Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Summary

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Abstract

Hodowla tkankowa była nieocenionym narzędziem do badania wielu aspektów funkcjonowania komórek, od normalnego rozwoju po choroby. Konwencjonalne metody hodowli komórkowej opierają się na zdolności komórek do przyłączania się do stałego podłoża naczynia do hodowli tkankowej lub do wzrostu w zawiesinie w płynnym podłożu. Stworzono i wyhodowano wiele nieśmiertelnych linii komórkowych przy użyciu takich podejść, jednak metody te często zawodzą, gdy komórki pierwotne muszą być hodowane ex vivo. Takie niepowodzenie przypisuje się brakowi odpowiednich składników macierzy zewnątrzkomórkowej mikrośrodowiska tkankowego w standardowych systemach, w których plastik do hodowli tkankowych jest używany jako powierzchnia do wzrostu komórek. Macierz zewnątrzkomórkowa jest integralnym składnikiem mikrośrodowiska tkankowego, a jej obecność ma kluczowe znaczenie dla utrzymania funkcji fizjologicznych, takich jak polaryzacja komórek, przeżycie i proliferacja. W artykule przedstawiono metodę trójwymiarowej hodowli tkankowej, w której pierwotne komórki szpiku kostnego są hodowane w macierzy zewnątrzkomórkowej opracowanej w celu podsumowania mikrośrodowiska ludzkiej kości (system rBM). Osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej komórki są zaopatrywane w składniki odżywcze przez pożywkę uzupełnioną ludzkim osoczem, zapewniając w ten sposób kompleksowy system, w którym przeżycie i proliferacja komórek mogą być utrzymane do 30 dni przy zachowaniu składu komórkowego tkanki pierwotnej. Za pomocą systemu rBM udało nam się wyhodować pierwotne komórki szpiku kostnego od zdrowych dawców oraz pacjentów z amyloidozą i różnymi nowotworami hematologicznymi. System rBM pozwala na bezpośrednią wizualizację w czasie rzeczywistym w matrycy zachowania komórek i ocenę skuteczności przedklinicznej nowych środków terapeutycznych. Co więcej, komórki można wyizolować z rBM, a następnie wykorzystać do przeszczepu in vivo, sortowania komórek, cytometrii przepływowej oraz analizy kwasów nukleinowych i białek. Podsumowując, metoda rBM zapewnia niezawodny system wzrostu pierwotnych komórek szpiku kostnego w warunkach fizjologicznych.

Introduction

Hodowla tkankowa została opracowana do badania zachowania komórek w kontrolowanym środowisku, aby zminimalizować zmienność systemową podczas porównywania różnych procesów w nienaruszonych organizmach. Metoda ta została po raz pierwszy opracowana na początku 1900^{roku 1,2} i odnosi się do techniki, w której eksplantaty tkanek były hodowane ex vivo w szklanym naczyniu. W połowie XX wieku system został przystosowany do hodowli rozproszonych komórek, a nie fragmentów nienaruszonych tkanek, a terminy "hodowla tkankowa" i "hodowla komórkowa" stały się^synonimami. W takich konwencjonalnych systemach hodowli komórkowych komórki są hodowane na powie....

Protocol

1. Przygotowanie z wyprzedzeniem

1. Sterylne pipety serologiczne i końcówki do pipet należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
   Rozwiązywanie problemów: Matrigel żele w temperaturze pokojowej (RT); używanie zimnych pipet i końcówek zapobiegnie żelowaniu Matrigel podczas ustawiania hodowli.
2. Rozmrozić butelkę Matrigel w temperaturze 4 °C przez noc.

2. Przygotowanie odczynników

1. Przygotowanie roztworu podstawowego fibronektyny: Przygotować roztwór podstawowy fibronektyny o stężeniu 1 mg/ml, rozpuszczając 100 mg ludzkiej fibronektyny w 100 ml wody destylowanej. Po rozpuszczeniu fibronek....

Results

Ponieważ pierwotne komórki szpiku kostnego nie rozwijają się w standardowych warunkach hodowli tkankowej, system rBM został stworzony, aby ściśle naśladować mikrośrodowisko kości, zapewniając system do hodowli i ekspansji komórek BM ex vivo. Główne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej BM, fibronektyna, kolagen I, kolagen IV i laminina²¹, zostały włączone do macierzy rBM, aby zapewnić strukturalne rusztowanie dla tej kultury 3D. Endosteum, interfejs między kością a BM, bogaty w kolagen I i fibronektyn.......

Discussion

Model rBM zapewnia kompleksowy system, w którym skład komórkowy BM jest utrzymywany ex vivo przez okres do 30 dni. Komórki BM hodowane w rBM samostratyfikują się zgodnie ze swoją funkcją, ściśle naśladując architekturę BM znalezioną in vivo. Co więcej, jest to pierwszy system, który pozwala na ekspansję klonu szpiczaka mnogiego⁸. Najbardziej krytycznymi etapami zapewniającymi solidny wzrost komórek BM i ogólny sukces hodowli są: 1) uzyskanie zdrowej populacji komórek BM o żywotności >70% i w .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw do proliferacji CellTrace CFSE do cytometrii przepływowej	Invitrogen/Life Technologies	C34554
Fibronektyna z ludzkiego osocza	Millipore
Ficoll-Paque PLUS	GE Lifesciences	17-1440-02
Matrigel matryca błony podstawnej	BD Biosciences	354234
Kolagen z ogona szczura typu I	BD Biosciences	354249	Collagen I firmy Millipore nie polimeryzuje prawidłowo przy użyciu tego protokołu
VECTASHIELD Podłoże montażowe VECTASHIELD do fluorescencji (zestaw regularny)	Vector Laboratories	H-1000
SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tabletki	Sigma-Aldrich	F4648	Do barwienia TRAP
Tabletki SigmaFast BCIP/NBT	Sigma-Aldrich	B5655	Do barwienia fosfatazą alkaliczną
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 510	Oprogramowanie Carl Zeiss
Zeiss 510	Oprogramowanie Carl Zeiss		Oprogramowanie do analizy obrazu do analizy konfokalnej
Mikroskop odwrócony Zeiss Axiovert 200M	Oprogramowanie Carl Zeiss
MetaMorph		molekularne	Axiovert 200M
FACSort	Oprogramowanie BD Biosciences
CellQuest Pro	BD Biosciences		Oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej