Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

DOI:

10.3791/50947

⸱

8 marca 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Oncology, University of Alberta, 3Cross Cancer Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla tkankowa była nieocenionym narzędziem do badania wielu aspektów funkcjonowania komórek, od normalnego rozwoju po choroby. Konwencjonalne metody hodowli komórkowej opierają się na zdolności komórek do przyłączania się do stałego podłoża naczynia do hodowli tkankowej lub do wzrostu w zawiesinie w płynnym podłożu. Stworzono i wyhodowano wiele nieśmiertelnych linii komórkowych przy użyciu takich podejść, jednak metody te często zawodzą, gdy komórki pierwotne muszą być hodowane ex vivo. Takie niepowodzenie przypisuje się brakowi odpowiednich składników macierzy zewnątrzkomórkowej mikrośrodowiska tkankowego w standardowych systemach, w których plastik do hodowli tkankowych jest używany jako powierzchnia do wzrostu komórek. Macierz zewnątrzkomórkowa jest integralnym składnikiem mikrośrodowiska tkankowego, a jej obecność ma kluczowe znaczenie dla utrzymania funkcji fizjologicznych, takich jak polaryzacja komórek, przeżycie i proliferacja. W artykule przedstawiono metodę trójwymiarowej hodowli tkankowej, w której pierwotne komórki szpiku kostnego są hodowane w macierzy zewnątrzkomórkowej opracowanej w celu podsumowania mikrośrodowiska ludzkiej kości (system rBM). Osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej komórki są zaopatrywane w składniki odżywcze przez pożywkę uzupełnioną ludzkim osoczem, zapewniając w ten sposób kompleksowy system, w którym przeżycie i proliferacja komórek mogą być utrzymane do 30 dni przy zachowaniu składu komórkowego tkanki pierwotnej. Za pomocą systemu rBM udało nam się wyhodować pierwotne komórki szpiku kostnego od zdrowych dawców oraz pacjentów z amyloidozą i różnymi nowotworami hematologicznymi. System rBM pozwala na bezpośrednią wizualizację w czasie rzeczywistym w matrycy zachowania komórek i ocenę skuteczności przedklinicznej nowych środków terapeutycznych. Co więcej, komórki można wyizolować z rBM, a następnie wykorzystać do przeszczepu in vivo, sortowania komórek, cytometrii przepływowej oraz analizy kwasów nukleinowych i białek. Podsumowując, metoda rBM zapewnia niezawodny system wzrostu pierwotnych komórek szpiku kostnego w warunkach fizjologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla tkankowa została opracowana do badania zachowania komórek w kontrolowanym środowisku, aby zminimalizować zmienność systemową podczas porównywania różnych procesów w nienaruszonych organizmach. Metoda ta została po raz pierwszy opracowana na początku 1900roku 1,2 i odnosi się do techniki, w której eksplantaty tkanek były hodowane ex vivo w szklanym naczyniu. W połowie XX wieku system został przystosowany do hodowli rozproszonych komórek, a nie fragmentów nienaruszonych tkanek, a terminy "hodowla tkankowa" i "hodowla komórkowa" stały sięsynonimami. W takich konwencjonalnych systemach hodowli komórkowych komórki są hodowane na powierzchni plastiku hodowli tkankowej, pokrytego pożywką wzrostową uzupełnioną różnymi czynnikami wzrostu. Pojawiły się dwa rodzaje kultur w oparciu o zdolność adhezyjną różnych komórek: adherentna hodowla komórkowa, w której komórki przyczepiają się i rozprzestrzeniają na plastikowej kulturze tkankowej oraz kultury nieprzylegające, w których komórki rozmnażają się w zawiesinie. Od początków hodowli komórkowej powstało wiele nieśmiertelnych linii komórkowych, takich jak HeLa4, pierwsza ludzka linia komórek rakowych. Te linie komórkowe mają zdolność do rozmnażania się w nieskończoność w hodowli komórkowej, a większość z nich nie wymaga żadnego specjalnego traktowania, aby utrzymać żywotność.

