Obrazowanie centrosomów w jądrach much

Podsumowanie

Obrazowanie białek centrosomalnych podczas spermatogenezy Drosophila jest skuteczną metodą identyfikacji nowych białek krytycznych dla biologii centrosomów, a także wyjaśnienia szczególnej funkcji znanych graczy w tym procesie.

Streszczenie

Centrosomy to konserwatywne organelle oparte na mikrotubulach, których struktura i funkcja zmieniają się dramatycznie w trakcie cyklu komórkowego i różnicowania komórek. Centrosomy są niezbędne do określenia osi podziału komórki podczas mitozy i do zarodkowania rzęsek podczas interfazy. Tożsamość białek, które pośredniczą w tych dynamicznych zmianach, pozostaje tylko częściowo znana, a funkcja wielu białek, które są zaangażowane w te procesy, jest nadal szczątkowa. Niedawne prace wykazały, że spermatogeneza Drosophila zapewnia potężny system do identyfikacji nowych białek krytycznych dla funkcji i tworzenia centrosomów, a także do uzyskania wglądu w szczególną funkcję znanych graczy w procesach związanych z centrosomami. Drosophila jest uznanym organizmem modelu genetycznego, w którym mutanty w genach centrosomalnych można łatwo uzyskać i łatwo analizować. Co więcej, niedawne postępy w zakresie czułości i rozdzielczości mikroskopii świetlnej oraz opracowanie solidnych, znakowanych genetycznie markerów centrosomalnych zmieniły możliwość wykorzystania jąder Drosophila jako prostego i dostępnego systemu modelowego do badania centrosomów. W artykule opisano zastosowanie genetycznie znakowanych markerów centrosomalnych do wykonywania genetycznych badań przesiewowych dla nowych mutantów centrosomalnych oraz w celu uzyskania wglądu w specyficzną funkcję nowo zidentyfikowanych genów.

Wprowadzenie

Jądra Drosophila są odpowiednim układem narządów do badania różnych procesów komórkowych i rozwojowych i były szeroko sprawdzane w latach ^1-9. Manuskrypt ten koncentruje się na wykorzystaniu jąder Drosophila do badania centrosomu, konserwatywnego organcelli komórkowej. Podobnie jak w innych systemach, centrosom jąder Drosophila funkcjonuje w mitozie, mejozie i ciliogenezie ¹⁰. Centrosomy składają się z pary struktur opartych na mikrotubulach, znanych jako centriole, otoczonych złożoną siecią białkową zwaną materiałem pericentriolarnym (PCM). Para centrioli składa się ze starszej środkowej matki i młodszej centrioli córki. W miarę jak komórka postępuje w kierunku mitozy, obie centriole oddzielają się, duplikują i uzyskują dużą ilość PCM, aby ostatecznie utworzyć dwa odrębne centrosomy. Centrosom zawierający oryginalną centriorolę macierzystą jest określany jako centrosom macierzysty, a centrosom zawierający oryginalną centriorolę potomną jest określany jako centrosom potomny.

Jądra Drosophila są idealne do badania molekularnych podstaw biologii centrosomów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z różnych powodów.

