Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy

DOI:

10.3791/50935

⸱

23 listopada 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Neuroscience and Muscle Research, The Kids Research Institute at the Children's Hospital at Westmead, The University of Sydney, 2Flow Cytometry Centre, Westmead Millennium Institute for Medical Research

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach testy oparte na żywych komórkach były z powodzeniem wykorzystywane do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym i konformacyjnym. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą wysokoprzepustową cytometrię przepływową, umożliwiającą analizę dużych kohort pacjentów. Wykrycie nowych przeciwciał poprawi diagnostykę i leczenie zaburzeń o podłożu immunologicznym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach przeciwciała przeciwko białkom powierzchniowym i konformacyjnym zaangażowanym w neurotransmisję zostały wykryte w autoimmunologicznych chorobach OUN u dzieci i dorosłych. Przeciwciała te zostały wykorzystane do kierowania diagnozą i leczeniem. Testy komórkowe poprawiły wykrywanie przeciwciał w surowicy pacjenta. Opierają się one na powierzchniowej ekspresji antygenów mózgowych na komórkach eukariotycznych, które są następnie inkubowane z rozcieńczoną surowicą pacjenta, a następnie z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluorochromem. Po przemyciu wtórne wiązanie przeciwciał jest następnie analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Nasza grupa opracowała wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej opartej na żywych komórkach, aby niezawodnie wykrywać przeciwciała przeciwko określonym receptorom neuroprzekaźników. Ta metoda cytometrii przepływowej jest prosta, ilościowa, wydajna, a zastosowanie systemu próbników o wysokiej przepustowości pozwala na łatwe oznaczenie dużych kohort pacjentów w krótkim czasie. Ponadto ten test komórkowy można łatwo dostosować do wykrywania przeciwciał przeciwko wielu różnym celom antygenowym, zarówno z ośrodkowego układu nerwowego, jak i z jego peryferii. Odkrycie dodatkowych nowych biomarkerów przeciwciał umożliwi szybką i dokładną diagnozę oraz usprawni leczenie zaburzeń o podłożu immunologicznym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach zidentyfikowano autoimmunologiczne formy chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Wykazano, że choroby te są związane i definiowane przez obecność autoprzeciwciał. Przeciwciała te wiążą się z receptorami neuronalnymi lub białkami synaptycznymi zaangażowanymi w neuroprzekaźnictwo1,2. Wykryto różne antygeny, takie jak receptor N-metylo-D-asparaginianu (NMDAR)3-5, receptor6 receptora kwasu γ-aminomasłowego B (GABAB) 6, receptor7 kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego (AMPA) 7, białka związane z kanałem potasowym bramkowanym napięciem (VGKC): białko aktywowane glejakiem 1 bogate w leucynę (LGL-1) i białko związane z kontaktyną 2 (capsr2)8,9, receptorglutaminianu 5,10 i receptor dopaminy-2 ( D2R)11. W przeszłości te autoimmunologiczne zaburzenia OUN (zwane głównie zapaleniem mózgu) były często niezdiagnozowane i nieleczone. Te nowe biomarkery przeciwciał, np. przeciwciało NMDAR lub przeciwciało D2R, znacznie poprawiły diagnostykę i świadomość oraz otworzyły możliwości leczenia dla pacjentów. Rzeczywiście, wczesne leczenie immunoterapiami wiąże się z poprawą wyników11,12.

