Artykuł metodologiczny

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

19.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50951

⸱

19 września 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Neurology, Hertie Institute for Clinical Brain Research, 2Institute of Pharmacology, University of Bern, 3Department of Immunology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Clinic Tuebingen, 5Department of Neurology, University Hospital Erlangen

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Streszczenie

W tym protokole udostępniamy metodę izolacji komórek dendrytycznych (DC) i komórek nabłonkowych (TEC) z ludzkiej grasicy. DC i TEC są głównymi typami komórek prezentujących antygen (APC) występującymi w normalnej grasicy i dobrze wiadomo, że odgrywają one różne role podczas selekcji grasicy. Komórki te są zlokalizowane w różnych mikrośrodowiskach w grasicy, a każdy typ APC stanowi tylko niewielką populację komórek. Aby lepiej zrozumieć biologię tych typów komórek, charakterystyka tych populacji komórek jest wysoce pożądana, ale ze względu na ich niską częstotliwość, izolacja któregokolwiek z tych typów komórek wymaga wydajnej i powtarzalnej procedury. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę uzyskiwania komórek odpowiednich do charakterystyki różnych właściwości komórkowych. Tkanka grasicy ulega mechanicznemu rozerwaniu, a po różnych etapach trawienia enzymatycznego powstała zawiesina komórkowa jest wzbogacana za pomocą etapu wirowania o gęstości Percoll. W celu wyizolowania szpiku DC (CD11c+) komórki z frakcji o niskiej gęstości (LDF) są poddawane immunoselekcji przez magnetyczne sortowanie komórek. Wzbogacenie populacji TEC (mTEC, cTEC) osiąga się poprzez zubożenie komórek krwiotwórczych (CD45hi) z frakcji komórek Percollu o niskiej gęstości, umożliwiając ich późniejszą izolację poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) przy użyciu określonych markerów komórkowych. Izolowane ogniwa mogą być wykorzystywane do różnych dalszych zastosowań.

Wprowadzenie

Grasica jest organem, w którym zachodzi rozwój limfocytów T. Jego względny i bezwzględny rozmiar zmniejsza się wraz z wiekiem, gdy jest sukcesywnie zastępowany przez tłuszcz, chociaż aktywność grasicy można jeszcze wykryć w starszym wieku. Jego znaczenie dla odpowiedzi immunologicznej wykazano na początku lat 60. XXwieku1.

Repertuar limfocytów T jest kształtowany poprzez interakcję receptorów limfocytów T z kompleksami peptyd-MHC na różnych rodzajach grasicy, które dostarczają wskazówek o przeżyciu lub śmierci rozwijającym się limfocytom T, co skutkuje funkcjonalnym i w dużej mierze samotolerancyjnym repertuarem limfocytów T2.

Około 98% komórek w ludzkiej grasicy rozwija limfocyty T zwane tymocytami. Pozostałe 2% składa się z wielu różnych typów komórek, w tym różnych TEC (korowych, rdzeniowych, podtorebkowych), szpikowych i plazmocytoidalnych DC (mDC, pDC), makrofagów, limfocytów B, dojrzałych recyrkulujących limfocytów T, granulocytów, fibroblastów, komórek śródbłonka i bardzo rzadkich komórek nabłonkowych o fenotypie ekspresji przypominającym fenotyp komórek z innych tkanek, takich jak mięśnie, neurony i nabłonek oddechowy (ryc. 1). Spośród nich TEC i DC są głównymi typami APC występującymi w normalnej grasicy. W ostatnich latach coraz większe zainteresowanie cieszy się oczyszczaniem tych typów APC do hodowli i profilowania molekularnego. Ze względu na ich niską częstotliwość, izolacja któregokolwiek z tych typów komórek w celu szczegółowej analizy wymaga wydajnej, powtarzalnej i opłacalnej procedury. Przedstawiona metoda jest modyfikacją wcześniej opublikowanych badań3,4.

Podobnie jak w przypadku każdej innej tkanki, ekstrakcja komórek z grasicy może być osiągnięta poprzez enzymatyczną dezagregację sieci interakcji komórka-komórka i komórka-matryca, w celu uzyskania zawieszenia pojedynczych komórek. Istnieją pewne parametry, takie jak dobra wydajność dysocjacji, wydajność komórek, żywotność komórek i zatrzymywanie markerów powierzchniowych komórek, które są kluczowe i muszą być zoptymalizowane w celu pomyślnej izolacji tych rzadkich populacji komórek.