1. Większość białek Drosophila, które są wymagane do biologii centrosomów w jądrach, jest zachowana wśród eukariontów, co sugeruje, że wgląd w biologię centrosomów u ludzi i innych gatunków można uzyskać, badając centrosom w jądrach Drosophila ^1,11-14 .
2. Przeprowadzenie analizy mutantów u Drosophila zapewnia znaczną przewagę, ponieważ, w przeciwieństwie do wielu innych modeli, mutacje centrosomalne u Drosophila nie są śmiertelne w zarodku, co pozwala na klasyczną analizę genetyczną funkcji centrosomów. Ta wyjątkowa cecha Drosophila wynika z obecności wkładu matki, który utrzymuje się w krytycznych stadiach rozwoju embrionalnego. ^1,11-14 . W ten sposób można a) badać mutacje, które całkowicie eliminują powstawanie centrosomów i b) badać los normalnego centrosomu, który powstał we wczesnym zarodku przez wkład matki w kontekście zmutowanym po wyczerpaniu wkładu matki (zasada metody jest opisana w ¹¹).
3. Dostępne są funkcjonalne transgeny z genetycznie kodowanymi znacznikami fluorescencyjnymi, które oznaczają centrosom. Wiele z tych linii wykorzystuje własny promotor białka do napędzania transkrypcji transgenu, aby zapobiec silnej nadekspresji. Jest to szczególnie ważne, ponieważ nadekspresja białek często prowadzi do powstawania artefaktów, które zakłócają analizę funkcji centrosomów ^1,11 .
4. Centriole i centrosom są wyjątkowo długie w spermatogenezie Drosophila, co pozwala na szybką i łatwą analizę centrosomu za pomocą obrazowania.
5. Kolejne etapy spermatogenezy i biologii centrosomów są zorganizowane chronologicznie wzdłuż jąder, zaczynając od czubka jądra z centrosomami plemników macierzystych, a kończąc na dnie jąder ze zmniejszonym rozmiarem centrosomu i aktywnością w dojrzałych plemnikach (ryc. 1 i 2). Pozwala to na łatwą identyfikację i analizę funkcji centrosomów na różnych etapach rozwoju plemników.
6. Jądra można łatwo wypreparować z męskich larw, poczwarek i dorosłych ²⁷.
7. Podczas spermatogenezy centrosom i jego centriole przechodzą przez wiele stanów składowych, strukturalnych i funkcjonalnych, aby funkcjonować w mitozie, mejozie i tworzeniu rzęsek. Podczas tych procesów centrosom gromadzi się, duplikuje, migruje, zakotwicza się w określonych częściach komórki, dojrzewa, dzieli się i tworzy rzęskę. Ponadto w centrioli dojrzałego spermatydu powstaje prekursor dośrodkowy o nazwie PCL ¹. Również w dojrzałym plemniku centrosom przechodzi proces zwany redukcją centrosomów, w którym traci wiele składników PCM i centrioli (ryc. 1 i 2). Tak więc badania w jądrach pozwalają zająć się wieloma aspektami życia centrosomów, takimi jak między innymi retencja centrosomów w komórkach macierzystych, duplikacja centrioli, stabilność centrioli, wydłużanie centrioli, separacja i segregacja centrioli, rekrutacja PCM, ciliogeneza, tworzenie PCL, redukcja centrosomów i zarodkowanie mikrotubul astralnych.
8. Wreszcie, badania nad biologią centrosomów są wspomagane przez inne dobrze znane cechy Drosophila, które sprawiły, że jest to preferowany organizm modelowy do badań biologicznych. Należą do nich krótki czas generacji, łatwość genetyki, a także mutageneza losowa i ukierunkowana na miejsce.

Razem, wyżej wymienione cechy jąder Drosophila tworzą model, w którym centrosom może być badany za pomocą łatwego, szybkiego i szczegółowego obrazowania. Techniki opisane w tym artykule zostały zastosowane do zbadania wielu aspektów biologii centrosomów, w tym tworzenia centrioli ¹¹, duplikacji centrioli ¹⁵, rekrutacji PCM ¹⁶, regulacji centrosomów ¹⁷ i ciliogenezy ¹⁸. Techniki te zostały również zastosowane do badania centrosomów w innych obszarach biologii, takich jak regulacja mejotyczna ¹⁹, montaż wrzeciona ²⁰ i aktywność centrosomów w asymetrycznym podziale komórek macierzystych ²¹ wśród wielu innych.

Obrazowanie jąder w centrosomie zaczyna się od uzyskania muszek, które wyrażają genetycznie oznaczone białka centrosomalne i wyizolowania jąder od męskich larw, poczwarek lub dorosłych muszek. Muchy te są dostępne w kilku grupach badawczych ^{1,11,15,22-25} . Jądra larw zawierają wszystkie etapy spermatogenezy przed mejozą i są przydatne podczas analizy mutacji, które są śmiertelne u poczwarki lub osoby dorosłej. Jednak jądra późnych poczwarek lub młodych dorosłych osobników są najbardziej wytrzymałe i zawierają wszystkie etapy spermatogenezy przed i po mejozie, co czyni je preferowanymi do analizy. Ponieważ liczba plemników zmniejsza się wraz z wiekiem muchy, użycie dorosłych jąder jest również odpowiednie do badania centrosomu w kontekście starzenia się. ²⁶. Metoda izolacji jąder od dorosłych much została już wcześniej opisana ²⁷.

Obrazowanie centrosomów i ich funkcji w jądrach Drosophila można osiągnąć za pomocą trzech powiązanych ścieżek, które są tutaj przedstawione (Rysunek 3). Wybór najbardziej odpowiedniej ścieżki zależy od charakteru pytania, na które zwraca się badacz.

Ścieżka A obejmuje obrazowanie testów na żywo. Jest to najszybsza z trzech ścieżek, ale może być stosowana tylko wtedy, gdy próbki nie muszą być konserwowane i gdy barwienie immunologiczne nie jest wymagane. Na ścieżce A jądra są montowane (nienaruszone, przekłuwane lub cięte) na szkiełkach i ostrożnie zgniatane pod szkiełkiem nakrywkowym, tworząc pojedynczą warstwę łatwych do zidentyfikowania komórek. Komórki są następnie wizualizowane zarówno za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, jak i mikroskopii fluorescencyjnej. Zastosowanie kontrastu fazowego jest szczególnie ważne w analizie jąder Drosophila, ponieważ ujawnia informacje komórkowe, które nie są widoczne przy innych formach przechodzącego oświetlenia, a tym samym pozwala na szybką identyfikację różnych etapów rozwoju plemników ^28,29 . Ścieżka A ma jednak dwie główne wady. Po pierwsze, integralność morfologiczna komórek jest często zagrożona po pęknięciu jąder. Po drugie, nieutrwalone komórki czasami poruszają się w próbce, co utrudnia obrazowanie wielu warstw konfokalnych w określonym regionie. Aby ułatwić analizę określonych typów komórek, jądra mogą być przekłuwane lub cięte w celu ukierunkowania sposobu, w jaki jądro pęka w taki sposób, aby zgniatanie pod szkiełkiem nakrywkowym w minimalnym stopniu wpływało na morfologię interesującego typu komórki.