Redukcjonistyczne podejście oryginalnych metod hodowli komórkowych zostało zaprojektowane tak, aby maksymalnie uprościć system, włączając tylko minimum składników wymaganych do utrzymania żywotności i proliferacji komórek. Jednak uproszczone metody hodowli komórkowych nie są w stanie obsłużyć ex vivo większości pierwotnych typów komórek ludzkich o ograniczonej długości życia. W związku z tym projektowane są nowe systemy hodowli, które mają jak najbardziej zbliżyć mikrośrodowisko tkanek, umożliwiając w ten sposób wzrost eksplantatów komórkowych w warunkach fizjologicznych. W przeciwieństwie do konwencjonalnych/redukcjonistycznych podejść do hodowli komórkowych, trójwymiarowe (3D) systemy hodowli stają się obecnie preferowaną metodą wydajnej hodowli różnych ludzkich linii komórkowych i komórek pierwotnych w celu późniejszego badania mechanizmów związanych ze zdrowiem i chorobą, w kontekście wspierającego mikrośrodowiska. Takie systemy 3D są zwykle tworzone przy użyciu zrekonstruowanych matryc i/lub pożywki uzupełnionej czynnikami wzrostu, w celu podsumowania mikrośrodowiska tkankowego w celu zbadania typów komórek będących przedmiotem zainteresowania. Pierwszy z tych trójwymiarowych (3D) modeli hodowli został opracowany w celu zbadania rozwoju gruczołu sutkowego. Aby zapewnić komórkom warunki natywne, komórki nabłonka sutka zostały osadzone w Matrigel, kolagenie IV i bogatym w lamininę źródle macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i pokryte pożywką wzrostową. W takich warunkach komórki nabłonka sutka tworzyły skupiska przypominające aciny sutkowe, a po stymulacji hormonami laktogennymi te acini wydzielały kazeinę i inne białka mleka do pustej prześwity struktur podobnych do acini. Wydzielanie kazeiny nie obserwowano w standardowych hodowlach nawet po dodaniu prolaktyny5, co dodatkowo podkreśla rolę mikrośrodowiska w zachowaniu cech morfologicznych i fenotypowych komórek. Innym dowodem na utratę normalnych funkcji komórkowych, gdy komórki są wyjmowane z kontekstu ich fizjologicznego mikrośrodowiska, jest wykazanie, że bez wspierającego mikrośrodowiska keratynocyty nie tworzą warstwowego naskórka6. Stworzono szereg innych modeli 3D, aby umożliwić rozmnażanie ex vivo komórek pierwotnych7,8 .

Kluczowa rola mikrośrodowiska w zachowaniu komórek została elegancko zademonstrowana w badaniu, w którym komórki nabłonka sutka tworzyły acini "od wewnątrz na zewnątrz" podczas hodowli w matrycy kolagenu I, w porównaniu do prawidłowo spolaryzowanych acini, które powstały w Matrigel. Ta utrata prawidłowej morfologii została odwrócona, gdy komórki mioepitelialne wytwarzające lamininę zostały dodane do kultur kolagenu I9. Co więcej, do prawidłowej manifestacji genotypu wymagane jest prawidłowe mikrośrodowisko. Wyhodowane w naczyniu komórki raka piersi MCF7 transfekowane cząsteczką adhezyjną komórka-komórka CEACAM1 zachowują się dokładnie tak samo, jak nietransfekowane komórki ujemne CEACAM. Jednak podczas hodowli w Matrigel, w kontakcie z ECM, MCF7 typu dzikiego tworzy struktury podobne do guza, podczas gdy komórki MCF7 transfekowane CEACAM1 powrócić do normalnego fenotypu i tworzą acini z pustą światłową, jak ustalono w przypadku niezłośliwego nabłonka sutka10. Podobnie, blokowanie β1-integryny w komórkach raka piersi nie zmienia ich zachowania w standardowych warunkach hodowli, ale ten sam eksperyment przeprowadzony w hodowlach 3D pokazuje, że blokowanie β1-integryny przywraca złośliwe komórki do normalnego fenotypu11. Dlatego mikrośrodowisko tkankowe jest wymagane nie tylko do utrzymania żywotności komórek, ale także do utrzymania ich prawidłowego funkcjonowania.

