etanolu i sterylizowane w autoklawie do późniejszego użycia.
    nuta: Zatyczki (sekcja 2.2.2) należy stosować tylko w przypadku wkładek, których wielkość porów membrany jest większa niż 1 μm. Membrany o średnicy porów ≤1 μm rzadko przeciekają i wymagają jedynie zamontowania zewnętrznej rurki silikonowej (sekcja 2.2.1). Ponadto niektóre środki powlekające inne niż kolagen I (patrz uwaga do sekcji 2.1) mogą zapobiegać nieszczelności nawet przez pory o wielkości 3 μm. Określ to empirycznie.
  4. Aby monitorować stan przylegania astrocytów, wysiewaj równolegle do standardowej 96-dołkowej identyczną objętość zawiesiny komórek astrocytów. Studzienka ta ma taką samą powierzchnię jak wkładka 6,5 mm (0,33cm2) i umożliwia łatwiejszą wizualizację komórek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym niż membrana wkładu. Kiedy zaobserwujesz wystarczające przyleganie astrocytu w 96-dołku kontrolnym, astrocyty odpowiednio przylegają również do błony wstawki.
  5. Gdy astrocyty wystarczająco przylegają do 96-dołkowej grupy kontrolnej, przenieś zespoły wkładek do kaptura do hodowli tkankowej (patrz uwaga powyżej) i delikatnie wyjmij zewnętrzne silikonowe rurki i zatyczki. Włożyć wkładki do normalnej (tj. pionowej) orientacji do dostarczonych studzienek zawierających 800 μl/studzienkę pożywki konserwacyjnej BEC (sekcja 1.1.2 powyżej).

2.3. Wprowadzanie BEC do Komory Luminalnej nad Astrocytami

Wysiej 2x104 BEC w 200 μl na pokrytą kolagenem powierzchnię luminalną i włóż wkładki do inkubatora.

2.4. Hodowla

Kokultura osadzona w SVG/BEC wstawia się przez 3 dni w pożywce BEC bez zmiany podłoża przed eksperymentem.

3. Eksperymenty z ludzkim modelem BBB (Dzień 3)

  1. Aby stymulować BBB in vitro, najpierw przepłucz komórki, zastępując pożywkę abluminalną i luminalną odpowiednio 600 μl i 100 μl pożywki BECs bez surowicy.
  2. Ponownie odessać pożywkę luminalną i zastąpić 100 μl pożywki bez surowicy ze środkami stymulującymi.
    nuta: Jeśli wymagana jest stymulacja komory abluminalnej (w celu aktywacji BBB in vitro z przedziału astrocytowego), należy odessać pożywkę abluminalną i zastąpić 600 ul wolnej pożywki surowicy środkami stymulującymi.
  3. Przetestuj każdą grupę eksperymentalną w trzech egzemplarzach (stąd, jeśli przeprowadzana jest stymulacja światłem, która wymaga 3 x 100 μl, zalecamy rozcieńczenie odczynników do ich końcowych stężeń w 350 μl pożywki wolnej od surowicy na grupę, aby zminimalizować błędy pipetowania między studzienkami).
  4. Wykonaj standardowe testy przepuszczalności parakomórkowej i/lub transkomórkowej znakowanych znaczników 16,24 (w przypadku tych ostatnich używamy albuminy sprzężonej z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)) i/lub pomiar TEER 13,16,25, jak opisano wcześniej.

Aby uwzględnić wahania w podstawowej przepuszczalności między eksperymentami, przeanalizuj zmiany przepuszczalności w stosunku do powlekanej wkładki bez komórek (która służy jako odniesienie dla maksymalnej przepuszczalności) i do grupy traktowanej nośnikiem, używając wzoru: przepuszczalność (% maks.) = (wartość przepuszczalności wkładki eksperymentalnej - średnia wartość przepuszczalności grupy nośników) / (wartość przepuszczalności ślepej wkładki - średnia wartość przepuszczalności grupy nośników) X 100.

4. Wizualizacja komórek na porowatych błonach

Komentarz: Niebarwione komórki na błonach wstawianych są trudne do zaobserwowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego lub kontrastu interferencji różnicowej (DIC), ponieważ membrana jest dość nieprzezroczysta i zakłóca transmisję światła. Aby poradzić sobie z tym problemem, opracowaliśmy różne procedury barwienia komórek na wkładkach, które znacznie poprawiają wygląd komórek na błonie. Ogólnie rzecz biorąc, membrany wkładek należy zabarwić, gdy są nadal przymocowane do wkładu, w studzienkach. Membrany należy usunąć dopiero po zakończeniu procedury barwienia w celach montażowych.

4.1. Barwienie hematoksyliny

  1. Utrwalić wkładki lodowatym 4% (w/v) paraformaldehydem (PFA) w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS; 130 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 10 mM NaH2PO4, pH 7,2) przez 20 min. Umyć raz w PBS.
  2. Zanurz wkładkę w 0,1% roztworze hematoksyliny Mayera na 2 minuty.
  3. Delikatnie umyć wkład wodą z kranu (zanurzając go w zlewce z wodą z kranu i delikatnie odpipetując nadmiar wody). Przenieś wkładkę do roztworu wody z kranu Scotta (2 g/L NaHCO3, 20 g/L MgSO4) na ~20 sekund, aż pojawi się pożądany niebieski kolor. Ponownie umyć wkładkę wodą z kranu (rozdział 4.1.3). Opcjonalnie można tutaj wprowadzić barwnik eozyny, zanurzając wkładkę w 1% roztworze eozyny na 10 sekund, a następnie myjąc ją wodą z kranu.
  4. Wysuszyć membranę wkładu na powietrzu. Za pomocą skalpela (nacinając wokół krawędzi membrany) usuń membranę i zamontuj ją na szkiełku podstawowym do obrazowania w jasnym polu
    nuta: Jeśli stosowane jest medium montażowe di-N-butyloftalaninksylenu (DPX), przed zdjęciem i montażem membrany należy umyć wkładkę 100% etanolem, a następnie ksylenem.

4.2. Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)

  1. Utrwal wkładki lodowatym 4% (w/v) PFA w PBS przez 20 minut. Umyj trzy razy w PBS.
  2. Utrwal membrany przez 30 minut w 1% (w/v) tetratlenku osmu w MQH2O.
  3. Umyć wkładki w wodzie (sekcja 4.1.3) i odwodnić w rosnącym gradiencie etanolu (50%, 70%, 90% przez 5 minut każde, a następnie 3x ze 100% etanolem przez 10 minut na interwał).
  4. Odwodnione wkładki należy traktować mieszaniną heksametylodylazanu: etanolu (1:2, a następnie 2:1 przez 5 minut).
  5. Wkładki należy traktować 100% HMDS przez 5 minut, wysuszyć na powietrzu i przechowywać w suchych warunkach.
  6. Usuń membranę za pomocą skalpela (nacinając wokół krawędzi membrany). Zbadaj membrany za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.