Ścieżka B obejmuje chemiczne utrwalanie jąder. Ta ścieżka wymaga pośredniej ilości czasu na przygotowanie próbki i ma tę zaletę, że utrwalone próbki można zapisać do późniejszej analizy. Ponadto utrwalenie służy usztywnieniu struktur komórkowych, minimalizując ruch próbki podczas obrazowania. Jednak mikroskopia z kontrastem fazowym staje się znacznie mniej pouczająca po utrwaleniu chemicznym, co utrudnia identyfikację niektórych etapów rozwoju plemników.

Ścieżka C jest najbardziej czasochłonna, ale ma dodatkową zaletę, że struktury komórkowe są stałe i wybarwione immunologicznie, co pozwala na wizualizację białek, które nie są dostępne z odpowiednimi znacznikami genetycznymi. Istnieje wiele przeciwciał dostępnych zarówno komercyjnie, jak i z różnych grup badawczych do barwienia immunologicznego centrosomów i struktur związanych z centrosomami w jądrach Drosophila.

Protokół

1. Ścieżka A. Przygotowanie testów na żywo

1. Przygotować PBS, rozpuszczając 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄, 0,24 g KH₂PO₄ w 800 ml wody destylowanej i dostosować pH do 7,4. Doprowadzić objętość do 1 l i sterylizować w autoklawie.
2. Wyizoluj jądra, jak opisano wcześniej ²⁷.
3. Przygotować bufor barwiący DAPI, rozcieńczając 1 mg/ml bulionu do 1 μg/ml w PBS. Użyj folii aluminiowej, aby chronić probówkę przed światłem i przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Po wyizolowaniu jąder zanurz próbkę w 6 μl buforu barwiącego DAPI na dodatnio naładowanym szkiełku mikroskopowym na 10 minut. Jądra dobrze przylegają do dostępnych na rynku dodatnio naładowanych szkiełek, co pozwala na łatwą manipulację próbką. Szkiełka naładowane dodatnio są kowalencyjnie modyfikowane w celu nadania powierzchni szkła statycznego ładunku dodatniego. Podobnie jak powłoka polilizynowa, sprzyja to interakcji jąder z powierzchnią szkiełka.
5. Nadmiar DAPI zmyć, zastępując dwukrotnie bufor barwiący 6 μl PBS. Użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby usunąć bufor po każdym etapie mycia. Należy zachować ostrożność, aby przypadkowo nie wyjąć jąder wraz z buforem podczas każdego prania.
6. Dodać 6 μl PBS do próbki. Ilość stosowanego bufora powinna być dostosowana do rozmiaru szkiełka nakrywkowego. Objętości przewidziane w niniejszym protokole dotyczą szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18 x 18 mm. Opcjonalnie: Wskazane jest przekłucie jąder w pobliżu względnej lokalizacji interesującego typu komórki. Zapewni to minimalny nacisk na te komórki podczas etapu zgniatania, zachowując w ten sposób ich integralność strukturalną. Przekłuwanie jąder można wykonać za pomocą ostrego, czystego skalpela.
7. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbki.
8. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, aby upewnić się, że bufor nie odparuje z żywej próbki podczas obrazowania.
9. Użyj markera, aby wyznaczyć pozycję jąder, aby ułatwić zlokalizowanie próbki na szkiełku i przystąp do obrazowania.
10. Nadmiar buforu barwiącego DAPI zmyć, zastępując bufor dwukrotnie 6 μl PBS. Użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby usunąć bufor po każdym etapie mycia. Uważaj, aby przypadkowo nie usunąć próbki wraz z buforem podczas każdego prania.