W tym protokole, izolacja podzbiorów DC i TEC odbywa się poprzez wykonanie jednokomórkowego zawieszenia tkanki poprzez mechaniczne zakłócenie i trawienie enzymatyczne. Używamy kolagenazy A z Clostridium histolyticum, która ma zrównoważony stosunek różnych aktywności enzymów, aby rozbić natywny kolagen, który utrzymuje tkankę razem. DNaza I jest zawarta w roztworze enzymu w celu zmniejszenia agregacji komórek z powodu wolnego DNA z martwych komórek (tymocyty są bardzo wrażliwe). Oferujemy również alternatywne podejście do typowego enzymatycznego trawienia tkanek polegające na mechanicznym i enzymatycznym traktowaniu tkanek wspomaganym dysocjatorem tkankowym. Zawiesina pojedynczej komórki jest następnie poddawana pojedynczemu wirowaniu o gęstości Percoll w celu wzbogacenia frakcji o niskiej gęstości (LDF) komórek. Z tej frakcji komórek DC można wyizolować poprzez barwienie markerów powierzchniowych DC (tj. CD11c+) i zastosowanie separacji magnetycznej lub sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). W przeciwieństwie do komórek limfoidalnych stanowiących zdecydowaną większość komórek grasicy, TEC nie wyrażają CD45 na wysokich poziomach, ale są dodatnie dla cząsteczki adhezji komórek nabłonka EpCAM. cTEC można odróżnić od rdzeniastego TEC po ekspresji jeszcze niezdefiniowanego antygenu rozpoznawanego przez przeciwciało CDR-2 (korowe retikulocyty-2)4,5 i nieco niższą ekspresję EpCAM. Różnicowa koekspresja EpCAM i CDR2 pozwala na efektywną izolację tych podzbiorów TEC poprzez szybkie sortowanie komórek6.

Przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowany dla ludzkiej tkanki grasicy. Czas trwania procedury zależy od ilości tkanki i zdolności eksperymentatora, a także szybkości sortera komórek, jeśli stosuje się sortowanie FACS. Zwykle protokół izolacji DC można ukończyć w ciągu 5-6 godzin, a izolacji TEC w ciągu 8-10 godzin. Izolacja podzbiorów DC i TEC z tkanki grasicy jest wrażliwa na czas. Im szybsza procedura izolacji, tym lepsza kondycja komórek. Wreszcie, wyizolowane komórki mogą być wykorzystane do dalszych badań, takich jak badania porównawcze ekspresji mRNA i białka, eksperymenty PCR, izolacja białek, profilowanie molekularne (tj. transkryptomika, analiza mikroRNA), a także hodowla komórkowa6.

Oświadczenie etyczne

Aby móc pracować z ludzką tkanką grasicy, badacz musi uzyskać zgodę lokalnej komisji etycznej lub odpowiedzialnych władz, a także świadomą pisemną zgodę dawcy (lub zazwyczaj jego rodziców, ponieważ tkanka jest zwykle pozyskiwana od nieletnich dzieci). Ponadto wszystkie tkanki ludzkie powinny być traktowane jako potencjalnie zakaźne i należy podjąć odpowiednie środki, takie jak praca w rękawiczkach itp.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie narzędzi, roztworów enzymatycznych i

Wykonaj następujące kroki przygotowawcze przed rozpoczęciem protokołu.

  1. Narzędzia
    Wyczyść, osusz i autoklaw następujące narzędzia i przechowuj je w sterylnym opakowaniu do czasu użycia.
    1. Małe ostre nożyczki z zakrzywionymi lub prostymi końcówkami do cięcia tkanki grasicy. Małe zakrzywione kleszcze z ząbkowanymi końcówkami do przenoszenia tkanki.
    2. 50 ml probówki wirówkowe Oak Ridge, PC, do etapu wirowania o gęstości Percoll.
  2. Roztwory enzymatyczne
    Przygotować mieszaninę kolagenazy/enzymu DNazy I (2 mg kolagenazy/ml i 0,1 mg DNazy I/ml) w następujący sposób:
    1. Rozpuścić 500 mg liofilizowanej kolagenazy A (Roche) w 250 ml RPMI 1640 plain (bez FCS) w celu uzyskania roztworu kolagenazy o stężeniu 2 mg/ml. Kolagenaza jest dość trudna do rozpuszczenia, dlatego zaleca się pozostawienie jej na jakiś czas na wytrząsarce rolkowej w temperaturze RT.
    2. Rozpuścić 100 mg DNazy I (Roche) w 10 ml sterylnej wody destylowanej. 2,5 ml podwielokrotności można przechowywać w temperaturze -20 °C. Dodać 2,5 ml roztworu 10 mg DNazy I do roztworu 2 mg kolagenazy A.
    3. Sterylnie przefiltrować mieszaninę kolagenazy / DNazy za pomocą jednostki filtrującej Stericup (0,22 μm). Przechowywać w 10-20 ml porcji w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  3. i roztwory
    1. 1,5 M roztwór podstawowy NaCl: Rozpuścić NaCl w destylowanej sterylnej wodzie do końcowego stężenia 1,5 M. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. 10x bufor MACS: 1x PBS (wolny od Ca2 + / Mg2 +) zawierający 5% BSA i 20 mM EDTA. Sterylnie przefiltrować roztwór filtrem 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem przygotować 1x roztwór, rozcieńczając 10x bulion do 1x w zimnym sterylnym 1x PBS.
    3. Bufor FACS: 1x PBS (wolny od Ca2 + / Mg2 +) zawierający 1% BSA i 0,02% NaN3.
    4. Bufor FACS do sortowania komórek: 1x PBS (wolny od Ca2+ / Mg2 +) zawierający 2% BSA. Sterylizować za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie tkanki