Oprócz dostarczania systemu, w którym można badać zachowanie komórek w warunkach fizjologicznych, hodowle 3-D funkcjonują jako solidne i niezawodne podłoże do przedklinicznych testów nowych terapii8,12,13. Hodowla komórek w 3D umożliwia badania przesiewowe badanych związków w warunkach oporności na leki za pośrednictwem środowiska14, gdzie można ocenić udział adhezji komórka-komórka i komórka-ECM. Co więcej, toksyczność nowych związków poza celem można stwierdzić poprzez włączenie wielu przedziałów komórkowych różnych tkanek. Takie badania przesiewowe mogą być wykonywane szybciej i są bardziej opłacalne niż porównywalne badania in vivo8.

Tutaj prezentujemy konfigurację modelu 3D zrekonstruowanego szpiku kostnego (rBM), gdzie normalne i złośliwe komórki szpiku kostnego (BM) namnażają się ex vivo w systemie ściśle naśladującym mikrośrodowisko ludzkiego szpiku kostnego. Dotychczasowe próby hodowli pierwotnych ludzkich komórek BM w hodowlach 2D, płynnych lub przylegających kokulturach z różnymi składnikami zrębu BM lub 3-D, półstałych kulturach agarowych spotkały się z ograniczonym sukcesem ze względu na ich niezdolność do zaopatrywania komórek w składniki mikrośrodowiska tkankowego15-18. W tych systemach pierwotne komórki BM miały słabą żywotność i nie rozwijały się ex vivo. Innym systemem, w którym ludzkie komórki progenitorowe BM są hodowane w sferoidalnych kokulturach z komórkami zrębu BM, jest system 3D, w którym żywotność i proliferacja hematopoetycznych komórek macierzystych utrzymywała się przez co najmniej 96godzin. Jednak, chociaż system ten jest bardzo korzystny dla zrozumienia biologii układu krwiotwórczego, nie oddaje wiernie mikrośrodowiska BM ze względu na brak komponentów ECM, co ogranicza jego użyteczność. Opisany tutaj model rBM przedstawia kompleksowy system, w którym zarówno komórkowe, jak i zewnątrzkomórkowe przedziały ludzkiego BM są rekonstruowane in vitro. Wykazaliśmy, że hodowle rBM mogą wspierać wzrost ex vivo normalnych ludzkich komórek BM, a także komórek wyizolowanych od pacjentów z różnymi zaburzeniami hematologicznymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie z wyprzedzeniem

  1. Sterylne pipety serologiczne i końcówki do pipet należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
    Rozwiązywanie problemów: Matrigel żele w temperaturze pokojowej (RT); używanie zimnych pipet i końcówek zapobiegnie żelowaniu Matrigel podczas ustawiania hodowli.
  2. Rozmrozić butelkę Matrigel w temperaturze 4 °C przez noc.

2. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotowanie roztworu podstawowego fibronektyny: Przygotować roztwór podstawowy fibronektyny o stężeniu 1 mg/ml, rozpuszczając 100 mg ludzkiej fibronektyny w 100 ml wody destylowanej. Po rozpuszczeniu fibronektyny przefiltrować jałowo i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
    Rozwiązywanie problemów: Jeśli fibronektyna nie rozpuści się szybko, inkubuj roztwór przez kilka minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  2. Przygotowanie 10x PBS: W 1 l wody destylowanej rozpuścić 80 g chlorku sodu NaCl, 14,4 g Na2HPO4, 2 g KCl i 2,4 g KH2PO4 w 1 l wody destylowanej. Ustaw pH na 7,4, sterylny filtr i przechowuj w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
  3. Przygotowanie buforu neutralizacyjnego20: Przygotować roztwór zawierający 100 mM HEPES w 2x buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) przy użyciu 1 M HEPES i 10 x PBS roztworów podstawowych. Doprowadzić pH roztworu do 7,0. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-3 miesiące.
  4. Przygotowanie roztworu 2 mg/ml kolagenu z ogona szczura typu I: Przygotować roztwór kolagenu I o stężeniu 2 mg/ml w buforze neutralizacyjnym (krok 2.3). Zmieszać roztwór z małą prędkością i delikatnie wymieszać, pipetując w górę iw dół. Ponieważ kolagen ten jest bardzo lepki, należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas pipetowania. Zaleca się, aby za każdym razem przygotowywać świeży roztwór kolagenu I. Roztwór należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
  5. Przygotowanie powłoki śródkostnej (rEnd): Wymieszać 1 mg/ml bulionu fibronektyny z 2 mg/ml kolagenu I (kroki 2.1 i 2.4) do końcowego stężenia odpowiednio 77 μg/ml i 29 μg/ml w 1x sterylnym PBS. Wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  6. Opracowanie zrekonstruowanej macierzy kostnej (rBM):
    1. Wstępnie schłodzić probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml na lodzie. Utrzymuj wszystkie roztwory matrycy na lodzie przez cały czas.
    2. Wymieszać 4 części Matrigelu (stężenie Matrigelu różni się w zależności od partii, ale stwierdzono, że różnice są nieistotne), 2,5 części 1 mg/ml fibronektyny i 1 część 2 mg/ml kolagenu I na lodzie, najpierw pipetując Matrigel do probówki za pomocą zimnych końcówek pipet, a następnie dodając fibronektynę i kolagen I. Matrigel zacznie krzepnąć w temperaturach powyżej 4 °C, dlatego należy pracować szybko podczas pipetowania Matrigel. Matrycę należy mieszać bardzo delikatnie, pipetując w górę i w dół, unikając wprowadzania pęcherzyków. Trzymaj probówki na lodzie podczas mieszania rBM.
  7. Przygotowanie pożywki do pomiaru szpiku kostnego (BMGM): Przygotować 500 ml BMGM zawierającego 6,2 x 10-4 M CaCl2, 10-6 M bursztynianu sodu, 10-6 M hydrokortyzonu, 20% osocza ludzkiego (normalnego lub złośliwego pobranego od zdrowych dawców lub pacjentów) i 1% penicyliny/streptomycyny w RPMI-1640. CaCl2, bursztynian sodu i suplementy hydrokortyzonu mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez >6 miesięcy w postaci 1000 roztworów podstawowych. Podczas hodowli linii komórkowych płodową surowicę bydlęcą (FBS) można zastąpić ludzkim osoczem.
  8. Przygotowanie 10% neutralnej buforowanej formaliny (NBF): Dodać 37% roztworu podstawowego formaldehydu do 1x PBS przy 10% v/v. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 2-3 tygodnie w chronić przed światłem.
  9. Przygotowanie 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA): Zważyć odpowiednią ilość BSA i rozpuścić ją w 1x PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 tygodnia. Roztwór BSA ma tendencję do zanieczyszczenia, jeśli jest przechowywany w lodówce przez dłuższy czas. Alternatywnie, roztwór BSA można podzielić na porcje i zamrozić w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania.
  10. Przygotowanie roztworu do odzyskiwania komórek (CRS): Przygotować 5 mM EDTA, 1 mM roztworu wanadanu sodu (Na3VO4) i 1,5 mM roztworu fluorku sodu (NaF) w 1x PBS. Sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.