2. Ścieżka B. Przygotowanie stałych jąder

1. Przygotować bufor Fix, rozcieńczając 37% roztwór podstawowy formaldehydu w PBS do końcowego stężenia 3,7% formaldehydu w 1x PBS
2. Przygotować bufor do barwienia DAPI, rozcieńczając 1 mg/ml bulionu DAPI do 1 μg/ml w PBS.
3. Zanurz jądra w kropli PBS o objętości 6 μl na dodatnio naładowanym szklanym szkiełku mikroskopowym.
4. Ręcznie ustaw jądra w sposób liniowy lub w inny preferowany sposób.
5. Za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej usuń PBS i zastąp go 6 μl buforu Fix na 5 minut.
6. Za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej usuń bufor Fix i zanurz próbkę w 6 μl buforu barwiącego DAPI na 10 minut.
7. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 x 18 mm na wierzchu próbki.
8. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, aby upewnić się, że bufor nie odparuje z próbki podczas obrazowania.
9. Użyj markera, aby wyznaczyć pozycję jąder, aby ułatwić zlokalizowanie próbki na szkiełku i przystąp do obrazowania.

3. Ścieżka C. Przygotowanie jąder wybarwionych immunologicznie

Silikonowanie szkiełek nakrywkowych: Zanurz wiele szkiełek nakrywkowych 18 x 18 mm w małej tacce zawierającej roztwór silikonowy i inkubuj przez 1 minutę w temperaturze pokojowej pod wyciągiem. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są całkowicie odsłonięte i nie są ułożone jeden na drugim.

1. Umieścić próbkę w kropli PBS o objętości 5 μl na silikonowanym szkiełku nakrywkowym. Ustaw jądra zgodnie z potrzebami i przebij jądra ostrym skalpelem. Delikatnie umieść dodatnio naładowane szkiełko mikroskopowe na szkiełku nakrywkowym, pozwalając PBS równomiernie rozproszyć się między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem. Użyj małego kawałka bibuły filtracyjnej, aby usunąć nadmiar bufora między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem. Gdy bufor jest usuwany przez bibułę filtracyjną, wzrost ciśnienia spowoduje zgniecenie jąder. Wiele próbek powinno być przygotowywanych jednocześnie, ponieważ niektóre mogą zostać utracone lub uszkodzone w trakcie trwania protokołu. Grawer do szkła może być używany do oznaczania szkiełek, jeśli jednocześnie będą przygotowywane różne rodzaje próbek.
   1. Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy po 1 minutę w wodzie, następnie 3 razy po 1 minutę w 70% etanolu i końcowe umyj przez 1 minutę w wodzie. Pozostaw silikonowane szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu pod wyciągiem.
2. Wrzuć szkiełka do ciekłego azotu i pozostaw próbkę do zamrożenia na 5-10 minut.
3. Usuń szkiełka z ciekłego azotu za pomocą dużych kleszczy. Użyj skalpela, aby szybko usunąć szkiełko nakrywkowe. Próbka powinna pozostać na szkiełku. Należy uważać, aby nie rozmazać próbki podczas tego procesu, przesuwając szkiełko nakrywkowe wzdłuż szkiełka.
4. Inkubować szkiełka w schłodzonym metanolu w szklanym słoiku do barwienia Coplin w temperaturze -20 °C przez 15 minut.
5. Przenieść szkiełka do szklanego słoika do barwienia z kopliny, zawierającego wstępnie schłodzony aceton w temperaturze -20 °C przez 30 sekund.
6. Myj szkiełka przez 1 minutę w PBS w temperaturze pokojowej za pomocą szklanego słoika do barwienia Coplin.
7. Przygotować PBST-B, uzupełniając PBS 0,1% Triton-X100 i 1% białkiem surowicy bydlęcej (BSA). Zamiast BSA można użyć 5% normalnej surowicy od tego samego gatunku gospodarza, co przeciwciało drugorzędowe (od kroku 3.14) w celu zmniejszenia szumu tła wytwarzanego przez wiązanie nieswoistych przeciwciał drugorzędowych.
8. Inkubować szkiełka przez 10 minut w PBST-B w szklanym słoiku do barwienia Coplin w celu zablokowania nieokreślonych miejsc.
9. Napełnij studzienki komory wilgotnościowej wodą. Wilgotność wewnątrz komory zminimalizuje parowanie roztworów przeciwciał z próbki podczas etapów inkubacji.
10. Przygotować PBST-BR, uzupełniając PBST-B 100 μg/ml RNazy A. RNaza A rozkłada RNA w próbce, a także służy jako dodatkowy środek blokujący poprzez silną absorpcję do powierzchni szkła.
    1. Umieść kawałek Parafilmu o wymiarach około 1x1 cm na wierzchu próbki, aby równomiernie rozprowadzić roztwór przeciwciała i chronić roztwór przeciwciała przed odparowaniem. Zamknąć komorę wilgotnościową i inkubować próbkę w przeciwciałie pierwszorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
11. Wyjmij szkiełka z PBST-B. Użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby wysuszyć obszar szkiełka wokół próbki, uważając, aby nie wysuszyć samej próbki. Na koniec umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej próbką skierowaną do góry
12. Delikatnie dodać 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w PBST-BR na wierzch próbki (1:200 jest na ogół dobrym stężeniem początkowym dla niescharakteryzowanych przeciwciał).
    1. Przykryj próbkę kawałkiem Parafilmu o wymiarach około 1 x 1 cm i zamknij komorę wilgotnościową. Inkubować próbkę w przeciwciałie drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
13. Otwórz komorę wilgotności i za pomocą kleszczy delikatnie usuń Parafilm ze szkiełka. Inkubować szkiełka przez 5 minut w PBST w szklanym słoiku do barwienia z kopliny w temperaturze pokojowej w celu umycia. Powtórz ten proces, w sumie trzy prania.
14. Wyjmij szkiełka z PBST-B i umieść je w komorze wilgotnościowej próbką skierowaną do góry. Delikatnie dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w PBST-BR na wierzch próbki.
15. Otwórz komorę wilgotności i za pomocą kleszczy delikatnie usuń Parafilm ze szkiełka. Ponownie umyj próbkę 3x przez 5 minut każdy w PBST w szklanym słoiku do barwienia Coplin, a następnie 3x po 5 minut w PBS.
16. Użyj Kimwipe i bibuły filtracyjnej, aby ostrożnie osuszyć powierzchnię szkiełka, uważając, aby nie dotknąć ani nie wysuszyć próbki.
17. Dodać 6 μl podłoża montażowego do próbki, przykryć czystym szkiełkiem nakrywkowym (nie pokrytym silikonem), a krawędzie uszczelnić lakierem do paznokci.
18. Użyj markera, aby wyznaczyć pozycję jąder, aby ułatwić zlokalizowanie próbki na szkiełku i przystąp do obrazowania.

4. Uwagi dotyczące obrazowania

Obrazowanie można osiągnąć za pomocą pionowego lub odwróconego mikroskopu światła regularnego lub mikroskopu konfokalnego. Ważne jest, aby mikroskop był wyposażony w kontrast fazowy, szczególnie do obrazowania żywych próbek jąder (ścieżka A). Ta funkcja stała się niedawno dostępna w mikroskopach konfokalnych.

Gdy jądra pękają spontanicznie (ścieżka A), końcówka (obszar komórki macierzystej) jest zwykle nienaruszona i łatwo ją zidentyfikować, co stanowi dobry znacznik do początkowego zlokalizowania i użycia do orientacji.

Centriole są dość małymi strukturami i dlatego obrazy powinny być wykonywane przy użyciu obiektywów 63X lub 100X, o współczynniku powiększenia 4-6X i rozdzielczości co najmniej 512 x 512 pikseli, jeśli to możliwe.

Wyniki

Centrosomy przechodzą wiele morfologicznych i funkcjonalnych przemian w trakcie spermatogenezy. Ta cecha spermatogenezy sprawia, że jądra są użytecznym systemem do badania różnych aspektów biologii centrosomów. Jednym z takich łatwo obserwowanych procesów jest wydłużanie centrosomów. W spermatogonii marker dośrodkowy Ana1-GFP oznacza centriolę o długości 0,6 μm (ryc. 4a). Ta centriole wydłuża się podczas spermatogenezy i osiąga długość 2,5 μm u prawie dojrzałych spermatydów. Ponieważ centriole w plemnikach Drosophila są wyjątkowo długie, obrazowanie można wykorzystać do ilościowego stwierdzenia wydłużenia centrosomów (Figura 4b). Analizę długości centrioli można również przeprowadzić na tle mutantów i zidentyfikowano różne mutanty, które zmieniają wzrost centrioli (ryc. 5). Przykładami są zawsze wczesne (aly) i kula armatnia (can), mutacje, które zatrzymują spermatogenezę przed wystąpieniem mejozy ³⁰, ale nie blokują wydłużenia centrioli. W tych mutantach centriole dojrzałych spermatocytów rosną do około ~2,4 μm w porównaniu z centriolami komórek kontrolnych, które osiągają maksymalnie 1,8 μm.

