Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy pomiar fluorometryczny potencjalnej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie

DOI:

10.3791/50961

⸱

15 listopada 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Natural Resource Ecology Laboratory, Colorado State University, 2Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Bioengineering, University of Colorado

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zmierzyć potencjalne tempo aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie, do próbek gleby dodaje się syntetyczne substraty, które są związane z barwnikiem fluorescencyjnym. Aktywność enzymu mierzy się, gdy barwnik fluorescencyjny jest uwalniany z substratu w reakcji katalizowanej enzymatem, gdzie wyższa fluorescencja wskazuje na większą degradację substratu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroorganizmy w glebach i innych środowiskach wytwarzają zewnątrzkomórkowe enzymy do depolimeryzacji i hydrolizy organicznych makromolekuł, aby mogły być przyswajane na energię i składniki odżywcze. Pomiar aktywności enzymów mikrobiologicznych w glebie ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia dynamiki funkcjonalnej ekosystemu glebowego. Ogólna koncepcja testu enzymów fluorescencyjnych polega na tym, że do próbek gleby dodaje się syntetyczne substraty bogate w C, N lub P związane barwnikiem fluorescencyjnym. W stanie nienaruszonym oznakowane podłoża nie fluoryzują. Aktywność enzymu mierzy się jako wzrost fluorescencji, gdy barwniki fluorescencyjne są odcinane od ich substratów, co pozwala im na fluorescencję. Pomiary enzymów mogą być wyrażone w jednostkach molowości lub aktywności. Aby przeprowadzić ten test, zawiesiny glebowe przygotowuje się przez połączenie gleby z buforem pH. Bufor pH (zwykle octan sodu o objętości 50 mM lub bufor Tris o pojemności 50 mM) dobiera się do określonej stałej dysocjacji kwasowej buforu (pKa), aby jak najlepiej dopasować pH próbki gleby. Gnojowice glebowe zaszczepia się nieograniczoną ilością znakowanego fluorescencyjnie (tj. bogatego w C, N lub P) substratu. Wykorzystanie zawiesin glebowych w teście służy zminimalizowaniu ograniczeń dyfuzji enzymów i substratów. W związku z tym test ten kontroluje różnice w ograniczeniach substratu, szybkościach dyfuzji i warunkach pH gleby; w ten sposób wykrywa potencjalne wskaźniki aktywności enzymu w funkcji różnicy stężeń enzymów (na próbkę).

Testy enzymów fluorescencyjnych są zazwyczaj bardziej czułe niż testy spektrofotometryczne (tj. kolorymetryczne), ale mogą cierpieć z powodu zakłóceń spowodowanych zanieczyszczeniami i niestabilnością wielu związków fluorescencyjnych podczas ekspozycji na światło; dlatego należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z podłożami fluorescencyjnymi. Podobnie, metoda ta ocenia potencjalną aktywność enzymów tylko w warunkach laboratoryjnych, gdy substraty nie są ograniczone. Należy zachować ostrożność podczas interpretowania danych przedstawiających porównania między miejscami o różnych temperaturach lub typach gleby, ponieważ typ gleby i temperatura in situ mogą wpływać na kinetykę enzymów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enzymy zewnątrzkomórkowe (EE) wytwarzane przez bakterie glebowe, grzyby i archeony biorą udział w niezliczonych procesach biogeochemicznych i są kluczowe dla przetwarzania, stabilizacji i destabilizacji materii organicznej gleby oraz obiegu składników odżywczych w ekosystemach lądowych 1. Wytwarzając EE, mikroorganizmy glebowe rozkładają i przekształcają polimeryczną materię organiczną w mniejsze rozpuszczalne cząsteczki, uwalniając w ten sposób wcześniej związane mikro- i makroelementy, co umożliwia roślinom i mikroorganizmom asymilację dostępnych składników odżywczych z gleby. EE są badane od dziesięcioleci, głównie poprzez pomiar ich aktywności w testach laboratoryjnych2-4, ponieważ bardzo trudno jest bezpośrednio wykryć i określić ilościowo enzymy.

Aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych (EEA) jest najsilniej kontrolowana przez stężenie enzymów i odpowiadających im substratów. Obfitość różnych enzymów rozkładających C, N i P w glebie jest kontrolowana przez wiele czynników, w tym biomasę mikrobiologiczną, skład zbiorowisk, dostępność substratu, mikroklimat i wymagania stechiometryczne5,6. Jednak na EEA in situ w środowisku glebowym wpływa również temperatura7,8 , wiązanie enzymów z glinami glebowymi i właściwości humusowe2 oraz ograniczenia dyfuzji 9 , które ostatecznie regulują aktywną pulę enzymów pod względem wielkości, dostępności substratu i szybkości obrotu10–12. W związku z tym rozpoznanie warunków glebowych in situ ma kluczowe znaczenie w przypadku stosowania laboratoryjnych testów enzymatycznych do interpretacji funkcji mikrobiologicznych gleby w różnych miejscach środowiska.

Wiele różnych klas EEA można określić ilościowo w testach laboratoryjnych przy użyciu różnych syntetycznych substratów (proszę zapoznać się z "Tabelą odczynników", aby uzyskać więcej szczegółów). Niektóre protokoły wykorzystują substraty w testach, które są sprzężone z reakcją kolorymetryczną, którą można wykryć za pomocą spektrofotometru, podczas gdy inne, w tym protokół, który tutaj opisujemy, wykorzystują substraty, które są związane z ugrupowaniem fluorescencyjnym. Testy fluorescencji EE są zazwyczaj bardziej czułe (o rząd wielkości) niż testy kolorymetryczne (które wykorzystują ugrupowanie chromogenne połączone z syntetycznym substratem)12-14. Czułość w wykrywaniu EEA obejmuje dwa aspekty: jeden jest związany z ilością wykrytego związku będącego przedmiotem zainteresowania, a drugi związany jest z najniższą wykrywalną potencjalną aktywnością enzymu. Metody barwienia na bazie P-nitrofenolu (pNP) można znaleźć we wcześniejszych pracach15,16. Krótko mówiąc, gleba (zwykle przesiewana do <2 mm i suszona na powietrzu) jest inkubowana w optymalnej lub odpowiedniej dla pola temperaturze i pH. Szybkość, z jaką uwalniany jest produkt reakcji, określa się kolorymetrycznie za pomocą spektrofotometru14. Wyższa czułość testów enzymów fluorescencyjnych wynika częściowo z bardziej czułego wykrywania oddzielania ugrupowań fluorogenicznych związanych z degradacją substratu, a nie rejestrowania absorbancji po oddzieleniu określonej grupy chromogennej na określonej długości fali. Dwa najczęściej stosowane syntetyczne wskaźniki fluorescencyjne to 4-metylumbiliron (MUB)17 i 7-amino-4-metylokoumaryna (MUC)18,19. Substraty połączone z MUC są powszechnie związane z syntetycznymi substratami bogatymi w N, takimi jak białka i/lub aminokwasy. Techniki fluorescencyjne zostały po raz pierwszy opracowane dla próbek wodnych20,21, a ich zastosowanie w glebie wymaga kontroli tłumienia sygnału i zakłóceń22,23. Testy mogą być przeprowadzane przy użyciu tradycyjnej chemii "laboratoryjnej" z dużymi objętościami lub mogą być stosowane w protokołach opartych na mikropłytkach, ze zwiększoną przepustowością, ale prawdopodobnie wyższym błędem pomiaru. Chociaż istnieje kilka szeroko cytowanych protokołów fluorescencyjnego wykrywania EEA w glebie24, wiele laboratoriów stosuje subtelne wariacje tych protokołów, często nieumyślnie lub z powodu różnic w sprzęcie laboratoryjnym lub odczynnikach. Pozornie niewielkie różnice w szczegółach protokołów mogą mieć duży wpływ na mierzone EEA25,26, a brak standaryzowanych enzymów utrudnia kalibrację testów między różnymi laboratoriami. W związku z tym istnieje istotna potrzeba rozpowszechniania szczegółowych protokołów w celu zachęcenia do standaryzacji testów EEA.