Przetwarzanie tkanki powinno odbywać się przy użyciu sterylnych odczynników i pracować w komorze laminarnej. Przed rozpoczęciem zabiegu należy przygotować następujące odczynniki i sprzęt:

    1. Podgrzej następujące elementy do RT: RPMI 1640 kompletna pożywka (RPMI 1640, 10% płodowa surowica cielęca, 1% wstrzykiwacz/paciorkowiec), RPMI 1640 zwykła, Ca2+/Mg2+-wolny od PBS i 2x roztwór enzymu kolagenazy/DNazy.
    2. Inkubator termiczny z ciepłą jednostką obrotową do 37 °C i chłodną wirówką z wirnikiem o stałym kącie do 4 °C.
    3. Przygotuj pudełko z lodem.

Uwaga: czas trwania tego kroku zależy od stanu i wielkości tkanki. Około 20-30 minut to rozsądny czas potrzebny na średniej wielkości kawałek tkanki w dobrym stanie (~5 cm szerokości).

  1. Umieścić tkankę na szalce Petriego zawierającej sterylny PBS i spłukać resztki krwi.
    1. Dodaj świeży PBS, aby zapobiec wysuszeniu tkanki, a za pomocą kleszczy i nożyczek oczyść tkankę z zakrzepów krwi, tkanki łącznej i tłuszczowej oraz wszelkich części, które nie wyglądają zdrowo.
    2. Zadbaj o usunięcie tkanki martwiczej, która zwiększy ilość zanieczyszczeń.
    3. Po oczyszczeniu zważ tkankę w celach informacyjnych.
    4. Pokrój tkankę na około 1 cm3 kawałki/bloki. Dodaj tyle PBS, aby pokryć tkankę.

Uwaga: Dla powtarzalności wyników, tkanka powinna być pocięta na kawałki o jednakowej wielkości.

  1. Za pomocą tylnej części sterylnej strzykawki (10-20 ml) wywierać nacisk (niezbyt energiczny lub długotrwały) na kawałki tkanki grasicy. Ta procedura usunie większość tymocytów, zmniejszając w ten sposób objętość tkanki do późniejszego strawienia. Wykonaj ten krok na lodzie i pracuj szybko.
  2. Roztwór stanie się widocznie mętny w miarę uwalniania tymocytów. Delikatnie wymieszać naczynie, a następnie za pomocą pipety o pojemności 5 ml lub szklanego aspiratora usunąć supernatant zawierający tymocyty, uważając, aby przypadkowo nie zassać kawałków tkanki.

Wskazówka: Można użyć sterylnego skrobaka do hodowli komórkowych, aby zagęścić wszystkie fragmenty tkanek po jednej stronie naczynia, a następnie przechylić szalkę (kąt 45°) i zassać supernatant. Zastąp nowym PBS i powtarzaj tę procedurę, aż supernatant stanie się względnie przezroczysty. Ostatnie pranie wykonaj za pomocą RPMI plain.

  1. Zmiel kawałki tkanek ostrymi nożyczkami (tak drobno, jak to możliwe, fragmenty powinny mieć co najmniej 2-4 mm). Fragmenty powinny być na tyle małe, aby zmieściły się w pipecie o pojemności 5 ml.

3. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki z tkanki grasicy

Tutaj opisane są dwa alternatywne podejścia do tego kroku. Pierwsze podejście opisuje typowe enzymatyczne trawienie tkanek (sekcja 3.1), podczas gdy drugie obejmuje mechaniczne i enzymatyczne traktowanie tkanek wspomagane dysocjatorem tkankowym (sekcja 3.2).

Ten protokół jest zoptymalizowany do przetwarzania próbek tkanek o wadze 5 g. W przypadku większych lub mniejszych próbek tkanek należy odpowiednio dostosować objętość enzymów.

3.1 Typowe trawienie tkankowe enzymatyczne w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki

  1. Umieścić rozgniecioną tkankę w 50 ml probówkach z 10 ml roztworu kolagenazy/DNazy na 5 g tkanki. Dodaj RPMI zwykły, aby uzyskać całkowitą objętość 20 ml.

Uwaga: w probówce o pojemności 50 ml trawić do 10 g tkanki. Odpowiednio dostosuj objętość enzymu.

  1. Inkubować zawiesinę tkankową przez 40 minut w temperaturze 37 °C przy powolnych obrotach w inkubatorze termicznym.

Uwaga: etapy inkubacji mogą być wykonywane albo w inkubatorze termicznym z jednostką rotacyjną, albo w inkubatorze bakteryjnym o temperaturze 37 °C z wytrząsarką.

  1. Roztwór enzymatyczny stanie się mętny, gdy komórki zostaną do niego uwolnione. Pod koniec mineralizacji odwirować probówkę o sile 110 x g przez 2 minuty, aby osadzić fragmenty tkanki.
  2. Zbierz supernatant z tej rundy trawienia. Zawiesinę komórek osadzać przez 10 minut w temperaturze 400 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10-50 ml RPMI w zależności od wielkości osadu komórkowego.
  3. Zawiesinę komórek należy przechowywać w inkubatorze o temperaturze 37 °C z luźną nakrętką.
  4. Jeśli pożądana jest większa liczba komórek, etap trawienia można powtórzyć z pozostałymi fragmentami tkanki, a pierwszy i drugi proces trawienia są łączone. Ponadto, jeśli TEC ma być odizolowany, należy przeprowadzić dwie rundy trawienia.
  5. Rozcieńczyć podwielokrotność zawiesiny komórkowej w błękitu trypanowym (1:10-1:100) i policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru.
  6. Utrzymywać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C do momentu, gdy będą gotowe do przejścia do wirowania metodą perkolu (sekcja 4). Kolejna izolacja podzbiorów prądu stałego (sekcja 5) zostanie przeprowadzona z tych komórek.

Uwaga: tkanki grasicy mogą różnić się składem, zwłaszcza wraz z wiekiem, co wpływa na efektywność trawienia i wytwarzanie zawiesiny jednokomórkowej.

  1. Do późniejszej izolacji komórek nabłonka grasicy (TEC) wymagana jest trzecia runda trawienia enzymatycznego. Zawiesić resztki tkanek w 10 ml świeżego roztworu kolagenazy/DNazy plus 10 ml zwykłego RPMI i dodać trypsynę/EDTA (1:50 z 2,5% zapasu) do roztworu.
  2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 40 minut, delikatnie obracając. W ciągu ostatnich 10 - 15 minut inkubacji dodać FCS (1:5), aby zneutralizować aktywność trypsyny.
  3. Wirować przy 110 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w celu osadzenia fragmentów tkanki.

Uwaga: Tkanka może nie być całkowicie strawiona po tych trzech rundach trawienia. Wiek i ogólny stan tkanki to dwa parametry, które wpływają na skuteczność dysocjacji tkanki grasicy.

  1. Zebrać supernatant komórki i wyrzucić osadzone fragmenty tkanki.
  2. Odwirować supernatant komórkowy przy 400 x g przez 10 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w RPMI.

Wskazówka: Granulki komórek są dość luźne, więc zachowaj ostrożność przy odrzucaniu/zasysaniu supernatantu.

  1. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C do momentu przejścia do separacji metodą Percoll (sekcja 4). Późniejsze wstępne wzbogacenie komórek TEC poprzez zubożenie komórekhi CD45 zostanie przeprowadzone z tych komórek (sekcja 6).

3.2 Mechaniczne i enzymatyczne leczenie tkanek wspomagane dysocjatorem tkanek

Korzystając z metody dysocjatora tkanek, etapy trawienia tkanek mogą być zredukowane do połowy potrzebnego czasu przy zastosowaniu podejścia opisanego powyżej (sekcja 3.1). Poniższy protokół jest zmodyfikowaną wersją protokołu używanego do dysocjacji tkanki grasicy myszy w celu wyizolowania TEC7,8.

  1. Przenieść 5 g kawałków tkanki mielonej (krok 2.5) do probówki C zawierającej 10 ml roztworu kolagenazy/DNazy.
  2. Dopasuj rurkę C do dysocjatora tkanek i uruchom program m_spleen_02 (10 sekund). Powtórz ten program 4-5 razy (40-50 sekund).
  3. Inkubować z delikatnymi obrotami przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Wirować przy 110 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  5. Zebrać supernatant i postępować jak w kroku 3.1.4. Dodać 10 ml świeżego roztworu kolagenazy/DNazy.
  6. Dopasuj rurkę C do dysocjatora tkankowego i uruchom program m_spleen_01 (56 sekund).
  7. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut, delikatnie obracając.
  8. Wirować przy 110 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  9. Zebrać supernatant komórek i zagnieździć zawiesinę komórek przez 10 minut w temperaturze 400 x g. Postępować jak w kroku 3.1.4.
  10. Jak opisano w ppkt 3.1.9, trzecia runda trawienia jest potrzebna do późniejszej izolacji komórek nabłonka grasicy (TEC). W tym celu należy ponownie zawiesić resztki tkanek w 10 ml świeżego roztworu kolagenazy/DNazy i trypsyny/EDTA (rozcieńczenie 2,5% w stosunku 1:50%)
  11. Inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne 20 minut, delikatnie obracając. Dodać FCS (1:5) i inkubować przez kolejne 10 minut.

Uwaga: Stosując to podejście, po tym ostatnim etapie trawienia tkanka jest zazwyczaj całkowicie dysocjowana i nie obserwuje się żadnych niestrawionych fragmentów tkanki.