Tradycyjne metody wykrywania przeciwciał, takie jak test immunoenzymatyczny (ELISA) i western blot, były używane do wykrywania przeciwciał w surowicach. Jednak nie umożliwiają one łatwo rozpoznania epitopów zewnątrzkomórkowych lub powierzchniowych, a raczej mogą ujawniać immunoreaktywność w stosunku do epitopu wewnątrzkomórkowego. Ponadto przeciwciała, które wiążą się z domeną zewnątrzkomórkową ważnych białek biorących udział w neuroprzekaźnictwie, mogą być chorobotwórcze2,3,7,13,14. Dlatego kluczowe znaczenie ma opracowanie dokładnych i czułych testów w celu wykrycia odpowiednich celów przeciwciał powierzchniowych lub zewnątrzkomórkowych u pacjentów. Złoty standard w tej dziedzinie opiera się na wykorzystaniu żywych komórek w tak zwanych "testach komórkowych". Metoda ta polega na ekspresji antygenu na powierzchni komórek ssaków (najczęściej ludzkich embrionalnych komórek nerki 293 (HEK293)) w jego natywnej postaci poprzez transfekcję wektorów zawierających pełną sekwencję cDNA badanego antygenu. Żywe nieprzepuszczalne komórki są następnie inkubowane z rozcieńczoną surowicą pacjenta, a następnie z przeciwciałem drugorzędowym anty-ludzkiej immunoglobuliny (Ig) sprzężonym z fluorochromem. Następnie wykrywana jest intensywność lub poziom fluorescencji, który jest powiązany z poziomem wiązania autoprzeciwciał. Ta technika jest specyficzna, ponieważ tylko jeden antygen ulega nadekspresji w komórkach. Najpowszechniej stosowanym "odczytem" jest analiza mikroskopii konfokalnej po immunocytochemii4,5,8-10. Jednak testy oparte na komórkach cytometrii przepływowej są z powodzeniem stosowane do wykrywania przeciwciał u pacjentów z chorobami demielinizacyjnymi15-17. W szczególności Waters i wsp.15 porównało wykrywanie przeciwciał przy użyciu panelu technik wykrywania przeciwciał, w tym testów komórkowych, a następnie analiz mikroskopowych lub cytometrii przepływowej, i wykazało, że test oparty na komórkach cytometrii przepływowej jest najbardziej czułą, dokładną i wiarygodną metodą. Dlatego test oparty na komórkach cytometrii przepływowej jest korzystny, ponieważ jest ilościowy, nie zależy od badacza i nie wiąże się z użyciem materiału radioaktywnego. Jest to również wygodne, ponieważ umożliwia badanie dużych kohort pacjentów w krótkim czasie.

Ostatnio zoptymalizowaliśmy wysokoprzepustowy test oparty na komórkach cytometrii przepływowej, aby wykrywać przeciwciała NMDAR i przeciwciała D2R u pacjentów z autoimmunologicznymi chorobami OUN11. Nasza grupa niedawno wykryła przeciwciało NMDAR w surowicy pacjenta za pomocą testu opartego na komórkach cytometrii przepływowej. Te surowice dodatnie pod kątem przeciwciał NMDAR były wcześniej analizowane przy użyciu mikroskopii konfokalnej i również okazały się dodatnie11. Protokół ten przedstawia test oparty na komórkach cytometrii przepływowej do wykrywania wrażliwych na konformację przeciwciał OUN w surowicy pacjenta przy użyciu zautomatyzowanego próbnika o wysokiej przepustowości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Strategia subklonowania w celu skonstruowania kodowania wektorowego pIRES2-EGFP D2R lub NMDAR

  1. Uzyskaj pełnowymiarowy klon cDNA ludzkiej podjednostki D2R lub NMDAR 1 (NR1).
  2. Wybierz wektor ekspresyjny, taki jak pIRES2-EGFP, który jest odpowiedni do ekspresji białek transbłonowych ze wzmocnionym reporterem białka zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą wewnętrznego miejsca wejścia rybosomu (IRES), umożliwiając koekspresję zarówno antygenów, jak i GFP w komórkach oddzielnie.
  3. Subklon ludzkiego cDNA w wektorze pIRES2-EGFP.
    1. Aby sklonować cDNA, użyj odpowiednich enzymów restrykcyjnych (na przykład NheI i XhoI dla ludzkiego cDNA D2R).
    2. Wstawienie cDNA cięte przez ligat w ograniczonym wektorze pIRES2-EGFP.
    3. Sekwencja ligowana wektorem pIRES2-EGFP, D2R lub NMDAR, aby sprawdzić, czy wektor zawiera poprawną sekwencję.
    4. Oczyść i amplifikuj wektor pIRES2-EGFP, D2R lub NMDAR do późniejszego wykorzystania w transfekcji.