W naszym protokole, próbki gleby są przygotowywane poprzez połączenie próbek gleby z buforem pH i homogenizację za pomocą blendera. Zawiesiny są następnie zaszczepiane nieograniczoną ilością znakowanego fluorescencyjnie substratu bogatego w C, N lub P, wybranego w zależności od konkretnego pytania badawczego. Wykorzystanie zawiesin glebowych w testach enzymatycznych służy jako kontrola w celu zminimalizowania ograniczeń dyfuzji substratu. Ugrupowania fluorescencyjne są hartowane do momentu odcięcia ich od odpowiednich substratów, a zatem aktywność enzymu można wykryć, gdy barwnik fluorescencyjny jest uwalniany z podłoża w reakcji katalizowanej enzymatem. Rosnąca intensywność fluorescencji w czasie odzwierciedla szybkość reakcji katalizowanej enzymem.

Ogólna koncepcja testu enzymatycznego fluorescencji polega na tym, że syntetyczne substraty związane ugrupowaniem fluorogenicznym (barwnikiem fluorescencyjnym) są dodawane do próbek gleby 27. Podczas katalizowanej enzymatycznie degradacji substratu dochodzi do zerwania wiązania między barwnikiem fluorescencyjnym a substratem. Barwnik fluorescencyjny uwolniony z substratu jest następnie wykorzystywany jako pośrednia ocena aktywności enzymu i może być oznaczony ilościowo za pomocą czytnika mikropłytek w celu wykrycia intensywności fluorescencji barwnika. Krótko mówiąc, kwantyfikacja fluorescencji odbywa się, gdy uwolniony barwnik emituje światło o jednej długości fali po wchłonięciu światła o innej długości fali. Intensywność fluorescencji jest rejestrowana przez czytnik płytek, który może zarówno wzbudzić, jak i wykryć. Aktywność enzymu można następnie określić ilościowo na podstawie znanych stężeń barwnika fluorescencyjnego w substracie (tj. znanych ilościach substratu syntetycznego dodanego do próbek gleby) wraz z odniesieniem do standardowej krzywej rozcieńczania intensywności fluorescencji dla określonej części fluorogennej substratu użytego w teście (tj. 4-metylolumbelliferon (MUB) lub 7-amino-4-metylokoumaryna (MUC)). (Szczegółowe informacje na temat kwantyfikacji aktywności enzymów można znaleźć w sekcji dotyczącej protokołu).

Laboratoryjne testy enzymów glebowych są przydatne do oceny funkcji społeczności mikrobiologicznej, ale istnieje kilka ograniczeń technicznych, które użytkownicy powinni rozpoznać10. Testy fluorescencyjne mogą ulegać zakłóceniom spowodowanym zanieczyszczeniami i/lub niestabilnością wielu związków fluorescencyjnych pod wpływem światła, dlatego należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z podłożami fluorescencyjnymi25. Cząstki glebowe i/lub materiał organiczny w gnojowicy glebowej mogą również zakłócać intensywność fluorescencji, znaną jako efekt hartowania 26. Co więcej, laboratoryjne testy enzymatyczne oceniają potencjalne EEA tylko w warunkach laboratoryjnych. Testy in vitro mierzą EEA w warunkach, w których dyfuzja i obfitość substratu jest nieograniczona. W związku z tym dane dostarczone przez te testy mogą nie być dobrym wskaźnikiem zastępczym dla EEA w warunkach glebowych in situ 10. Ogólnie rzecz biorąc, aktywność enzymów jest bardzo przydatna do względnych porównań, w których typy gleb są podobne. Jednak przy stosowaniu tej metody do porównywania aktywności gleb różniących się właściwościami fizycznymi lub chemicznymi należy zachować ostrożność. Wynika to z faktu, że różnice w rodzaju gleby i temperaturze mogą drastycznie zmienić stan kinetyki enzymów in situ. Kolejnym ograniczeniem jest to, że stosunkowo niewiele substratów jest dostępnych na rynku (w porównaniu ze środowiskiem naturalnym). Ponadto substraty syntetyczne stosowane do testów enzymatycznych są stosunkowo proste (łatwo rozpuszczalne) i mogą nie odzwierciedlać dokładnie substratów glebowych obecnych lub dostępnych in situ. Innym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest to, że stosowanie zawiesin glebowych będzie obejmowało aktywność niektórych stabilizowanych enzymów (tj. unieruchomionych przez materię organiczną lub gliny), które mogą nie być aktywne w warunkach in situ 2. Laboratoryjne testy enzymatyczne również nie dostarczają informacji na temat trwałości enzymów w glebie (tempo wymiany enzymów) ani informacji na temat konkretnych gatunków drobnoustrojów, które wytwarzają enzymy glebowe.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja testu

  1. Oznaczyć 3 płytki z głębokimi studzienkami: "Próbka", "wzorzec MUB" i "wzorzec MUC".
  2. Wlej każdy wzorzec (MUB 0, 2,5, 5, 10, 25, 50 i 100 μM) i substrat (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) do oddzielnych czystych, wstępnie oznakowanych zbiorników (zorientowanych w rzędach).
  3. Odpipetować odpowiedni wzorzec MUB do odpowiednich dołków na płytce wzorcowej MUB (Tabela 1).
    1. Odpipetować 200 μl 0 μM MUB do rzędu A płytki wzorcowej MUB.
    2. Odpipetować 200 μl 2,5 μM MUB do rzędu B płytki wzorcowej MUB.
    3. Odpipetować 200 μl 5 μM MUB do rzędu C standardowej płytki MUB.
    4. Odpipetować 200 μl 10 μM MUB do rzędu D płytki wzorcowej MUB.
    5. Odpipetować 200 μl 25 μM MUB do rzędu E standardowej płytki MUB.
    6. Odpipetować 200 μl z 50 μM MUB do rzędu F płytki wzorcowej MUB.
    7. Odpipetować 200 μl 100 μM MUB do rzędu G płytki wzorcowej MUB.
    8. Powtórzyć kroki 1.3.1 - 1.3.8 dla wzorców MUC w odpowiednich studzienkach płytki wzorcowej MUC.
  4. Przygotuj zawiesiny glebowe dla każdej próbki gleby.
    1. Zważ 2,75 g wilgotnej gleby do blendera.
    2. Dodać 91 ml buforu o pojemności 50 mM. Miksuj na wysokich obrotach przez 1 min.
    3. Wlej zawartość blendera do czystej szklanej miski co najmniej tak szerokiej jak pipeta 8-kanałowa z mieszadłem.
    4. Umieść na talerzu mieszającym, wymieszaj gnojowicę glebową na niskim poziomie.
    5. Odpipetować 800 μl gnojowicy glebowej do pierwszej kolumny płytki z próbką (tabela 2).
    6. Powtórzyć te czynności w 1kolumnie płytek wzorcowych MUB i MUC (tabela 1).
    7. Opłucz blender, płytkę mieszającą i mieszadło za pomocą DIH2O lub buforu między próbkami gleby.
    8. Powtórzyć kroki 1.4.1 - 1.4.7) dla każdej próbki, przechodząc do następnej kolumny z każdą kolejną próbką gleby (tabele 1 i 2).
  5. Odpipetować odpowiedni substrat (w tym przykładzie stężenie 200 μM) do odpowiednich dołków płytki z próbką (tabela 2).
    1. Odpipetować 200 μl substratu BG do rzędu A płytki z próbką.
    2. Odpipetować 200 μl substratu CB do rzędu B płytki z próbką.
    3. Odpipetować 200 μl substratu NAG do rzędu C płytki z próbką.
    4. Odpipetować 200 μl substratu PHOS do rzędu D płytki z próbką.
    5. Pobrać pipetą 200 μl substratu XYL do rzędu E płytki z próbką.
    6. Odpipetować 200 μl substratu AG do rzędu F płytki z próbką.
    7. Odpipetować 200 μl substratu LAP do rzędu G płytki z próbką.
    8. Powtórzyć kroki 1.5.1-1.5.7 dla każdej płytki do pobierania próbek o temperaturze inkubacji.

2. Inkubacja płytek testowych

  1. Uszczelnij płytki głębinowe ("Próbka", "wzorzec MUB" i "wzorzec MUC") matami płytkowymi.
  2. Odwróć każdą (zapieczętowaną) płytkę ręcznie, aż roztwór dokładnie się wymiesza (~10x).
  3. Umieścić płytki w odpowiednim inkubatorze na wymagany okres inkubacji (Tabela 3).
  4. Zapisz czas początkowy jako czas 0. Należy również zanotować odpowiednie czasy inkubacji, aby wiedzieć, kiedy należy wyjąć płytkę z inkubatora (Tabela 3).
  5. Pod koniec każdego okresu inkubacji odwirować szczelnie zamknięte płytki przez 3 minuty przy ~2,900 x g.
  6. Po certyfikacji przenieść 250 μl z każdej studzienki inkubowanych płytek głębinowych do odpowiednich studzienek w czarnych płaskodennych 96-dołkowych płytkach (jedna płytka zostanie użyta na każdą inkubowaną płytkę głębinową). Ważne jest, aby przenieść próbki z inkubowanych płytek głębinowych do tych samych studzienek (tj. A1...A12 itd.) w czarnych płaskodennych 96-dołkowych płytkach (tabela 1, 2).

3. Pomiary fluorescencyjne na fluorometrze mikropłytkowym

  1. Postępując zgodnie z instrukcją producenta zastosowanego czytnika płytek fluorometrycznych, należy ustawić długość fali wzbudzenia na 365 nm, a długość fali emisji na 450 nm (lub zastosować odpowiednie filtry).
  2. Odczytaj trzy płytki na fluorometrze. Ważne: próbki i płytki wzorcowe (np. MUB lub MUC) muszą być odczytywane przy użyciu tego samego wzmocnienia.
    1. Ustaw spektrofotometr na automatyczne wzmocnienie i odczytaj standardowe płytki MUC i MUB.
    2. Ustaw wzmocnienie na ręczne i zmniejsz wartość od optymalnej do następnej najniższej liczby, zaokrąglonej do najbliższej piątki, dla każdej płyty standardowej. Powtórz 2x dla każdej płytki.
    3. Ustaw wzmocnienie na automatyczne i uruchom płytkę próbki. Uruchom ponownie płytkę Sample ręcznie, aby dopasować najwyższe wzmocnienie dla każdej z płyt standardowych (tj. MUB i MUC).

4. Analiza danych

  1. Wprowadź dane fluorescencji krzywej wzorcowej do arkusza kalkulacyjnego dla wzorca MUB (tabela 4a) i wzorca MUC (tabela 4b)
    1. Przelicz stężenia (μM) na (μmol) (tabele 4a i 4b).
  2. Dla danych fluorescencji krzywej standardowej każdej próbki należy obliczyć nachylenie, punkt przecięcia z osią y i wartości R2 dla standardowych stężeń MUB i MUC (μmol). Dopuszczalne wartości R2 powinny przekraczać 0,98 dla każdej próbki (tabele 4a i 4b). Przydatne może być wizualizacja krzywych standardowych na wykresie punktowym; z odczytami fluorescencji wykreślonymi jako zmienna zależna (oś y) i stężeniem wzorca (μmol) wykreślonym jako zmienna niezależna (oś x) (rysunek 1).
  3. Użyjesz standardowych wartości nachylenia krzywej MUB i MUC oraz wartości przecięcia z osią y, aby obliczyć surowe dane fluorescencji próbki + substratu w potencjalnych EEA. Najpierw należy wprowadzić surowe dane fluorescencyjne próbka + substrat do nowego arkusza kalkulacyjnego (Tabela 5a). Dla każdej próbki należy również wprowadzić czas inkubacji (hr) i suchą masę gleby (tabela 5b). Należy zauważyć, że wartości czasu wprowadzone w tym przykładzie to 3 godziny, ponieważ próbki inkubowano w temperaturze 25 °C (tabela 3).
    1. Odejmij wartości przecięcia krzywej standardowej od odpowiednich wartości fluorescencji próbki, a następnie podziel przez nachylenie odpowiedniej krzywej wzorcowej (tabela 5c). Aby to osiągnąć, przestaw standardowe równanie liniowe, aby rozwiązać stężenie enzymu w próbce (x); x=(y-b)/m gdzie: [y = odczyt surowej fluorescencji próbki; b = punkt przecięcia z krzywej wzorcowej MUB lub MUC; m = nachylenie z krzywej wzorcowej MUB lub MUC].
    2. Pomnożyć próbkę μmol z kroku 4.3.1 powyżej przez 91 ml (objętość buforowa stosowana w gnojowicy glebowej) (tabela 5d).
    3. Podzielić wartość otrzymaną w kroku 4.3.2 przez czas inkubacji właściwy dla próbki i suchą masę gleby (tabela 5e): [ilość enzymu (μmol) x 91 ml x inkubacja (hr) x sucha gleba (g) x 0,8 ml x 1 000]
      Uwaga: 0,8 ml to objętość gnojowicy użytej w każdej studzience, a 1,000 koryguje rzeczywistą ilość gleby w każdej studzience.
    4. Pomnóż wartość uzyskaną w kroku 4.3.3 przez 1 000, aby uzyskać żądane jednostki (aktywność nmol/g suchej gleby/godz.) (tabela 5f).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analizy enzymatyczne mogą być wykorzystane do ilościowego oznaczenia potencjalnych EEAs oraz do porównania aktywności w podobnych próbkach. Przedstawiamy tutaj reprezentatywne wyniki z eksperymentalnego badania klimatycznego, w którym porównano gleby poddane warunkom klimatycznym otoczenia (ACN) z glebami eksponowanymi na podwyższone stężenie CO2 oraz traktowanie ciepłem (EHN) (Ryc. 2-6). Pokrywa roślinna na wszystkich polach była charakterystyczna dla północnego mieszanego preria trawiastego, zdominowanego przez trawę C4 Bouteloua gracilis (H.B.K) Lag. oraz dwie trawy C3, Hesperostipa comata Trin i Rupr. oraz Pascopyrum smithii (Rydb.); około 20% roślinności stanowią turzyce i rośliny zielne. Więcej informacji na temat opisu stanowiska i projektu eksperymentu polowego znajduje się w literaturze28-30. Gleby pobrano z dwóch różnych głębokości (0-5 cm i 5-15 cm) z każdej z działek badawczych przy użyciu rdzenia o średnicy 1,5 cm, aby ocenić glebowe EEAs w odpowiedzi na zmienione warunki klimatyczne. W naszych przykładach (t.j. Ryc. 2-6) wielkość próby wynosi (N = 3). Pomimo tak niewielkiej liczebności próby, w większości przypadków zmienność jest stosunkowo mała (co wykazują słupki błędów) i rzetelnie odzwierciedla zróżnicowanie potencjalnych EEAs między działkami badawczymi. Do zidentyfikowania istotnych zmian w aktywności enzymatycznej między działkami a głębokościami gleby wykorzystano analizę wariancji (ANOVA) oraz post hoc test wielokrotnych porównań Tukeya.