  1. Postępuj jak w krokach 3.1.11-3.1.14.

4. Wzbogacanie LDF komórek za pomocą separacji o gęstości perkolu

Po enzymatycznym trawieniu tkanki, całkowite zawiesiny pojedynczych komórek grasicy są poddawane pojedynczemu etapowi wirowania o gęstości Percoll w celu wzbogacenia komórek LDF. LDF komórek jest wysoce wzbogacony w APC. W tej frakcji komórek wykrywane są zarówno DC, jak i TEC.

  1. Zawiesinę jednokomórkową otrzymaną z 1. i 2. wytrawiania należy stosować do izolacji mDC (komórki zbiorcze, patrz krok 3.1.8) lub 3. fazy trawienia (do izolacji TEC) (3.1.14). Odwirować zawiesinę jednokomórkową otrzymaną z każdego etapu mineralizacji przy 400 x g przez 10 min.
  2. Na tym etapie prania przygotuj roztwór Percollu o końcowej gęstości 1,07 g/ml (patrz example w tabeli poniżej). Przygotowanie roztworu Percollu do końcowej gęstości 1,07 g/ml (ρ = 1,07) Nr rurki 1 cyfra arabska 3 4 Nierozcieńczony Percoll (ρ = 1,130) (ml) Z dnia 2,96 pkt. Klasa 5,92 8,88 pkt. Godzina 11,84 1,5 M NaCl (ml) 0,6 Godzina 1,20 1.8 2.4 destylowany H2O (ml) Godzina 2,44 Norma 4,88 pkt. Godzina 7,32 Klasa 9,76 Objętość końcowego rozcieńczenia roboczego Pojemność 6 ml Pojemność 12 ml Pojemność 18 ml Pojemność 24 ml
  3. Liczba probówek Percoll zależy od liczby komórek określonych w krokach 3.1.8 i/lub 3.1.14. Połącz sterylne roztwory i dokładnie wymieszaj. Aby uzyskać optymalną izolację, na probówkę Percollu można załadować 0,6-1 x 109 komórek. Połącz sterylne roztwory i dokładnie wymieszaj.

Tip: Percoll jest wrażliwy na światło i dodatkowo powinien być przechowywany w niskiej temperaturze. Najpierw przygotować mieszaninę zawierającą NaCl iH2O(RT), a na końcu dodać nierozcieńczony Percoll, tuż przed ponownym zawieszeniem komórek w roztworze Percollu.

Uwaga: Gęstość Percollu może się różnić w zależności od różnych dostawców i partii! Jeśli gęstość nierozcieńczonego roztworu Percollu nie jest równa 1,130 g/ml, należy postępować zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta, aby obliczyć dokładne ilości Percollu iH2Owymagane do uzyskania końcowej gęstości 1,07 g/ml.

  1. Zawiesić maksymalnie 1 x 109 komórek w 6 ml przygotowanego roztworu Percollu (ρ = 1,07), wymieszać tyle, aby uzyskać jednorodną zawiesinę i przenieść do 50 ml probówki wirówkowej z poliwęglanu Oak Ridge.
  2. Ostrożnie nałożyć 30 ml RPMI na probówkę za pomocą pipety na wierzch roztworu/zawiesiny komórek Percollu. Podłoże należy ładować powoli, tak aby pozostało na wierzchu zawiesiny i uważać, aby nie naruszyć warstwy.
  3. Zważ probówki, aby upewnić się, że mają równą wagę, tak aby były zrównoważone podczas wirowania. Jeśli tak nie jest, ostrożnie dodaj więcej pożywki do probówki zapalniczki (w sterylnych warunkach).
  4. Ostrożnie przenieść probówki do wstępnie schłodzonej wirówki z wirnikiem o stałym kącie nachylenia i wirować z prędkością 3 500 x g przez 35 minut, w temperaturze 4 °C przy wyłączonym hamulcu. Upewnij się, że temperatura wirówki nie jest wyższa niż 4 °C.
  5. Wyjąć probówki z wirówki i ostrożnie zebrać wzbogacony APC, znajdujący się na skrzyżowaniu Percollu i pożywki (frakcji o niskiej gęstości) z każdej probówki za pomocą sterylnej pipety Pasteura. Przenieś komórki do 50 ml probówki zawierającej zimny RPMI kompletny. Napełnij probówkę, aby rozcieńczyć pozostały Percoll.
  6. Odwirować zawiesinę komórkową przez 10 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany sklarat i powtórzyć mycie.
  7. Zawiesić osad komórkowy w pożywce i określić liczbę komórek (za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru). Z naszego doświadczenia wynika, że procent komórek LDF wynosi około 2-20% całkowitej zawiesiny pojedynczej komórki uzyskanej po trawieniu enzymatycznym. Typowa wydajność komórek wzbogaconych o niskiej gęstości (z młodej grasicy, zakres od 1 dnia do 2 lat) wynosi 1x108 komórek na 1 x 109, co stanowi 10% wszystkich komórek zawiesinowych pojedynczych komórek.