3. Wbudowana hodowla 3D niezłośliwych i złośliwych ludzkich komórek BM

  1. Oczyść pierwotne komórki jednojądrzaste BM przez wirowanie gradientowe Ficoll-Plaque zgodnie z instrukcjami producenta.
    Opcjonalny krok: komórki można znakować dioctanem karboksyfluoresceiny 0,25 μM, estrem sukcynimidylu (CFSE) zgodnie z instrukcjami producenta, aby śledzić proliferację komórek przez cały okres hodowli.
    Rozwiązywanie problemów: Jeśli komórki umrą po barwieniu CFSE, należy miareczkować ilość CFSE, ponieważ stężenie zależy od typu komórki; 0,25 μM działa dobrze w przypadku pierwotnych komórek jednojądrzastych BM.
  2. Dodać 65 μl roztworu rEnd do każdego dołka na 48-dołkowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych. Rozprowadzić roztwór równomiernie, aby pokryć całą powierzchnię studzienki i inkubować przez >30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować zawiesinę komórek o gęstości 0,5 x 106 komórek w 10 μl 1x PBS na dołek na płytkę 48-dołkową. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wymieszać zawiesinę komórek ze 100 μl matrycy rBM na studzienkę. Wymieszaj komórki i matrycę rBM, delikatnie pipetując w górę iw dół; Unikaj wprowadzania bąbelków. Mieszaninę komórek/matryc należy przechowywać na lodzie, aby uniknąć zżelowania matrycy.
    Uwaga: system rBM jest w pełni skalowalny; Aby skonfigurować system w formacie innym niż 48-dołkowy, dostosuj ilości wszystkich odczynników (matryc i pożywki) w oparciu o powierzchnię użytej płytki. Odpowiednio przeskaluj liczbę komórek, które mają zostać posiane.
  4. Odessać pozostały rEnd i dodać mieszaninę komórka/matryca do środka studzienki. Szybko rozprowadź mieszaninę komórek/matryc, aby równomiernie pokryć całą powierzchnię studzienki. Umieścić płytkę na 30-60 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aby umożliwić zestalenie się matrycy. Nie potrząsać ani nie naruszać płytki podczas inkubacji.
    Rozwiązywanie problemów: Aby zapobiec nierównomiernemu rozmieszczeniu komórek w rBM, dobrze wymieszaj przed posiewem. Wymieszaj po każdych 5dobrze posianych, aby uniknąć osiadania komórek na dnie probówki. Po platerowaniu komórki nie opadają na dno studzienki z powodu napięcia powierzchniowego w matrycy.
    Rozwiązywanie problemów: Aby zapobiec nierównomiernemu rozmieszczeniu komórek w rBM, dobrze wymieszaj przed posiewem. Wymieszaj po każdych 5dobrze posianych, aby uniknąć osiadania komórek na dnie probówki. Po platerowaniu komórki nie opadają na dno studni z powodu napięcia powierzchniowego w matrycy.
  5. Podgrzej BMGM w łaźni wodnej ustawionej na 37 °C.
  6. Po 30 minutach sprawdź, czy matryca jest prawidłowo ustawiona; utworzy miękką warstwę przypominającą żel, która nie przesuwa się, gdy płytka jest przechylona. Na warstwę komórka/matryca nałożyć 1 ml ciepłego BMGM. Aby uniknąć rozerwania matrycy, należy bardzo delikatnie pipetować pożywkę (dozując kropla po kropli) za pomocą pipety serologicznej. Zmontowaną kulturę rBM umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i hodować przez żądany okres czasu.
    Uwaga: żywotność komórek utrzymuje się przez co najmniej 30 dni bez zmiany pożywki; Jeśli wymagana jest wymiana podłoża, za każdym razem zmieniaj tylko 50% podłoża.
    Krok krytyczny: Bardzo ważne jest, aby podłoże nie było zimne, ponieważ niska temperatura może zakłócić już ustawioną matrycę. Uważaj, aby nie spryskać pożywki na wierzch matrycy, ponieważ może to spowodować zerwanie miękkiej warstwy matrycy.
    Rozwiązywanie problemów: Jeśli żywotność komórek w systemie rBM jest niska, może być konieczne eksperymentalne określenie gęstości komórek podczas pracy z komórkami innymi niż pierwotne komórki jednojądrzaste z aspiratów BM. Podczas pracy z liniami komórkowymi zmniejsz liczbę komórek 10-krotnie, ponieważ unieśmiertelnione linie komórkowe rozmnażają się szybciej niż komórki pierwotne.