2. Transfekcja komórek HEK293 do ekspresji antygenu neuronalnego

  1. Hodowla komórek HEK293 w kolbach do hodowli tkankowej ze świeżym zmodyfikowanym podłożem Dulbecco's Eagle Medium (1x) (DMEM) w komplecie z 4,5 g/L D-glukozy, L-glutaminą i 110 mg/L pirogronianu sodu uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM GlutaMAX i 50 μg/ml gentamycyny.
  2. Odłącz komórki HEK293 za pomocą trypsyny i przenieś do stożkowej rurki.
    1. Przemyć przez odwirowanie komórek w stężeniu 250 x g przez 6 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżym, kompletnym DMEM.
  3. Policz komórki i zasiaj 6-dołkowe płytki w temperaturze około 8 x 105 komórek/basenik i hoduj przez noc w 2 ml DMEM w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.
  4. Gdy osiągną około 70% konfluencji, transfekuj komórki HEK293 za pomocą pIRES2-EGFP NR1 (komórki HEK293NMDAR +), pIRES2-EGFP D2R (komórki HEK293D2R +) i pIRES2-EGFP (komórkiCTL HEK293; kontrola wektorowa) w następujący sposób. Zachowaj kilka nietransfekowanych komórek HEK293 w celu późniejszej kompensacji.
    1. Przygotować wymaganą objętość mieszanki do transfekcji składającej się z 2,5 μg DNA, 200 μl 0,9% chlorku sodu i 4 μg/ml polietyleneniminy/basenika (każda zawiera 2 ml świeżej kompletnej substancji DMEM).
    2. Natychmiast wirować mieszaninę przez 10 sekund i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut, przed dodaniem objętości mieszanki transfekcyjnej do odpowiednich studzienek.
    3. Przykryj płytkę, owiń boki Parafilmem i odwiruj przy 280 x g przez 5 minut, aby wspomóc transfekcję komórek.
    4. Usunąć parafilm, a następnie umieścić w inkubatorze w celu wyhodowania go w temperaturze 37 °C.
    5. Zastąp pożywkę hodowlaną 18 godzin później świeżym, kompletnym DMEM i utrzymuj w kulturze przez kolejne 72 godziny.
    6. Opcjonalnie: 72 godziny po transfekcji, transfekowane komórki można wybrać przez hodowlę w kompletnym DMEM uzupełnionym 250 μg/ml Geneticin, w celu uzyskania poliklonalnego stabilnego transfektantu.

3. Test komórkowy oparty na cytometrii przepływowej do wykrywania przeciwciał przeciwko powierzchniowym antygenom neuronalnym

  1. Odłączyć komórkiCTL HEK293NMDAR+, HEK293D2R+ i HEK293 przez inkubację z 500 μl/basenik Versene przez około 5 minut w temperaturze 37 °C.
    1. Zawiesić w 2 ml / studzienkę PBS (-Ca2 + / -Mg2 +) uzupełnionego 2% FBS (PBS / FBS) i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml.
    2. Przemyć komórki przez odwirowanie przy 250 x g przez 6 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w 15-50 ml PBS/FBS. Powtórz pranie 2x.
    3. Policz komórki, a następnie ponownie zawieś w PBS/FBS w stężeniu 1 x 106 komórek/ml.
  2. Zaprojektuj 96-dołkową matrycę do akwizycji cytometrii przepływowej, biorąc pod uwagę, że komórki HEK293D2R+ lub HEK293NMDAR+, a także komórkiCTL HEK293 będą musiały być inkubowane z każdą próbką pacjenta lub przeciwciałem pierwotnym.
  3. Komórki nasienne w 96-dołkowej płytce z dnem V przy 50 000 komórek / dołku zgodnie z szablonem akwizycji cytometrii przepływowej.
  4. Osadzać komórki, odwirowując 96-dołkową płytkę o gramaturze 450 x g przez 5 minut i delikatnie usunąć supernatant za pomocą elektronicznej lub ręcznej pipety wielokanałowej, przechylając płytkę pod kątem i uważając, aby nie zassać osadu komórkowego.
  5. Inkubować komórkiCTL HEK293D2R+, HEK293NMDAR+ i HEK293 przez 1 godzinę w RT w ciemności z:
    1. Seryjne rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego w celu oceny ekspresji powierzchniowej antygenu.
    2. Próbki od pacjenta w celu wykrycia przeciwciał.
  6. Stosować odpowiednie kontrole kompensacji cytometrii przepływowej, np. niebarwione nietransfekowane komórki HEK293, komórki GFP+ HEK293 (AF647-) i nietransfekowane komórki AF647+ HEK293 (GFP).
  7. Przemyć komórki przez odwirowanie przy 450 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórek w 170 μl PBS/FBS. Powtórz krok prania jeszcze dwa razy.
  8. Inkubować komórki przez 1 godzinę w RT w ciemności z rozcieńczeniem 1:100 przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z AF647 (anty-ludzka IgG dla surowicy pacjenta i anty-mysie IgG dla pierwotnych przeciwciał anty-NR1 lub anty-D2R).
  9. Umyć komórki trzy razy, jak w kroku 3.7, i ponownie zawiesić w 35 μl PBS/FBS w celu pobrania komórek metodą cytometrii przepływowej.
  10. Skonfigurować próbnik o wysokiej przepustowości (HTS) na cytometrze przepływowym (BDLSRII).
  11. Zdobądź 10 000 zdarzeń/odwiert zgodnie z szablonem akwizycji cytometrii przepływowej.
  12. Eksportuj, a następnie analizuj dane do analizy za pomocą pakietu oprogramowania do cytometrii przepływowej, takiego jak FlowJo v7.5:
    1. Najpierw bramkują żywe komórki HEK293 na podstawie rozproszeń do przodu (rozmiar) i bocznych (ziarnistość).
    2. Dalsze bramkowanie żywych komórek HEK293 w oparciu o wysoki dodatni wynik GFP, aby przeanalizować tylko transfekowane komórki.
    3. Określ średnią intensywność fluorescencji (MFI) kanału AF647 w żywych komórkach GFP-dodatnich.
    4. Eksport danych do Excela lub Prism w celu analizy:
      1. Wykreślić stężenia przeciwciała pierwszorzędowego (przeciwciało anty-NMDAR lub przeciwciało anty-D2R) w funkcji MFI uzyskanego z komórek inkubowanych z tymi przeciwciałami.
      2. Dla każdego pacjenta i próbki kontrolnej należy określić ΔMFI, odejmując MFI komórekCTL HEK293 od MFI odpowiednio komórek HEK293D2R+ lub HEK293NMDAR+.
      3. Obliczyć próg dodatniego wyniku przeciwciał, dodając trzy odchylenia standardowe powyżej średniego ΔMFI kohorty kontrolnej.
      4. Wykreślić na wykresie poszczególne próbki pogrupowane według ich rodzaju surowicy i przedstawić próg w postaci linii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Live HEK293D2R+ i HEK293CTL zostały pozyskane na cytometrze przepływowym za pomocą próbnika o wysokiej przepustowości. Podczas analizy komórki bramkowano na podstawie parametrów rozproszenia do przodu (rozmiaru) i rozproszenia bocznego (ziarnistości) (rysunki 1A i 1D). Transfekowane komórki HEK293 wykazywały ekspresję cząsteczki reporterowej, GFP, w cytoplazmie, a nietransfekowane komórki zostały wyłączone z analizy (ryc. 1B i 1E). ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano nowatorskie zastosowanie testu cytometrii przepływowej opartej na żywych komórkach do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko określonym białkom neuronalnym na powierzchni komórki za pomocą próbnika o wysokiej przepustowości. Korzystając z tej techniki, informujemy, że podgrupa pacjentów dotkniętych autoimmunologicznymi chorobami OUN ma przeciwciała w surowicy do powierzchniowego NMDAR lub do powierzchniowego D2R.