Uwaga: Na tym etapie możesz zaobserwować, że komórki agregują się w zawiesinie (szczególnie z próbkami od dzieci w starszym wieku). Grudki komórek wskazują na śmierć komórki i wynikają z uwolnienia DNA z umierających komórek, które mogą sklejać ze sobą komórki. W takim przypadku należy dodać DNazę I do próbki (50 μg/ml) i inkubować ją do 20 minut w temperaturze pokojowej (delikatnie odwracać co 5 minut) w celu strawienia wolnych cząsteczek DNA.

5. Izolacja mDC grasicy

Po wzbogaceniu APC (poprzez separację Percoll), mDC może być skutecznie odizolowane od LDF po pierwszej i drugiej rundzie trawienia enzymatycznego. Poniższy protokół jest zmodyfikowaną wersją separacji komórek magnetycznych do izolacji mDC (CD11c+).

  1. Odwirować komórki wzbogacone APC wyizolowane z zawiesiny pojedynczej komórki otrzymanej z połączonego pierwszego i drugiego trawienia enzymatycznego w temperaturze 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze MACS o pojemności 100 μl na10-7 komórek.
  2. Dodać 5 μl przeciwciała CD11c-PE na 10-7 komórek.

Uwaga: Eksperymenty z miareczkowaniem są zalecane dla uzyskania optymalnych wyników.

  1. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
  2. Przemyć komórki, dodając 1-2 ml buforu MACS na 10-7 komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 minut.
  3. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić do 107 komórek w 80 μl buforu MACS.
  4. Dodaj 20 μl mikrogranulek anty-PE na 107 komórek.
  5. Dobrze wymieszać (nie wirować) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
  6. Powtórz czynności jak w kroku 5.4.
  7. Zawiesić do 108 komórek w 500 μl buforu.
  8. W razie potrzeby przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka komórkowego 40 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń i agregatów komórek, które mogą utrudniać przepływ kolumny.
  9. Użyj kolumny LS, ponieważ zawiesiny komórek grasicy lepiej przepływają przez kolumny LS. Przygotuj kolumnę LS zgodnie z instrukcjami producenta. Zawiesinę kuwety pipetować powoli do kolumny, unikając wytwarzania pęcherzyków. Użyj jednej kolumny na każde 1 x 108 komórek.
  10. Umyć kolumnę zgodnie z instrukcjami producenta. Wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w sterylnej probówce polipropylenowej o pojemności 12 ml z okrągłym dnem. Dodać 3 ml buforu MACS do kolumny i zebrać komórki znakowane magnetycznie, wkładając i mocno wciskając tłok do kolumny.
  11. Zebrać eluowaną frakcję reprezentującą CD11c+ mDC i odwirować przy 400 x g przez 6 minut.
  12. Określ liczbę komórek i potwierdź czystość wybranej populacji komórek za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Sugerowane markery to CD45, CD11c i HLA-DR.

Uwaga: CD11c+mDC może być również izolowany za pomocą sortera FACS.

6. Wzbogacanie komóreklo/neg CD45 do sortowania komórek TEC

Do izolacji TEC, komórki mogą być wstępnie wzbogacone przez zubożenie komórekhi CD45 za pomocą mikrogranulek CD45, aby przyspieszyć ich izolację poprzez sortowanie komórek.

Użyj zawiesiny jednokomórkowej otrzymanej z 3etapu trawienia (3.1.14), a następnie oddzielonej przez wirowanie Percoll.

  1. Zawiesinę komórek odwirować w temperaturze 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad komórek w buforze MACS o pojemności 80 μl na 10-7 komórek.
  2. Mikrogranulki CD45 należy stosować w ilości 1/3 zalecanej ilości (6,7 μl) na 107komórek.

Uwaga: Używając mniejszej ilości mikrogranulek, wstępnie wzbogacamy komórki zarówno dla komórekneg CD45lo, jak i CD45. W celu uzyskania optymalnych wyników zaleca się miareczkowanie.

  1. Dobrze wymieszać, delikatnie przesuwając probówkę (nie wirować) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Przemyć niezwiązane mikrogranulki przez dodanie 10 ml buforu MACS i odwirować przez 10 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C. Całkowicie odessać supernatant.
  3. Zawiesić do 108 komórek w 500 μl buforu.
  4. W razie potrzeby przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka o wielkości 70 μm, aby usunąć zanieczyszczenia i agregaty komórek, które mogą utrudniać przepływ kolumny.
  5. Użyj kolumny LS, ponieważ zawiesiny komórek grasicy lepiej przepływają przez kolumny LS. Przygotuj kolumnę LS zgodnie z instrukcjami producenta. Zawiesinę kuwety pipetować powoli do kolumny, unikając wytwarzania pęcherzyków. Użyj jednej kolumny na każde 108 komórek.
  6. Zebrać nieoznakowane komórki (przepływowe i przemywające) zawierające frakcję komórkowąCD45 lo/neg i przepłukać kolumnę zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad komórek w sterylnym buforze FACS w celu określenia liczby komórek i przystąpienia do barwienia w celu sortowania komórek.