4. Obrazowanie 'w matrycy'

  1. Mikroskopia świetlna
    1. Obrazuj hodowane komórki bezpośrednio w rBM za pomocą jasnego pola, różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), konfokalnego lub innych technik obrazowania, które umożliwiają obrazowanie na duże odległości, ponieważ matryca ma grubość około 1 mm. Użyj funkcji Z-stack dostępnej w wielu mikroskopach, aby zobrazować całą kulturę od góry do dołu.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne
    napiwek: W przypadku poniższego protokołu barwienia immunologicznego należy unikać zasysania roztworów barwiących/myjących, zamiast tego przechylić płytkę i usunąć roztwory za pomocą pipety.
    1. Usunąć BMGM za pomocą pipety i przemyć 2-3 razy 100 μl/płukanie/studzienkę RT 1x PBS. Upewnij się, że użyto wystarczającej ilości PBS, aby pokryć całą powierzchnię studni.
    2. Utrwalić komórki w matrycy, dodając 100 μl/basenik (dla płytki 48-dołkowej) 10% NBF przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć NBF i dwukrotnie przemyć komórki 100 μl/płukanie/studzienkę RT 1x PBS.
      nuta: Unikaj używania zimnego NBF, ponieważ może to spowodować upłynnienie matrycy.
    3. Usunąć PBS, dodać 1% BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc w celu zablokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał.
    4. Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciał w 1% BSA w wymaganym rozcieńczeniu. Rozcieńczenie będzie się różnić dla każdego przeciwciała, skontaktuj się z producentem lub miareczkować, aby określić optymalne stężenie przeciwciał. Dodać 100 μl/basenik roztworu przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować zgodnie z instrukcjami producenta.
      Krok krytyczny: Wszystkie inkubacje z udziałem przeciwciał sprzężonych z fluoroforami lub barwnikami fluorescencyjnymi powinny być przeprowadzane w ciemności.
    5. Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć 3x 1x PBS przez 5 min.
    6. W przypadku pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego inkubować z drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z sondą fluorescencyjną przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć przeciwciała w 1% BSA w stężeniu sugerowanym przez producenta.
    7. Usunąć roztwór przeciwciał drugorzędowych i przemyć 3x 1x PBS przez 5 min.
      Rozwiązywanie problemów: Aby uniknąć wysokiego tła podczas obrazowania, miareczkować fluorescencyjnie sprzężone przeciwciała drugorzędowe i stosować najniższe stężenie, które zapewnia odpowiedni sygnał. Jeśli wysokie tło nadal stanowi problem, zwiększ liczbę i czas trwania etapów płukania lub użyj bezpośrednio sprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych i pomiń krok 4.2.6.
    8. Aby zabarwić jądra, dodać roztwór do barwienia jądrowego 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) w rozcieńczeniu sugerowanym przez producenta i inkubować przez 7-10 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Usuń jądrowy roztwór barwiący i przemyj 2x 1x PBS przez 5 min.
    10. Usunąć PBS z ostatniego prania i dodać kroplę pożywki montażowej (regularny zestaw) na próbkę, aby zachować fluorescencję. Obraz przy użyciu odpowiednich ustawień wzbudzenia/emisji w mikroskopie fluorescencyjnym lub konfokalnym.
      nuta: Obrazowanie należy wykonać w ciągu 2 dni od barwienia, aby uniknąć degradacji matrycy i utraty integralności rBM oraz utraty sygnału fluorescencyjnego. W przypadku niezobrazowania natychmiast, barwione próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem, aż do momentu obrazowania.