Niezbędne kroki do optymalnego wykrywania przeciwciał p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konflikt interesów: F.B. i R.C.D. (University of Sydney) złożyły wniosek patentowy, w którym twierdzą, że D2R jest celem dla autoprzeciwciał.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Australijską Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych, Star Scientific Foundation (Australia), Stowarzyszenie Zespołu Tourette'a (USA), The Trish Multiple sclerosis Research Foundation i Multiple Sclerosis Research Australia, Petre Foundation (Australia), Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australia). Dziękujemy wszystkim pacjentom i członkom ich rodzin, którzy dostarczyli próbki do naszego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wektor pIRES2-EGFPClontech6029-1
Ludzki receptor HA-dopaminy-2 (D2R) cDNAMissouri S& Centrum Zasobów T cDNADRD020TN00
Ludzka podjednostka 1 cDNADar od prof. A. Vincenta  (Oksford, Wielka Brytania)
Monoklonalne, oczyszczone mysie przeciwciało anty-ludzkie NR1 (klon: 54.1)BD Pharmingen556308
Mysz oczyszczone monoklonalne przeciwciało anty-DRD2 IgG (klon: 1B11)Sigma-AldrichWH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 osło anty-mysie IgG (H + L)InvitrogenA31571
Alexa Fluor 647 kozie anty-ludzkie IgG (H + L)InvitrogenA21445
Dulbecco' s Modyfikowane podłoże Eagle (1x) 4,5 g/L D-glukozy, L-glutamina i 110 mg/L pirogronian soduInvitrogen11995-065
Surowica bydlęca dla płoduInvitrogen10099-141
GentamycynaInvitrogen15710-072
GlutaMAXInvitrogen35050-061
Penicylina-streptomycynaInvitrogen15140-122
GeneticinInvitrogen10131-035
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (1x) (-Ca2+/-Mg2+)Invitrogen14190-144
TrypLE Express (1x) z czerwienią fenolowąInvitrogen12605-028
0,9% Chlorek soduBaxterAHF7975
PolyethyleniminePolysciences Inc9002-98-6
VerseneInvitrogen15040-066
XhoIRoche10899194001
NheIRoche10885843001
Zestaw do oczyszczania PureLink PCRInvitrogenK3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin KitGenomed420050
T4 DNA LigaseRoche
Plazmid  Plus  Maxi KitQiagen12963
Nazwa sprzętu/oprogramowaniaFirmaNumer katalogowyModel/wersja
Cytometr przepływowy z wysokoprzepustowym systemem próbnikówBD BiosciencesBDLSRII z HTS
Mikroskop odwróconyOlympusCKX41 (z lampą rtęciową i zasilaczem U-RFLT50)
Elektroniczna pipeta wielokanałowa (15-300 μ l)Eppendorf613-2240P12-kanałowy Xplorer Plus
ExcelMicrosoft2010
PrismGraphPad Software, Inc.v4
FlowJoTreestarv7.5 50
ml polipropylenowe probówki stożkoweBD Biosciences352070
Płytka 6-dołkowaBD Biosciences353046
Kolba do hodowli tkankowych (T75)BD Biosciences353136
ParafilmPechiney Plastikowe opakowaniePM-992
V-bottom 96-dołkowe płytaCorning651180

NMDAR (NR1) 10481220001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
  2. Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
  3. Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
  4. Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
  5. Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
  6. Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
  7. Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
  8. Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
  9. Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
  10. Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
  11. Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
  12. Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
  13. Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
  14. Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
  15. Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
  16. McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
  17. Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
  18. Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
  19. Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
  20. Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
  21. Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
  22. Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Detekcja przeciwciawysokoprzepustowy pr bnikkom rki HEK 293reporter GFPrednia intensywno fluorescencjiprzeciwcia o wt rne

Powiązane artykuły