7. Komórki barwiące do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

  1. Wykonaj blokowanie FcR przed barwieniem komórek, aby zmniejszyć nieswoiste wiązanie przeciwciał. Zawiesinę komórkową inkubować z zbiorczym roztworem immunoglobulin ludzkich przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odczynniki te są dostępne w handlu (np. Gammunex 10% roztwór).
  2. Umyj komórki, dodając zimny sterylny bufor FACS. Wirować przy 400 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w zimnym, sterylnym buforze FACS. Przygotuj 5 próbek zgodnie z następującym przykładem:
    próbka Typ próbki przeciwciało Numer komórki Całkowita objętość 1. Niepoplamiony kontrola 1 x 106 50 μl 2.scc*-Błękit Pacyfiku kontrola CD45-Pacyficzny Niebieski 1 x 106 50 μl 3. SCC-APC kontrola CD3-APC (pakiet APC) 1 x 106 50 μl 4. Scc-Alexa 488 kontrola CD8-Alexa 488 1 x 106 50 μl 5. Sortowanie komórek analit CD45-Pacific Blue
    EpCAM-APC
    CDR2-Alexa 488 10 x 106 - 50 x 106 500 μl
    10 x 106 komórek/100 μl
    *scc; sterowanie pojedynczym kolorem
  4. Inkubować komórki z przeciwciałami przez 30 minut, na lodzie w ciemności.
  5. Przemyć dwukrotnie buforem FAC przez odwirowanie komórek o sile 400 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Dostosować stężenie komórek w próbce przeznaczonej do sortowania do 1 x107 komórek/ml (lub do stężenia zalecanego przez urządzenie do sortowania komórek) przy użyciu sterylnego buforu FACS do sortowania komórek (tj. bez NaN3).
  7. Przepuścić próbkę komórek przez sitko o wielkości 70 μm, aby usunąć wszelkie grudki komórek, które mogą zatkać cytometr podczas sortowania.
  8. Zawiesić próbki kontrolne w 200-400 μl buforu. Trzymaj probówki na lodzie i chroń przed światłem.
  9. Przygotuj probówki zbiorcze z podłożem.

Uwagi:

  • Przeprowadzić miareczkowanie przeciwciał w celu optymalnego barwienia.
  • W jednej próbce do sortowania można wybarwić do 50 x 106 komórek w całkowitej objętości reakcji 500 μl.
  • Przeprowadzić barwienie próbki przeznaczonej do sortowania w probówkach z okrągłym dnem Falcon Polystyrene. Pojedyncze kontrolki koloru można barwić w oddzielnych dołkach 96-dołkowej płytki.
  • Ponieważ podzbiory TEC są rzadkimi populacjami, zaleca się użycie innego dodatniego markera (o wysokiej częstotliwości) dla każdego fluorochromu, aby ułatwić określenie prawidłowych ustawień FACS i upewnić się, że masz odpowiednią kompensację, jeśli wybór fluorochromów wymaga kompensacji. Komórki z frakcji CD45+ można barwić markerami, takimi jak CD45, CD3 lub CD8 dla różnych fluorochromów, a po wybarwieniu do próbki można dodać niebarwione komórki CD45+.

8. Izolacja TEC przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją

TEC podzbiory mogą być sortowane z frakcjilo/neg CD45 jako EpCAMhiCDR2- (mTEC) lub EpCAMlo CDR2+ (cTEC).

  1. Uruchom próbkę z niebarwionymi komórkami i dostosuj rozproszenie do przodu i z boku, aby umieścić badaną populację w skali. Dostosuj napięcie w każdym detektorze tak, aby komórki były widoczne, ale znajdowały się po lewej stronie histogramu.
  2. Uruchom każdą pojedynczą wybarwioną próbkę i dostosuj kompensację dla każdego koloru.
  3. Po dostosowaniu napięcia i kompensacji dla niebarwionych i pojedynczo barwionych kontroli uruchom próbkę do sortowania i użyj narzędzi do bramkowania w celu zdefiniowania populacji będącej przedmiotem zainteresowania. Użyj szerokiej przedniej i bocznej bramki rozpraszającej, aby zapewnić uwzględnienie wszystkich rozmiarów komórek zrębu, jednocześnie wykluczając resztki komórek.
  4. Na wykresie kropkowym z bramką CD45-Pacific Blue kontra Forward Scatter na niskich komórkach CD45 i CD45 neg
    5. .
  5. Zastosuj tę bramkę do wykresu punktowego EpCAM i CDR2 i określ, bramkując populacje do sortowania.
  6. Po określeniu bramek wybierz bramki zawierające interesujące populacje i rozpocznij sortowanie.
  7. Po zebraniu posortowanych komórek należy odwirować zawiesinę komórek i ponownie zawiesić komórki w pożywce lub wybranym buforze, w zależności od zamierzonego dalszego zastosowania.