Rysunek 1. Spermatogeneza i biologia centrosomów. a) Rozwój komórek macierzystych i spermatogonii. Wszystkie plemniki pochodzą z komórek macierzystych znajdujących się na wierzchołkowym końcu jąder. Każda komórka macierzysta dzieli się asymetrycznie, tworząc komórkę macierzystą, która dziedziczy centrosom macierzysty i spermatogonium progenitorowe, które dziedziczy centrosom potomny ³¹. Gdy tworzą się spermatogonie, są one otoczone przez 2 komórki torbieli, które nadal otaczają spermatocyty i spermatydy przez cały okres spermatogenezy. Spermatogonia dzieli się 4 razy, aby wytworzyć 16 Spermatogonii, z których każda zawiera dwie centriole. b) Rozwój spermatocytów i mejoza. Podczas rozwoju spermatocytów centriole powielają się ponownie, tworząc cztery centriole zorganizowane w dwie pary na komórkę i 64 centriole na torbiel. Na wczesnym etapie rozwoju spermatocytów każda centriola przemieszcza się do błony plazmatycznej, dokuje do niej i wydłuża się, tworząc strukturę przypominającą pierwotną rzęskę^18,32-34 . W dojrzałych spermatocytach długość centrioli osiąga ~1,8 μm. Centrosomy odgrywają istotną rolę w mejozie. Podczas mejozy I pary centrioli, które są nadal przyczepione do błony plazmatycznej, przesuwają się w kierunku środka komórki i tworzą wgłębienia błony komórkowej na ich dystalnym końcu. PCM wokół centrioli rośnie, zarodkuje mikrotubule astralne i kolokalizuje się z biegunem wrzeciona. Podczas przejścia do mejozy II para centrioli rozdziela się tak, że na każdym biegunie wrzeciona znajduje się tylko jedna centriol. C) Spermiogeneza. Pod koniec mejozy II, wczesny okrągły spermatyd ma pojedynczą centriolę przymocowaną do wgłębnej błony plazmatycznej. Duża okrągła pochodna mitochondrialna znajduje się w pobliżu jądra, a później zaczyna się wydłużać wzdłuż rosnącego aksonemu w późniejszych okrągłych spermatydach. Podczas spermatogenezy aksonem tworzy się i wydłuża wewnątrz cytoplazmy. Ponadto nowa struktura dośrodkowa znana jako PCL (Proksymal Centriole Like) pojawia się w pobliżu istniejącej wcześniej centrioli¹. Pod koniec spermatogenezy komórki mające wspólną torbiel oddzielają się od siebie, aby stać się w pełni dojrzałymi ruchliwymi plemnikami. Diagramy rozwoju spermatocytów (B) i spermiogenezy (C) przedstawiają tylko jedną komórkę z 16 spermatocytów i 64 spermatydów, odpowiednio na torbiel i nie przedstawiają komórek torbieli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. Jądra Drosophila. Nakładka mikrofotografii kontrastu fazowego i fluorescencji GFP jądra z pełnym wierzchołkiem wyraża marker pan-centriolarny Ana-1-GFP. Wyraźny obszar odpowiadający panelom 1-3 na rysunku 1 jest oddzielony przerywaną czerwoną linią A) Komórki macierzyste i spermatogonia, B) Spermatocyty i mjoza, C) Spermiogeneza.

Rysunek 3. Ścieżki w kierunku obrazowania centrosomów w jądrach Drosophila.

Rysunek 4. Wydłużenie centrosomów podczas spermatogenezy. A) Każdy etap pokazuje obraz z kontrastem fazowym (po lewej), obraz fluorescencyjny (w środku) i powiększony obraz centrosomu (po prawej). Obraz z kontrastem fazowym pokazuje konkretny etap komórki na podstawie położenia i morfologii komórki, jądra, jąderka i mitochondriów. Obraz fluorescencyjny przedstawia DNA wybarwione DAPI (na niebiesko). Obraz centrosomu pokazuje centrosomy oznaczone przez Asterless-GFP (Asl, górne obrazy) i Ana1-GFP (Ana1, dolny obraz). Białe kółko podkreśla błonę komórkową zarówno na obrazach z kontrastem fazowym, jak i fluorescencyjnym. Przerywane białe kółka i szare kółko na obrazie fluorescencyjnym podkreślają odpowiednio położenie jądra i jąderka. Żółta strzałka wskazuje pętle chromosomu Y. Czerwone przerywane kółka oznaczają mitochondria. Etapy 1-6 odnoszą się do ²⁹, a etapy 13-17 odnoszą się do opisu etapów komórkowych w ³². Etap 1: Pierwotny spermatocyt. Zidentyfikowany jako mała komórka, wierzchołek jądra. Etap 2a: Spermatocyt polarny. Identyfikowany przez obecność czapy mitochondrialnej po jednej stronie jądra. Etap 3: Spermatocyt apolarny. Identyfikowany przez stosunkowo większy rozmiar niż pierwotny spermatocyt i brak czapeczki mitochondrialnej. Etap 4: Pierwotny spermatocyt. Identyfikowane po wyglądzie wszystkich: Wszystkie 3 pętle chromosomu Y. Etap 5: Dojrzały pierwotny spermatocyt. Największy spermatocyt wytwarzany w spermatogenezie, identyfikowany przez dalszy wzrost wielkości jądra. Etap 6: Premejotyczny pierwotny spermatocyt. Pętle chromosomu Y rozpadają się, a jądro znika. Etap 13: Spermatyda w stadium cebuli. Okrągła komórka zawierająca jednakowej wielkości jądro i mitochondria. Etap 17: Późna spermatyda. Zidentyfikowany jako wydłużony spermatyd, który pozostaje częścią wiązki 64 spermatyd z jądrami znajdującymi się w pobliżu podstawy jąder., Jądra są nieco szersze niż dojrzałe spermatydy znajdujące się w pęcherzyku nasiennym. Podziałki liniowe, 10 μm i 1 μm. B) Wykres przedstawia średnią i odchylenie standardowe dla każdego etapu, mierzone za pomocą Asterless-GFP (niebieski) i Ana1-GFP (zielony). Na etapie 6 średnie i odchylenia standardowe Asterless-GFP (niebieski) i Ana1-GFP (zielony) nakładają się na siebie i widoczne jest tylko Asterless-GFP (niebieskie). Począwszy od etapu 13, Asterless-GFP nie zdobi całej centrioli i pomiary nie zostały określone (ND).