5. Izolacja komórek od rBM

  1. Delikatnie usuń podłoże, nie naruszając warstwy matrycy. Nie aspirować.
  2. Umyj komórki 2x sterylnym 1x PBS. Nie aspirować.
  3. Dodać 0,5 ml lodowatego CRS do każdego dołka i usunąć całą warstwę matrycy wraz z komórkami, energicznie pipetując w górę iw dół. Zebrać komórki, matrycę i CRS w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Ułóż na lodzie.
  4. Dodaj dodatkowe 0,5 ml CRS do tej samej studzienki i zbierz cały pozostały materiał. Przenieść do tej samej probówki do mikrowirówki.
  5. Wirować mieszaninę komórek, matrycy i CRS i inkubować na lodzie przez 1 godzinę. Wirować komórki co 15 minut, aby ułatwić uwolnienie z matrycy.
  6. Sprawdź mieszaninę po 1 godzinie, nie powinny być widoczne grudki matrycy.
    Rozwiązywanie problemów: jeśli po 1 godzinie nadal widoczne są grudki matrycy, przenieś komórki/matrycę/mieszaninę CRS do większej probówki, dodaj dodatkowe 2-5 ml CRS i inkubuj przez dodatkowe 30-60 minut.
  7. Odwirować komórki w CRS z prędkością 1 000 obr./min przez 5-10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml zimnego 1x PBS.
  8. Wirować z prędkością 1 000 obr./min przez 5-10 minut i usunąć supernatant. Powtórz pranie PBS jeszcze raz.
  9. Drugie płukanie PBS kończy odzyskiwanie komórek z macierzy, a izolowane komórki mogą być wykorzystywane do dowolnych dalszych zastosowań, takich jak izolacja DNA/RNA/białka, cytometria przepływowa, przeszczep in vivo itp.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ pierwotne komórki szpiku kostnego nie rozwijają się w standardowych warunkach hodowli tkankowej, system rBM został stworzony, aby ściśle naśladować mikrośrodowisko kości, zapewniając system do hodowli i ekspansji komórek BM ex vivo. Główne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej BM, fibronektyna, kolagen I, kolagen IV i laminina21, zostały włączone do macierzy rBM, aby zapewnić strukturalne rusztowanie dla tej kultury 3D. Endosteum, interfejs między kością a BM, bogaty w kolagen I i fibronektyn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model rBM zapewnia kompleksowy system, w którym skład komórkowy BM jest utrzymywany ex vivo przez okres do 30 dni. Komórki BM hodowane w rBM samostratyfikują się zgodnie ze swoją funkcją, ściśle naśladując architekturę BM znalezioną in vivo. Co więcej, jest to pierwszy system, który pozwala na ekspansję klonu szpiczaka mnogiego8. Najbardziej krytycznymi etapami zapewniającymi solidny wzrost komórek BM i ogólny sukces hodowli są: 1) uzyskanie zdrowej populacji komórek BM o żywotności >70% i w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantów z National Institutes of Health, National Cancer Institute (1R21CA141039), BD Biosciences Research Grant Award, American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG #58-006-53), dla Purdue University Center for Cancer Research, oraz Canadian Institutes of Health Research i Alberta Cancer Board Research Initiatives Program. M.P. był wspierany przez National Institutes of Health, National Cancer Institute, Program Stażowy w Profilaktyce Raka (R25CA128770; Kierownik projektu: D. Teegarden) zarządzany przez Centrum Nauk Onkologicznych i Centrum Badań nad Uczeniem się przez Odkrywcę na Uniwersytecie Purdue.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do proliferacji CellTrace CFSE do cytometrii przepływowejInvitrogen/Life TechnologiesC34554
Fibronektyna z ludzkiego osoczaMillipore
Ficoll-Paque PLUSGE Lifesciences17-1440-02
Matrigel matryca błony podstawnejBD Biosciences354234
Kolagen z ogona szczura typu IBD Biosciences354249Collagen I firmy Millipore nie polimeryzuje prawidłowo przy użyciu tego protokołu
VECTASHIELD Podłoże montażowe VECTASHIELD do fluorescencji (zestaw regularny)Vector LaboratoriesH-1000
SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tabletkiSigma-AldrichF4648Do barwienia TRAP
Tabletki SigmaFast BCIP/NBTSigma-AldrichB5655Do barwienia fosfatazą alkaliczną
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 510 Oprogramowanie Carl Zeiss
Zeiss 510Oprogramowanie Carl ZeissOprogramowanie do analizy obrazu do analizy konfokalnej
Mikroskop odwrócony Zeiss Axiovert 200M Oprogramowanie Carl Zeiss
MetaMorphmolekularneAxiovert 200M
FACSort Oprogramowanie BD Biosciences
CellQuest Pro BD BiosciencesOprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej
NG1884448 Urządzenia Oprogramowanie do analizy obrazu dla cytometru przepływowego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
  2. Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
  3. Earle, W. R. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).
  4. Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).
  5. Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane. Development. 105, 223-227 (1989).
  6. Lamb, R., Ambler, C. A. Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model. PloS One. 8, (2013).
  7. Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion. Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).
  8. Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
  9. Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).
  10. Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).
  11. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
  12. Gunn, E. J., et al. The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).
  13. Hsiao, A. Y., et al. 384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids. Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).
  14. Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease. Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).
  15. Golde, D. W., Cline, M. J. Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture. Blood. 41, 45-57 (1973).
  16. Gartner, S., Kaplan, H. S. Long-Term Culture of Human-Bone Marrow-Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. Biol. 77, 4756-4759 (1980).
  17. Caligaris-Cappio, F., et al. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood. 77, 2688-2693 (1991).
  18. Pike, B. L., Robinson, W. A. Human bone marrow colony growth in agar-gel. J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).
  19. Bug, G., et al. Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells. J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).
  20. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, (2006).
  21. Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pierwotny szpik kostnymacierz szpiku kostnegomacierz zewn trzkom rkowaizolacja kom rekcytometria przep ywowamikroskopia wietlnasortowanie kom rekanaliza kwas w nukleinowychanaliza bia ek

Powiązane artykuły