Uwaga: Podczas sortowania, aby zapobiec przywieraniu komórek do boków probówki, probówka może być wstępnie pokryta poprzez napełnienie jej 50% FCS w PBS i inkubowana w temperaturze RT przez 30 minut. Wyrzuć roztwór powlekający przed dodaniem pożywki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jako materiał wyjściowy w niniejszym protokole wykorzystujemy tkankę grasicy pobraną od dzieci poddawanych korekcyjnej operacji serca i naczyń krwionośnych (Katedra Chirurgii Klatki Piersiowej i Naczyń Krwionośnych, Klinika Uniwersytecka w Tübingen), uzyskaną po wyrażeniu świadomej zgody i zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Ten odrzucony materiał może znacznie różnić się rozmiarem, od 2-30 g lub więcej. Liczba uzyskanych podzbiorów mDC oraz TEC (cTEC i mTEC) zależy od wielkości, a także od wieku próbki tkanki grasic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół jest modyfikacją protokołu opublikowanego przez Göttera i wsp.4. Krytycznymi etapami w protokole są stan i wstępne przygotowanie tkanki, a także separacja gęstości Percoll. Zdecydowanie zalecamy przetworzenie tkanki tak szybko, jak to możliwe po pobraniu. Ważne jest, aby pracować szybko, ale dokładnie podczas czyszczenia i cięcia tkanki. Podczas płukania tymocytami opisanego w kroku 2.3 ważne jest, aby znaleźć właściwą równowagę podczas wywierania nacisku tylną częścią tłoka str...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni chirurgom z Oddziału Chirurgii Klatki Piersiowej i Układu Krążenia, Kliniki Uniwersyteckiej w Tybindze za dostarczenie nam próbek grasicy oraz Bruno Kyewskiemu (DKFZ, Heidelberg, Niemcy) za dostarczenie przeciwciała CDR2. Chcielibyśmy również podziękować Hansowi-Jörgowi Bühringowi i Sabrinie Grimm z sortowni (Uniwersytet w Tybindze). Prace te były wspierane przez SFB 685 i Fundację Hertie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki i materiały
RPMI 1640PAAE15-842 
PBS PAA firmy DulbeccoH15-002 
Płodowa surowica bydlęca-GoldPAAA15-151 
Surowica bydlęca AlbuminaPAAK41-001 
Kolagenaza ARoche10 103 586 001 
DNaza I, II stopień bydlęca trzustkaRoche10 104 159 001 
Trypsyna-EDTA 10x w PBSPAAL11-001stężenie 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 Zestaw do znakowania białekSondy molekularneA-10235 
anty-ludzki CDR2 (oczyszczony)Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Niemcyoznaczony Alexa Fluor 488
anty-ludzki CD45 (Pacific Blue)Biolegend304022 
anty-ludzki EpCAM (APC)Miltenyi Biotec130-091-254 
anty-ludzki CD11c (PE)Miltenyi Biotec130-092-411 
Mikrogranulki anty-PEMiltenyi Biotec130-048-801 
Mikrogranulki anty-CD45, ludzkieMiltenyi Biotec130-045-801 
Kolumny LSMiltenyi Biotec130-042-401 
gentleMACS C ProbówkiMiltenyi Biotec130-093-237do dysocjatora tkanek
Percoll (gęstość 1.130 g/ml)GE Healthcare, Nauki przyrodnicze17-0891-01 
Sterylna woda destylowana (bez DNAzy/ RNAzy)GIBCO10977-035 
Gamunex 10%Tajecris-BiotherapeuticsG120052wstępne rozcieńczenie 1:10, stosować 20 μ L/1 x 106komórki
0,22 μ m filtrMillex GSSLGS033SSNapędzany strzykawką
Jednostka filtrująca StericupMilliporeSCGPU05RENapędzana pompą
50 ml probówki wirówkowe dębowe kalenicowe PCNalgene3118-005050 ml
50 ml PP rurki stożkoweBecton Dickinson352070 
12 mm x 75 mm 5 ml probówkiBecton Dickinson352058barwienia FACS
Sitko do komórek 70 μ mBecton Dickinson352350 
INSTRUMENTS
Cytometr-sorter przepływowy (BD FACSAriaTMIIu)Becton Dickinson 
Sorvall Evolution R6 (wirnik)Kendro 
Rotator REAX 2Heidolph 
dysocjator tkankowy gentleMACS Dysocjatortkankowy Miltenyi Biotec130-093 235

Bibliografia

  1. Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
  2. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).
  3. Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations. Blood. 97, 1733-1741 (2001).
  4. Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).
  5. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).
  6. Stoeckle, C., et al. Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells. Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).
  7. Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation. Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).
  8. Williams, K. M., et al. Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury. Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).
  9. Bendriss-Vermare, N., et al. Human thymus contains IFN-α-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells. The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).
  10. Schmitt, N., et al. Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets. Immunobiology. 212, 167-177 (2007).
  11. Dzionek, A., et al. BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).
  12. Wu, L., Shortman, K. Heterogeneity of thymic dendritic cells. Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).
  13. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).
  14. Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus. Nature Communications. , (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom rektrawienie enzymatycznewirowanie w gradiencie g sto ci Percollmagnetyczna separacja kom reksortowanie kom rek metod FACSfrakcja o niskiej g sto ciwzbogacanie populacji kom rek

Powiązane artykuły