Rysunek 5. Nienormalnie długie centriole w stadium 6 Spermatocyty aly i mogą mutanty. AC) Mikrografia świetlna całych jąder i panel fluorescencyjny reprezentatywnego centrosomu znakowanego przez Ana1-GFP. Zwróć uwagę na nieprawidłowy kształt jąder u mutantów aly i can, co wynika z braku plemników w wyniku zatrzymania mejozy. D) Wykres przedstawia średnią, odchylenie standardowe i rozkład danych długości centrioli w typie dzikim, aly i can. Numer próbki dla każdego punktu danych znajduje się w nawiasach. Podziałka, 1 μm.

Dyskusja

Badanie biologii centrosomów w jądrach muszek przy użyciu genetycznie znakowanych markerów centrosomalnych jest przydatną metodą oceny funkcji i aktywności centrosomów zarówno w kontekście dzikim, jak i zmutowanym. W szczególności ścieżka A nadaje się do szybkich badań przesiewowych nieprawidłowości centrosomalnych, takich jak wady rozwojowe, misegregacja, niestabilność lub nieprawidłowa długość w celu identyfikacji nowych mutantów. Co więcej, rzęski spermatydów w żywych preparatach pozostają ruchliwe przez około 15 minut po sekcji, a zastosowanie żywych jąder na ścieżce A pozwala również na łatwe zajęcie się ruchliwością plemników. Ponieważ aktywność ruchliwych rzęsek plemników jest bezpośrednio związana z funkcją centrosomów, można przeprowadzić testy w celu określenia wpływu różnych mutacji centrosomalnych na funkcję rzęsek. Ścieżka B może być używana do bardziej szczegółowych obserwacji, zwłaszcza gdy wymagane są dane statystyczne, takie jak liczenie centrioli na komórkę i/lub liczby komórek na torbiel. Ścieżka C jest najbardziej przydatna do szczegółowych obserwacji, które wymagają barwienia przeciwciałami. Przykłady obejmują znakowanie określonego typu komórek, takich jak komórki macierzyste, barwienie białka, które nie ma dostępnego znacznika, takiego jak acetylowana tubulina, lub w celu sprawdzenia braku lub błędnej lokalizacji białka w mutancie.

Podczas obrazowania centrosomów i struktur związanych z centrosomami stosowanie genetycznie znakowanych markerów zamiast przeciwciał jest nie tylko łatwiejsze eksperymentalnie, ale także zapewnia bardziej wiarygodne i powtarzalne wyniki. Dlatego zastosowanie genetycznie znakowanych białek centrosomalnych jest niezawodnym podejściem do analiz mechanistycznych i ilościowych, które wymagają dużego zestawu danych. Na przykład zastosowanie genetycznie znakowanych markerów centrosomalnych było szczególnie cenne dla ilościowego określenia długości centrioli. Taka analiza wykazała, że różne mutacje można podzielić na dwie kategorie w zależności od zmienności długości centrioli. Jedna kategoria obejmuje mutacje, które zmieniają długość centrioli, ale nie wpływają na odchylenie standardowe ¹ , a druga kategoria obejmuje mutacje, które wpływają zarówno na długość centrioli, jak i odchylenie standardowe długości ¹¹. Takie dane ilościowe mogą dostarczyć użytecznych informacji na temat funkcji poszczególnych genów centrosomalnych. Mutanty centrosomalne, które wykazują wadliwą długość centrioli ze wzrostem odchylenia standardowego, mogą być spowodowane destabilizacją struktury środkowej. Jednak wadliwa długość centrioli z normalnym błędem standardowym może wskazywać, że mutacja nie destabilizuje strukturalnie centrioli i jest bardziej prawdopodobne, że jest spowodowana zmianą mechanizmu regulacyjnego kontrolującego długość centrioli. Ze względu na niespójności w barwieniu immunologicznym, analizy ilościowe są trudne przy użyciu samych markerów przeciwciał.