4.3. Immunofluorescencja

  1. Utrwalić wkładki lodowatym 4% (w/v) PFA w PBS przez 20 minut, przemyć raz w soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS; 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 154 mM NaCl, 0,22 μm przefiltrowane).
  2. Wykonaj barwienie immunologiczne komórek na błonie wstawki, jak opisano wcześniej26.
  3. Usuń membranę za pomocą skalpela (nacinając wokół krawędzi membrany) i zamontuj ją na szkiełku podstawowym z fluorescencyjnym medium montażowym. Zbadaj membranę za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby stworzyć ludzki, kontaktowy model BBB, musieliśmy hodować SVG i BEC na porowatych błonach o wielkości porów 3 μm, co do których wykazano, że umożliwiają przejście stóp końcowych astrocytów w celu kontaktu z komórkami śródbłonka14,15,27,28. Schematyczne przedstawienie kompletnego modelu styku przedstawiono na rysunku 1 (ilustracja po lewej). Głównym wyzwaniem technicznym, jakim jest system kontaktowy, jest konieczność zasiewania astrocytów wbrew grawitacji na abluminalnej powierzchni błony....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania medyczne nad patologiami mózgu napotykają na wiele trudności translacyjnych. Na przykład w dziedzinie ostrego udaru niedokrwiennego mózgu wiele leków, które okazały się bardzo obiecujące w modelach zwierzęcych, zawiodło w klinice38,39. Przyczyny tych rozczarowujących wyników są różne i obejmują niewierność przedklinicznych systemów testowych scenariuszowi udaru mózgu u ludzi oraz zawyżenie wyników uzyskanych w badaniach na zwierzętach21. Jedną ze strategii mających na celu poprawę wartości p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane z grantów przyznanych R.L.M. przez National Health and Medical Research Council of Australia (grant # 606658).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Czynnik przyłączeniaCell-Systems Corporation4Z0-210
Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mózgu (BEC), pierwotne, ludzkieCell-Systems CorporationACBRI 376
Kompletne podłożeCell-Systems Corporation4Z0-500Uzupełnione CSC JetFuel
Kompletne podłoże bez surowicyCell-Systems CorporationSF-4Z0-500Uzupełniony o CSC RocketFue
DMEM/F-12 z 15 mM HEPESLife Technologies11330-032
Suplement na wzrost komórek śródbłonka (pochodzenia bydlęcego)Sigma-AldrichE2759-15MG
Zewnętrzna rurka silikonowaWatson-Marlow913.A080.016Marka Pumpsil, średnica wewnętrzna 8 mm, ścianka 1,6 mm
Surowica dla cieląt płodowychLonza14-501F
Siarczan gentamycynyLife Technologies15750-060
Heparyna sodowaPfizer1,000 U/ml
Heksametylodilazan (HMDS)Sigma-AldrichH4875
Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózguCell-Systems CorporationACBRI 376
Wewnętrzna rurkasilikonowa Watson-Marlow913.A032.016Marka Pumpsil, średnica wewnętrzna 3,2 mm, ścianka 1,6 mm
L-GlutamineLife Technologies25030
Mayer' s roztwór hematoksylinyAmber ScientificMH
Minimalna niezbędna pożywka z Earle' s zrównoważony roztwór soliHyClone LaboratoriesSH30244.01
Penicylina/StreptomycynaLife Technologies15140
Kolagen szczurzy ITrevigen3440-100-01Marka Cultrex
Wkładki do hodowli tkankowychCorning Life Sciences3472Marka Transwell, o średnicy 6,5 mm, z porowatą membraną poliestrową, 3 i mikro; m Wielkość porów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol. Dis. 37, 13-25 (2010).
  3. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  4. Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).
  5. Stewart, P. A., Wiley, M. J. Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras. Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).
  6. Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, 253-257 (1987).
  7. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  8. Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).
  9. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).
  10. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).
  11. Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).
  12. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).
  13. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).
  14. Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells. Brain Res. 625, 238-243 (1993).
  15. Demeuse, P., et al. Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier. J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).
  16. Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).
  17. Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  18. Kroll, S., et al. Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).
  19. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).
  20. Li, G., et al. Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies. Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).
  21. Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation. Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).
  22. Major, E. O., et al. Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).
  23. Eugenin, E. A., Berman, J. W. Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier. Methods. 29, 351-361 (2003).
  24. Dehouck, M. P., et al. Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models. J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).
  25. Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
  26. Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin. Brain Res. 1381, 38-51 (2011).
  27. Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane. Lab Chip. 5, 74-85 (2005).
  28. Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes. Blood. , (2012).
  29. Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).
  30. Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nat. Med. 14, 731-737 (2008).
  31. Yepes, M., et al. Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein. J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).
  32. Abu Fanne, R., et al. Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity. Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).
  33. Wang, X., et al. Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator. Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).
  34. Wang, X., et al. Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke. Stroke. 35, 2726-2730 (2004).
  35. Donnan, G. A., et al. How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke. Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).
  36. Acheampong, P., Ford, G. A. Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).
  37. Derex, L., Nighoghossian, N. Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).
  38. Garber, K. Stroke treatment--light at the end of the tunnel. Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).
  39. Liebeskind, D. S. Reversing Stroke in the 2010s. Stroke. 40, 3156-3158 (2009).
  40. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  41. Song, L., Pachter, J. S. Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).
  42. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Blood Brain Barrier ModelEndothelial Cell CultureAstrocyte Co culturePorous Membrane InsertCollagen CoatingFluorescent Tracer AssayTransendothelial Electrical ResistanceGlial Fibrillary Acidic ProteinVon Willebrand FactorTPA Permeability Study

Powiązane artykuły