Centrosom jest dużą, złożoną strukturą białkową, a wiele jego białek znajduje się tylko w jego wnętrzu. Użycie genetycznie znakowanych markerów centrosomalnych zamiast przeciwciał pozwala na konsekwentne znakowanie wewnętrznych składników centrosomu, których epitopy mogą być w inny sposób niedostępne dla markerów przeciwciał. Na przykład badania lokalizacji Bld10 przy użyciu przeciwciał wykazały, że białko jest wzbogacone na dystalnych i proksymalnych końcach centrioli ¹³, podczas gdy Bld10-GFP wykazuje bardziej równomierną dystrybucję ¹. Jednak ważne jest również, aby wziąć pod uwagę poziom ekspresji określonego genetycznie znakowanego białka, ponieważ może to wpływać na dystrybucję białka. Lokalizacja Sas-4-GFP i SAS-6-GFP wyrażonych pod ich endogennym jest ograniczona do bliższych końców centrioli ^1,16,35 Z drugiej strony Sas-4-GFP i SAS-6-GFP wyrażane pod silnym promotorem ubikwityny są zlokalizowane na całej długości centrioli ^12,14 . Inną ważną kwestią jest wpływ znacznika genetycznego na funkcję białka. Analizowanie, czy genetycznie znakowane białka są funkcjonalne, można przetestować, wprowadzając białko transgeniczne do zmutowanego tła i badając, czy białko transgeniczne ratuje zmutowany fenotyp.

Utrwalanie jąder Drosophila można przeprowadzić przy użyciu różnych chemicznych utrwalaczy. Tutaj opisujemy utrwalanie zarówno formaldehydem (ścieżka B), jak i metanolem-acetonem (ścieżka C). Jednak każdy utrwalacz może być stosowany zamiennie, a ponieważ różne utrwalacze mogą chemicznie zakłócać natywne epitopy przeciwciał, wybór odpowiedniego utrwalacza do barwienia immunologicznego musi być określony doświadczalnie. Powszechnie stosuje się następujące utrwalacze i warunki inkubacji: 3,7% formaldehydu, 5 min w temperaturze pokojowej; metanol, 15 min w temperaturze -20 °C; aceton, 10 min w temperaturze -20 °C; metanol, 15 min w temperaturze -20 °C, a następnie aceton, 30 sekund w temperaturze -20 °C; etanol, 20 min w temperaturze -20 °C. Chociaż wiązanie acetonem, metanolem i etanolem nie wymaga przedłużonego etapu permeabilizacji w celu barwienia immunologicznego, po utrwaleniu formaldehydem należy przeprowadzić 1-godzinną inkubację w PBST-B w temperaturze pokojowej, aby przeniknąć błony komórkowe i umożliwić dostęp przeciwciał do wewnątrzkomórkowych epitopów. Ponadto niektóre utrwalacze są bardziej odpowiednie dla określonych antygenów. Na przykład formaldehyd dobrze sprawdza się w wiązaniu małych białek, podczas gdy metanol i aceton dobrze nadają się do utrwalania dużych kompleksów molekularnych ³⁶.

Barwienie immunologiczne jąder Drosophila zostało wcześniej opisane w celu obserwacji struktur chromatyny i cytoszkieletu mikrotubul ^29,37. W tym przypadku (ścieżka C) procedura została zoptymalizowana pod kątem analizy struktur centrosomalnych zawierających genetycznie znakowane białka. Przedstawiamy szczegółowy opis tej procedury, aby pomóc osobom, które nie mają doświadczenia w pracy z jądrami Drosophila . Procedura ta obejmuje również modyfikacje mające na celu poprawę zachowania i morfologii jąder, na przykład poprzez użycie silikonowanych szkiełek nakrywkowych i dodatnio naładowanych szklanych szkiełek mikroskopowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DAPI	Invitrogen	D1306
Dodatnio naładowane szkiełka	AZER Scientific	EMS200A +
Mikroskopia elektronowa	mikroskalpelem z piór	72045-30
37% formaldehyd lub paraformaldehyd	Fisher Scientific	BP531-500
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Boston Bioproducts	BM-220
18x18 mm szkiełka nakrywkowe numer 1.5	VWR	48366 205
Lakier do paznokci	Mikroskopia elektronowa Sciences	72180
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100 ml
Metanol	Fisher Scientific	A412-4
Aceton	Fisher Scientific	A949-1
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T9284-100ML
BSA	Jackson ImmunoResearch	001-000-162
RNAzyca A	5 prime	2900142
Bibuła filtracyjna	Whatman	1001-055
Grawer do szkła	Dremel	290-01
TCS SP5 Mikroskop konfokalny	Leica
Nośnik montażowy	Electron Nauki mikroskopowe	17985-10
Komora wilgotnościowa barwienia immunologicznego, Nauki o mikroskopii czarnych	elektronów	62010-37
Szklany słoik do barwienia z kopliny, zakrętka	Mikroskopia elektronowa Nauki	70315