Poniższe reprezentatywne wyniki zostały przedstawione, aby zademonstrować, w jaki sposób ten wysokoprzepustowy test fluorometryczny może być wykorzystany do badania (1) ogólnej aktywności enzymów pozakomórkowych (EEA) w glebach, (2) tego, jak stechiometria EEA może wskazywać na procesy na poziomie ekosystemu oraz (3) związku między temperaturą inkubacji a EEA. EEA w glebach są powszechnie badane w celu powiązania zmian w funkcjach drobnoustrojów z obiegiem składników odżywczych w glebie; stanowią one użyteczne wskaźniki do oceny zapotrzebowania mikroorganizmów na składniki odżywcze w odpowiedzi na zmiany klimatu, przesunięcia w strukturze społeczności roślin i szerzej – funkcjonowanie ekosystemu31-33. Stechiometria EEA została niedawno przyjęta jako indeks do oceny biochemicznego obiegu składników odżywczych w glebie poprzez połączenie ekologicznej teorii stechiometrycznej z metaboliczną teorią ekologii w celu oceny potencjalnych niezrównoważeń składników odżywczych u drobnoustrojów w zależności od warunków środowiskowych5. Liczne badania sugerują, że szerokie stosunki stechiometryczne wskazują na ograniczenia wzrostu wynikające z niedoboru składników odżywczych34-36; gdy dostępność składników odżywczych w glebie staje się ograniczona, mikroorganizmy reagują poprzez przekierowanie zasobów metabolicznych na produkcję specyficznych enzymów w celu pozyskania brakujących składników37. Stechiometryczne stosunki C:N:P dla ekoenzymów są zatem użyteczne do identyfikacji względnych zmian w potencjalnym zapotrzebowaniu wspólnoty drobnoustrojów na składniki odżywcze w odpowiedzi na różne zaburzenia środowiskowe5. Wreszcie, wrażliwość EEA na temperaturę może być pomocna w ocenie, w jaki sposób różnorodność funkcjonalna wspólnoty drobnoustrojów glebowych jest prawdopodobnie wpływana przez zmiany temperatury7,38. Wrażliwość enzymów na temperaturę może się znacznie różnić między glebami dla jednej klasy enzymów, a wspólnoty mikroorganizmów produkujące enzymy wykazują zmiany w aktywności enzymatycznej odpowiadające zmianom klimatu w stosunku do warunków historycznych7. Zatem pytania dotyczące aktywności enzymatycznej związane z termologiczną ekologią EE mogą być użytecznym sposobem oceny dynamiki funkcjonalnej mikroorganizmów i procesów ekosystemowych podziemnych w odpowiedzi na zmiany klimatyczne39,40.

W tym przykładzie potencjalne aktywności enzymów pozyskiwania C, N i P, badane na głębokości gleby 0-5 cm, nie różniły się w zależności od zastosowanejy wersji doświadczenia (Rysunek 2a). Jednakże na głębokości 5-15 cm kilka potencjalnych EEAs różniło się znacząco (Rysunek 2b). Na przykład aktywność enzymów degradujących C, takich jak β-1,4-glukozydaza i β-D-celobiohydrolaza, była niższa w działkach EHN (p ≤ 0,038; Rysunek 2b) w porównaniu do działek ACN. Enzymy mineralizujące N i P (odpowiednio β-1,4-N-acetyloglukozaminidaza i fosfataza) również wykazały niższą aktywność w działkach EHN (p ≤ 0,012; Rysunek 2b) w porównaniu do ACN na głębokości gleby 5-15 cm.

Obliczanie i przedstawianie na wykresie sumy wszystkich potencjalnych EEA zaangażowanych w cykl C, N lub P może być użytecznym podejściem do obserwacji szerszych wzorców dotyczących potencjalnych cykli C, N i/lub P w glebie (Rycina 3). W tym przykładzie obliczono sumę potencjalnych EEA dla β-1,4-glukozydazy, β-D-celobiohydrolazy, β-ksylozydazy i α-1,4-glukozydazy, aby reprezentować potencjalną aktywność cyklu C. Sumę β-1,4-N-acetyloglukozaminidazy i L-leucylowej aminopeptydazy obliczono w celu reprezentacji potencjalnej aktywności cyklu N. Fosfataza została użyta do reprezentowania potencjalnej aktywności cyklu P. W tym przykładzie potencjalne EEA dla całkowitego cyklu C, N i P wykazywały tendencję spadkową w działkach EHN w porównaniu z działkami ACN na głębokości gleby 5-15 cm (Rycina 3). Tendencja ta była jednak istotna tylko dla całkowitej aktywności cyklu N i P (p ≤ 0,046; Rycina 3). EEA glebowe nie różniły się istotnie między działkami doświadczalnymi na głębokości 0-5 cm (Rycina 3). Wyniki w tym przykładzie sugerują przeciwstawne tendencje w grupach funkcjonalnych aktywności enzymatycznej (t.j. enzymy rozkładające C, N lub P) pomiędzy działkami doświadczalnymi (ACN vs. EHN) w zależności od głębokości gleby. Na przykład, glebowe EEA rozkładające C, N i P w działkach kontrolnych (ACN) wykazywały tendencję wzrostową na mniejszych głębokościach w porównaniu z glebami poddanymi działaniu podwyższonego poziomu CO2 i ogrzewania (EHN), które wykazały wzorzec odwrotny (Rycina 3a-c).

Stoichiometria enzymatyczna to kolejne przydatne podejście do oceny potencjalnych aktywności enzymatycznych w środowisku (Rysunek 4). Mikrobiologiczne zapotrzebowanie na składniki odżywcze jest determinowane przez stechiometrię pierwiastkową biomasy mikroorganizmów w relacji do dostępności składników odżywczych w środowisku32. Podobnie mikroorganizmy produkują specyficzne enzymy (tj. enzymy degradujące C, N lub P), aby zaspokoić zapotrzebowanie na składniki odżywcze w środowisku glebowym, co określane jest również jako stochiometria ekologiczna41. Stosunek potencjalnych EEAs jest jednym ze sposobów oceny zapotrzebowania mikroorganizmów na składniki odżywcze. Na przykład stosunek 1:1 między dwiema funkcjonalnymi grupami enzymów (np. w pozyskiwaniu składników C:N) sugerowałby, że zapotrzebowanie na N jest wysokie w stosunku do zapotrzebowania na C, biorąc pod uwagę, że stosunki C:N w biomasie mikrobowej na poziomie całej społeczności wynoszą zazwyczaj 8:142. W tym przykładzie stochiometria enzymatyczna gleby dla aktywności C:N, C:P lub N:P różni się znacząco między działkami badawczymi na głębokości 0-5 cm (Rysunki 4a-c). Jednakże potencjalne stosunki enzymatyczne C:P i N:P były wyższe w działkach EHN w porównaniu do działek ACN na głębokości 5-15 cm (p = 0,05; Rysunki 4b i 4c). Obserwacja ta sugeruje, że w działkach ACN (w porównaniu do EHN) na głębokości 5-15 cm występuje relatywnie wyższa aktywność EEAs mineralizacji P w porównaniu do EEAs dla C i N. Stosunki aktywności pozyskiwania enzymatycznego C:N wykazały trend podobny do całkowitego C EEAs, z wyższym C:N ze względu na wyższe potencjalne C EEAs w działkach ACN na większej głębokości w porównaniu do EHN (Rysunek 4a).

Temperatura może silnie wpływać na EEAs w glebie. Jednak w typowych analizach laboratoryjnych enzymy glebowe mierzy się w jednej temperaturze, która może nie odpowiadać warunkom temperatury in situ. Nasza metoda fluorescencyjnego testu enzymatycznego pozwala uwzględnić wpływ temperatury in situ poprzez zastosowanie wielu temperatur inkubacji laboratoryjnej w celu porównania. Wykorzystanie inkubacji laboratoryjnych w wielu temperaturach pozwala na analizę danych kinetycznych enzymów zależnych od temperatury przy użyciu wykresów Arrheniusa oraz obliczeń Q10. Wykresy Arrheniusa są wykorzystywane do wizualizacji energii aktywacji; są one kreślone z logarytmem aktywności enzymu (zmienna zależna na osi y) jako funkcją odwrotności temperatury przeliczonej na kelwiny (1/K) na osi x (t.j. zmienna niezależna; Ryciny 5a-c). Energię aktywacji powszechnie definiuje się jako minimalną energię wymaganą do skatalizowania reakcji chemicznej (t.j. degradacji danego substratu do mniejszych produktów). W naszych celach energia aktywacji służy jako wskaźnik wrażliwości temperatury reakcji katalizowanych enzymatycznie. Wyższa energia aktywacji wskazuje na większą wrażliwość enzymu na temperaturę. Podobnie energie aktywacji (t.j. Ryciny 5d-f) bezpośrednio odpowiadają wartościom Q10 (t.j. Ryciny 6a-c). Dalsze wyjaśnienie wzorów używanych do obliczania energii aktywacji oraz ich praktyczne zastosowanie można znaleźć w wielu wcześniejszych pracach40,43-45. Wykresy Arrheniusa, energia aktywacji i wykresy Q10 dostarczają nadmiarowych informacji i nie wszystkie powinny być stosowane w tym samym manuskrypcie do prezentacji danych do publikacji (Ryciny 5 oraz 6). Dlatego przy stosowaniu tych technik konieczne jest wybranie najbardziej odpowiedniego typu wykresu dla danych dotyczących kinetyki temperatury enzymów10. Wszystkie typy wykresów (Arrheniusa i Q10) zostały tutaj przedstawione w celach demonstracyjnych, aby dostarczyć wizualnych przykładów sposobu prezentacji wyników analizy enzymatycznej.

W naszych przykładach oceniliśmy potencjalną kinetykę enzymatyczną dla potencjalnych C-, N- i P-EEA w obu działkach doświadczalnych na dwóch głębokościach gleby (Rysunek 5; Rysunek 6). Wyniki wykazały, że wrażliwość temperaturowa EEAs nie różniła się istotnie pomiędzy działkami doświadczalnymi na żadnej z głębokości gleby w odniesieniu do energii aktywacji, co wykazano na wykresach Arrheniusa (Rysunki 5a-c>) i odpowiadających im energiach aktywacji (Rysunek d-f), a (co nie jest zaskakujące) także na wykresach Q10 (w tym przykładzie pomiędzy inkubacjami laboratoryjnymi w 15 °C i 25 °C; Rysunki 6a-c). Sugeruje to, że kinetyka enzymatyczna nie była pod wpływem zabiegów eksperymentalnych w polu w tym konkretnym badaniu.

Schemat układu mikropłytki dla testu enzymatycznego; kolumny 1-12, rzędy A-H; zmienne stężenia substratu.
Tabela 1. Projekt płytki głębokodotykowej dla stężeń standardów fluorescencji z próbkami gleby. Szablon organizacji i nakładania standardów fluorescencji (MUB lub MUC) z próbkami gleby do płytki głębokodotykowej przed inkubacją. Uwaga: Kolumny reprezentują te same próbki gleby (dodatki 800 μl zawiesiny glebowej). Dla każdego rzędu nakładany jest gradient stężeń standardu fluorescencji (dodatki 200 μl). Każda komórka reprezentuje stężenie standardu fluorescencji wraz z dodatkiem zawiesiny glebowej. Na przykład, S1 - S12 reprezentują próbki gleby (800 μl zawiesiny glebowej); MUB 0-100 μM = stężenia 4-metyloumbeliferonu (dodatki 200 μl). W tym przykładzie rząd H pozostaje wolny i w konsekwencji może posłużyć do dodania wyższego stężenia standardu fluorescencji, jeśli będzie to konieczne. Decyzja o zwiększeniu stężeń krzywej wzorcowej może być niezbędna w przypadku wyższej potencjalnej aktywności enzymatycznej (i/lub zastosowanych stężeń substratów) dla konkretnych próbek gleby. Potencjalna aktywność enzymatyczna w badanych próbkach powinna mieścić się w zakresie wartości krzywej wzorcowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą tabelę.

Siatka reakcji enzymatycznych z kodami substratów; schemat analizy biochemicznej lub konfiguracji eksperymentalnej.
Tabela 2. Projekt płytki wielodołkowej dla próbek gleby z substratem. Szablon organizacji i nakładania próbek gleby oraz substratów do płytki wielodołkowej przed inkubacją. Uwaga: kolumny reprezentują te same próbki gleby (dodatki 800 μl zawiesiny glebowej). Różne substraty są nakładane w każdym wierszu (dodatki 200 μl). Każda komórka reprezentuje próbki gleby z dodatkiem substratu. Na przykład S1 – S12 reprezentują unikalne próbki gleby (800 μl zawiesiny glebowej). Substraty (dodatki 200 μl) obejmują: BG = 4-metylumbeliferylo-β-D-glukopiranozyd; CB = 4-metylumbeliferylo-β-D-celobiozyd; NAG = 4-metylumbeliferylo-N-acetylo-β-D-glukozaminid; PHOS = 4-metylumbeliferylofosforan; XYL = 4-metylumbeliferylo-β-D-ksylopiranozyd; AG = 4-metylumbeliferylo-α-D-glukopiranozyd oraz LAP = L-leucyna-7-amido-4-metylokumaryna hydrochlorowana. W tym przykładzie wiersz H jest wolny, a w konsekwencji dostępny do dodania innego substratu w celu oceny kolejnej potencjalnej aktywności enzymatycznej, jeśli jest to pożądane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą tabelę.

TemperaturaCzas
4 °C~23 godz.
15 °C6 godz.
25 °C3 h
35 °C1,5 godz.

Tabela 3. Temperatury inkubacji wymagane dla odpowiednich okresów czasu inkubacji.Temperatury inkubacji i odpowiadające im okresy czasu dla procedury analizy enzymatycznej.

Tabela wyników analizy fluorometrycznej, analiza stężeń MUB i MUC, nachylenie, punkt przecięcia, dane R-kwadrat.
Tabela 4. Obliczenia krzywej wzorcowej dla MUB i MUC. Przedstawia sposób organizacji surowych danych fluorescencji (μmol) dla a) MUB oraz b) MUC w celu późniejszego obliczenia nachylenia, punktu przecięcia z osią y oraz wartości R-kwadrat. Aby obliczyć nachylenie, punkt przecięcia z osią y oraz wartości R-kwadrat z krzywych stężeń wzorcowych, należy wybrać (lub wykreślić) surowe dane fluorescencji MUB i/lub MUC jako zmienną zależną (oś y), a stężenie wzorca (μmol) jako zmienną niezależną (oś x). Uwaga: MUB = 4-metylumbelliferon; MUC = 7-amino-4-metylokumaryna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną tabelę.

Tabela danych fluorescencyjnych; surowe wartości intensywności próbek, korekty absorbancji i wyniki analizy.
Tabela 5. Obliczenia aktywności enzymatycznej. Przedstawia sposób, w jaki należy a) uporządkować surowe dane fluorescencyjne próbek, a następnie wykonać kroki niezbędne (b-f) do obliczenia EEA w jednostkach: μmol aktywności/g suchej gleby/h. Uwaga: S1 – S12 oznaczają poszczególne próbki gleby. Substraty obejmują: BG = 4-metylumbellyrylo-β-D-glukopyranosyd; CB = 4-metylumbellyrylo-β-D-celobiosyd; NAG = 4-metylumbellyrylo-N-acetylo-β-D-glukozaminid; PHOS = 4-metylumbellyrylofosforan; XYL = 4-metylumbellyrylo-β-D-ksylopyranosyd; AG = 4-metylumbellyrylo-α-D-glukopyranosyd oraz LAP = L-leucyna-7-amido-4-metylokumaryna w formie hydroponiczku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą tabelę.

Wykres fluorescencji, stężenie MUB względem fluorescencji, R²=0,988, wynik analizy danych.
Rysunek 1. Wykres krzywej wzorcowej MUB. Wizualizacja krzywych wzorcowych na wykresie rozrzutu, gdzie surowe dane fluorescencji stanowią zmienną zależną (oś y), a stężenie wzorca (μmol) zmienną niezależną (oś x).

Wykres słupkowy aktywności enzymów na głębokości gleby 0-5 cm i 5-15 cm; działki badawcze ACN, EHN.
Rysunek 2. Aktywności enzymów w cyklach C, N i P. Potencjalne EEAs w punkcie Prairie Heating and Elevated CO2 Enrichment (PHACE) na działkach kontrolnych (ACN: wystawione na warunki klimatu otaczającego) i działkach badawczych (EHN: wystawione na podwyższoną temperaturę i podwyższone stężenie CO2). Enzymy glebowe badano na głębokościach a) 0-5 cm oraz b) 5-15 cm. Słupki pionowe reprezentują średnią ± S.E. Uwaga: ACN = działki z klimatem otaczającym; EHN = działki z podwyższonym stężeniem CO2 i ogrzewaniem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Wykres słupkowy porównujący aktywność enzymów C, N, P na dwóch głębokościach gleby w działkach doświadczalnych; zawarto wartości p.
Rysunek 3. Stechiometryczne stosunki enzymów w cyklach C, N i P. Suma potencjalnych EEA zaangażowanych w pozyskiwanie a) C, b) N i c) P dla obu grup badawczych w eksperymencie PHACE na głębokościach gleby 0-5 cm oraz 5-15 cm. Słupki pionowe reprezentują średnią ± S.E. Uwaga: ACN = działki z warunkami klimatycznymi otoczenia; EHN = działki z podwyższonym stężeniem CO2 i ogrzewaniem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Wykres słupkowy wskaźników pozyskiwania enzymów glebowych; stosunki C:N, C:P, N:P w zależności od głębokości gleby; zawarto wartości p.
Rysunek 4. Stechiometria enzymów dla całkowitej aktywności enzymów w cyklach C, N i P. Stoichiometryczne wskaźniki aktywności pozyskiwania enzymów w miejscu badań Prairie Heating and Elevated CO2 Enrichment (PHACE) w działkach kontrolnych (ACN: wystawione na naturalne warunki klimatyczne) i działkach badawczych (EHN: wystawione na podwyższoną temperaturę i zwiększone stężenie CO2). Przedstawiono całkowite wartości glebowe dla a) C:N, b) C:P oraz c) N:P dla obu grup badawczych na głębokościach 0-5 cm i 5-15 cm. Słupki pionowe reprezentują średnią ± S.E. Uwaga: ACN = działki o naturalnym klimacie; EHN = działki z podwyższonym stężeniem CO2 i ogrzewaniem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony rysunek.

Analiza energii aktywacji enzymów; wykresy (a-f), wpływ głębokości gleby, wariacje temperatury, wyniki badania.
Rycina 5. Energie aktywacji enzymów uczestniczących w cyklach całkowitego C, N i P. Wrażliwość termiczna potencjalnych EEAs przedstawiona za pomocą wykresów Arrheniusa dla enzymów degradujących całkowisty a) C, b) N oraz c) P; a także odpowiadające im wartości energii aktywacji dla enzymów degradujących całkowisty d) C, e) N oraz f) P w obrębie działek badawczych i głębokości gleby w punkcie Prairie Heating and Elevated CO2 Enrichment (PHACE). Słupki dla energii aktywacji (t.j. d-f) reprezentują średnią ± S.E. Uwaga: ACN = działki o klimacie otoczenia; EHN = działki z podwyższonym poziomem CO2 i ogrzewaniem. W przypadku publikacji należy zauważyć, że autor zazwyczaj decyduje się na przedstawienie albo wykresów Arrheniusa (t.j. a-c), albo wartości energii aktywacji (t.j. d-f), ale nie obu typów wykresów jednocześnie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Wykresy słupkowe Q10 (15-25°C) aktywności enzymów glebowych; enzymy cyklu C, N, P w zależności od głębokości gleby i działek badawczych.
Rysunek 6. Q10 (15-25 °C) enzymów cyklu C, N i P. Wrażliwość temperaturowa potencjalnych EEA mierzona jako Q10, na podstawie inkubacji laboratoryjnych w 15 °C i 25 °C dla enzymów degradujących a) C, b) N oraz c) P w zależności od działek badawczych i głębokości gleby w punkcie Prairie Heating and Elevated CO2 Enrichment (PHACE). Pionowe słupki dla Q10 reprezentują średnią ± S.E. Uwaga: ACN = działki z temperaturą otoczenia; EHN = działki z podwyższonym poziomem CO2 i ogrzewaniem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratoryjne pomiary potencjalnych glebowych EEA mogą dostarczyć ważnych informacji na temat reakcji mikroorganizmów na ich środowisko abiotyczne i ich konsekwencji dla funkcjonowania ekosystemów. Wyniki tego przykładowego zestawu danych sugerują, że istnieją minimalne różnice w aktywności enzymów glebowych lub kinetyce między powierzchniami do obróbki klimatu. Jednak odwrotne trendy na wykresach zachęcają do dalszych badań nad zmiennymi towarzyszącymi, które mogą wpływać na produkcję mikrobiologicznych EEA, takimi jak wilgotność gleby, pH gleby lub wzrost roślin. Ogólnie rzecz biorąc, ocena EEA pod względem (1) ogólnej EEA w glebach, (2) stechiometrii EEA, (3) wykresów Arrheniusa/energii aktywacji oraz (4) Q10 zapewnia szerokie spektrum podejść, które mogą wskazywać na procesy na poziomie ekosystemu, na podstawie których można solidnie scharakteryzować dynamikę funkcjonalną ekosystemu glebowego.

Wysokoprzepustowe testy EEA oparte na fluorescencji są użytecznym narzędziem, które jest szeroko stosowane do badania potencjalnych EEA w glebach i innych środowiskach. Co ważne, potencjalne działania odzwierciedlają wielkość puli enzymów, ale same w sobie nie określają ilościowo produkcji enzymów ani wskaźników obrotu46. Chociaż technika ta jest stosunkowo prosta, pozornie niewielkie różnice między protokołami laboratoryjnymi mogą utrudniać porównywalność wyników 13. Niestety, obecnie nie dysponujemy odpowiednimi znormalizowanymi kontrolami pozytywnymi dla EOG. Zastosowanie współczynników stechiometrycznych jest jednym ze sposobów przezwyciężenia tych wyzwań. Poza tym pojawienie się technik wysokoprzepustowych posunęło naprzód badania enzymów w środowisku4. Staranna interpretacja danych wygenerowanych przez te testy może wyjaśnić ważne trendy w aktywności mikrobiologicznej.

Solidność protokołu wynika z możliwości wyboru warunków specyficznych dla poszczególnych próbek, ale może to również skutkować ograniczeniami. Konieczne będzie wprowadzenie szeregu modyfikacji, aby zapewnić dokładny pomiar próbek dla poszczególnych lokalizacji terenowych:

Bufor

Wybrany bufor będzie zależał od pH gleby. Buforowanie stabilizuje również intensywność fluorescencji wzorców fluorescencyjnych, która jest w dużym stopniu zależna od pH27,47. Bufor pH, którego zwykle używamy do wytwarzania gnojowicy glebowej, to octan sodu o stężeniu 50 mM lub bufor Tris, który jest wybierany ze względu na określoną stałą dysocjacji kwasów buforu (pKa), aby jak najlepiej dopasować się do poziomu pH gleby - próbki. Octan sodu ma pKa 4,76, a Tris ma pKa 8,06, więc ilości tych dwóch będą się różnić, aby osiągnąć pożądane pKa dla pojedynczej próbki. Bufor fosforanowy (pKa = 7,2) zaproponowano dla gleb obojętnych/lekko zasadowych. Zalecamy jednak, aby przed użyciem tego buforu przetestować zmienność analityczną we wstępnych badaniach, ponieważ wysokie stężenia fosforanów mogą zakłócać aktywność enzymów.

Obchodzenie się z podłożami fluorescencyjnymi i ich przechowywanie

Testy fluorescencyjne mogą ulegać zakłóceniom spowodowanym zanieczyszczeniami i/lub niestabilnością wielu związków fluorescencyjnych pod wpływem światła, dlatego należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z podłożami fluorescencyjnymi. Zdecydowanie zalecamy zminimalizowanie ekspozycji na światło na podłoża znakowane fluorescencyjnie oraz wzorce MUB i MUC. Zdecydowanie zaleca się używanie butelek ze szkła oranżowego lub przykrywanie szklanych naczyń i pojemników używanych do wytwarzania i przechowywania podłoży fluorescencyjnych i wzorców; Dobrze sprawdza się folia aluminiowa do owijania szkła i pojemników. Podobnie, najlepszą praktyką jest skuteczne inokulowanie płytek i przenoszenie do ciemnych inkubatorów. Zalecamy przechowywanie podłoży i wzorców (-20 °C) nie dłużej niż dwa miesiące (przy jednoczesnej ochronie przed światłem); i substraty do rozmrażania (5 °C) ~ 24-48 godzin przed rozpoczęciem testu (testów) enzymu.

Projektowanie i replikacja

Aby jak najlepiej uwzględnić różnice między próbkami od początku do odwiertu, zaleca się stosowanie kontroli w testach ujemnych i (jeśli to możliwe) powtórzeń testów. Różnice zwykle występują z powodu różnic w ilości cząstek gleby w każdej studzience i błędów pipetowania. W związku z tym mocne mieszanie i dobra technika pipetowania znacznie zminimalizują różnice między nimi. Ponadto zdecydowanie zalecamy wdrożenie kontroli testu ujemnego (bufor + roztwór substratu) w celu monitorowania niespójności substratów w czasie. Można to łatwo monitorować podczas odczytu płytek enzymatycznych, porównując studzienki kontroli ujemnej (zwykle używamy ostatniej kolumny na płytkach 96-dołkowych). Ujemne kontrole podłoża są zazwyczaj stabilne, dlatego sygnał wzrasta znacznie powyżej granicy wykrywalności, co wskazuje na zanieczyszczenie lub niestabilność podłoża, wymagającą wymiany podłoża i/lub roztworów wzorcowych.

Aby zmaksymalizować przepustowość, nasz protokół obejmuje kilka potencjalnych EEA w jednej mikropłytce z głębokiej studni, chociaż inne protokoły wykonują jeden rodzaj testu na płytkę (tj. jeden substrat na płytkę), ponieważ różne EEA występują z różną szybkością. Niezależnie od tego, optymalizacja enzymów musi być przeprowadzona na glebie przed wykonaniem tego wysokiego podejścia przez cały czas lub podejścia jednopłytkowego. Na jednej płytce można zastosować wiele substratów, jeśli szybkość reakcji jest względnie stała dla każdego enzymu w okresie inkubacji.

Nasz protokół zaleca ~2,75 g gleby do przygotowania roztworu gnojowicy, podczas gdy ~1 gram jest zalecany w innych protokołach 24. Sugerujemy, że użycie większej ilości gleby (jeśli to możliwe) jest skutecznym podejściem do lepszego uchwycenia zmienności poziomów aktywności enzymów w glebie w próbce. W tym protokole inkubujemy 800 μl gnojowicy glebowej z 200 μl substratu, podczas gdy inni inkubują tylko 200 μl gnojowicy glebowej z 50 μl substratów. Jest to po prostu funkcja skalowania w górę, która ostatecznie nie zmienia mierzonej aktywności. Istnieją również praktyczne zalety korzystania z większych objętości. Po pierwsze, łatwiej jest uniknąć cząstek stałych w glebie podczas pipetowania do odpowiednich czarnych, płaskodennych 96-dołkowych płytek przed zarejestrowaniem intensywności na fluorometrze. Po drugie, dodatkowa objętość jest przydatna w przypadku przypadkowych rozlań podczas przenoszenia czarnych, płaskodennych 96-dołkowych płytek do fluorometru przed zarejestrowaniem intensywności fluorescencji związanej z enzymami. Nawet niewielkie odchylenia objętości znacznie zmniejszą fluorescencję między studzienkami. Wreszcie, ze względu na wysoką przepustowość tego protokołu, zwykle decydujemy się polegać na replikacji eksperymentalnej w celu przedstawienia zmienności poziomów aktywności enzymów, a nie na wykonywaniu powtórzeń testów. Dołączanie kontrprób analitycznych jest zawsze najlepszą praktyką, ale w praktyce uważamy, że nasz protokół zapewnia zrównoważony kompromis między kontrpróbami analitycznymi i eksperymentalnymi przy ograniczonych zasobach. Podobnie, nasze podejście wykorzystuje stosunkowo lepiej zhomogenizowaną glebę (2,75 g) na test25, co z natury zmniejsza różnice w glebie. Decyzja o zastosowaniu kontrprób analitycznych powinna być starannie przemyślana poprzez przeprowadzenie badań pod kątem błędu analitycznego w badaniach wstępnych48. Zalecamy jednak, aby projekty eksperymentalne z mniej niż 4 kontrpróbami w grupie poddanej działaniu substancji zdecydowanie rozważyły użycie powtórzeń testowych.

Optymalizacja gleby, objętości i stężenia substratu

Stosunek stężenia bufora glebowego do stężenia substratu jest ważną zmienną, która silnie wpływa na mierzoną fluorescencję podczas wykonywania testów enzymatycznych. Ilość gleby w gnojowicy dodanej do oznaczenia lub stężenie substratu może wymagać dostosowania w zależności od aktywności enzymów w próbce gleby. Ilości wybrane do tego przykładu zostały oparte na wcześniejszych testach tych gleb, aby upewnić się, że dostępność substratu jest nieograniczona i że mierzymy maksymalne wskaźniki potencjału w warunkach testu (Vmax) 44,45. Jednak w przypadku próbek gleby, które mają wysokie stężenie enzymów, należy zwiększyć stężenie gleby lub substratu. Odkryliśmy, że zwiększanie stężeń substratów (i odpowiednie dostosowanie krzywej standardowej) może wpływać na liniowość krzywej. Dlatego zalecamy zmniejszenie ilości gleby i/lub proporcjonalne dostosowanie objętości bufora, jeśli to konieczne. Niezależnie od tego ważne jest, aby zoptymalizować stężenie substratu dla każdego badanego rodzaju gleby, ponieważ zmierzone EEA mogą różnić się o rząd wielkości między stężeniami substratów nasyconych i podnasyconych 26. W związku z tym różnice między eksperymentalnymi terapiami (itp.) są podatne na błąd statystyczny typu II i mniejsze prawdopodobieństwo wykrycia w warunkach niedostatecznego nasycenia oraz błąd statystyczny27,35. Aby zoptymalizować stężenia substratów, należy przeprowadzić wstępne testy enzymatyczne na reprezentatywnych próbkach gleby przy użyciu szerokiego zakresu stężeń substratów. Po zarejestrowaniu fluorescencji wystarczy wykreślić dane (podobnie jak w przykładzie z krzywą standardową; Rysunek 1) Identyfikacja stężenia substratu (oś x) odpowiadającego aktywności enzymu (oś y), w którym nachylenie się wyrównuje (~0). Podobnie, stężenie substratu odpowiadające punktowi, w którym nachylenie się wyrównuje (~0), jest dobrym wskaźnikiem optymalnego stężenia substratu dla tej konkretnej gleby.

Test ten ostatecznie mierzy fluorescencję w określonym czasie wytwarzaną przez ugrupowanie fluorogenne, które jest odcinane od substratu w wyniku depolimeryzacji substratu za pośrednictwem enzymów. Dlatego etap 5 (dodawanie substratu) ma kluczowe znaczenie i musi być wykonany tak efektywnie, jak to możliwe, aby zminimalizować czas między dodaniem substratu do gleby a inkubacją testów. Podobnie, gdy substrat wejdzie w kontakt z próbką, zaczną zachodzić reakcje enzymatyczne. Z tego powodu zalecamy korzystanie z pipety wielokanałowej. Zdecydowanie zaleca się, aby zwiększyć wydajność przy użyciu pipety wielokanałowej przed dniem, w którym wykonujesz testy enzymatyczne. Aby to osiągnąć, możesz ćwiczyć pipetowanie wodą, aż będziesz w stanie łatwo przenieść objętość do 96-dołkowych płytek za pomocą pipetatora.

Hartowanie gleby

Hartowanie odnosi się do zmniejszenia intensywności fluorescencji spowodowanego przez cząstki stałe i/lub materiał organiczny w gnojowicach glebowych-inkubacjach26. Na hartowanie można wpłynąć, dostosowując stosunek gleby do bufora25. Ze względu na fluorescencję tła z poszczególnych próbek, bardzo ważne jest przeprowadzenie wzorców z próbkami, aby uwzględnić fluorescencję tła (wygaszanie). Chociaż niektóre protokoły wykorzystują pojedyncze stężenie po przetestowaniu, że sygnał jest liniowy, zdecydowanie zalecamy wdrożenie standardowej kontroli hartowania dla każdej próbki, aby jak najlepiej kontrolować efekty hartowania. Niezastosowanie się do tego spowoduje, że krzywa wzorcowa nie będzie miała zastosowania do próbki i zostanie nieprawidłowo oszacowana aktywność enzymatyczna. Dodawanie wzorców do zawiesin glebowych nie jest zależne od czasu, ponieważ dodawanie wzorca nie wpływa na fluorescencję tła próbki.

Dodawanie NaOH

Dodatek NaOH jest stosowany w niektórych protokołach w celu optymalizacji pomiarów aktywności enzymów fluorometrycznych, ponieważ barwnik fluorescencyjny uwolniony z substratów syntetycznych wykazuje szczytową fluorescencję przy pH>9,026,49. Biorąc pod uwagę tę sugestię, stężenie NaOH niezbędne do pH gnojowicy glebowej (tj. do pH>9) będzie się różnić w zależności od konkretnej gleby i zastosowanego buforu pH26. Inni twierdzą jednak, że NaOH może nie być konieczne, ponieważ intensywność sygnału jest na ogół bardzo wysoka nawet przy niższym pH, a także dlatego, że wprowadza dodatkowe źródło błędu pomiaru. Na przykład wpływ dodatków NaOH na pH gnojowicy, a tym samym fluorescencję MUB lub MUC, zmienia się w czasie25. Wykazano, że substraty połączone z MUB wykazują stałą zwiększoną fluorescencję przez 20 minut po dodatkach NaOH, zanim poziomy się zwężą; podczas gdy MUC wykazywał stałą zmniejszoną fluorescencję przez okres do 60 minut26. Dlatego ważne jest, aby ustandaryzować czas między dodaniem NaOH a pomiarem fluorescencji. Alternatywnie, jeśli poziomy fluorescencji są wystarczająco wykrywalne bez dodawania, przeprowadzenie testów bez dodatku NaOH zostało zasugerowane jako równie akceptowalna alternatywa26.

Temperatura

Przy podejmowaniu decyzji o temperaturze inkubacji należy wziąć pod uwagę wrażliwość na temperaturę. Jeśli głównym celem jest zrozumienie kinetyki enzymów, użycie trzech lub więcej temperatur, jak pokazano za pomocą wykresów Arrheniusa (w sekcji wyników) jest solidnym podejściem. Jeśli miejsce próbki ma charakterystycznie niską temperaturę, taką jak gleba wiecznej zmarzliny, może być konieczne wydłużenie czasu inkubacji, aby umożliwić enzymom reakcję w niższych temperaturach inkubacji. Podczas gdy tradycyjna kinetyka enzymów sugeruje, że wzrost temperatury powinien skutkować zwiększoną aktywnością enzymów, odkryliśmy, że enzymy mogą być specyficzne dla miejsca pod względem wrażliwości na temperaturę50. Dlatego, aby zrozumieć potencjał aktywności enzymów specyficznych dla danego miejsca, bardzo ważne jest, aby temperatura i czas trwania inkubacji były dostosowane tak, aby odzwierciedlały wartości terenowe.

Konkluzja

EE są kluczowymi czynnikami napędzającymi procesy biogeochemiczne w glebie, dlatego musimy być w stanie mierzyć ich aktywność. Pomiar EEA w glebie wiąże się z wieloma wyzwaniami, w tym z interferencją i hamowaniem. Pomimo tych wyzwań, ustandaryzowane protokoły (takie jak ten opisany tutaj) mogą być powszechnie stosowane do pomiaru EEA dla szerokiej gamy enzymów. Chociaż dość łatwo jest wygenerować dane wysokiej jakości zgodnie z tymi protokołami, interpretacja tych danych w kontekście ekologicznym wymaga starannego rozważenia, co te testy naprawdę mierzą i w jaki sposób EEA w warunkach testowych mogą różnić się od tych w warunkach in situ .

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta publikacja została sfinansowana przez Enzymes in the Environment Research Coordination Network Research Research wspierane przez amerykańską Narodową Fundację Nauki (DEB# 1021559). Badania te były wspierane przez amerykańską Narodową Fundację Nauki (DEB# 1021559) oraz Biuro Nauki (Badania Biologiczne i Środowiskowe) Departamentu Energii USA. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy amerykańskiej NSF.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki:
4-Methylumbelliferyl α-D-glukopiranozyd (AG)Sigma AldrichM9766Degradacja cukru
4-Methylumbelliferyl β-D-glukopiranozyd (BG)Sigma AldrichM3633Degradacja cukru
4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside (CB)Sigma AldrichM6018Degradacja celulozy
Chlorowodorek L-leucyno-7-amido-4-metylokoumaryny (LAP)Sigma AldrichL2145Degradacja białek
4-metyloubelliferyl N-acetylo-β-D-glukozaminid (NAG)Sigma AldrichM2133Degradacja chityny
Fosforan 4-metylobulliferylu (PHOS)Sigma AldrichM8883Mineralizacja
fosforu4-metylolumbelliferyl-β-D-ksylopiranozyd (XYL)Sigma AldrichM7008Degradacja hemicelulozy
4-metylolumbelliferon (MUB)Sigma AldrichM1381
7-amino-4-metylokumaryna (MUC)Sigma AldrichA9891
50 mM bezwodny bufor octanu soduFisher ScientificS210-500gleby kwaśne i obojętne
50 mM Tris bufor bazowyFisher ScientificBP154-1podstawowe gleby
Sprzęt
Bel-Art Scienceware jednorazowe zbiorniki pipetująceFisher Scientific14-512-65zbiornik do pipetowania
Elektroniczny; Eppendorf Xplorer; Pipeta 8-kanałowaFisher Scientific13-684-265zakres: 50-1,200 μ l
TipOne 101-1,250 μ l przedłużone naturalne końcówkiUSA Scientific1112 - 172010 stojaków po 96 końcówek (960 końcówek)
Płyta grzewcza; powierzchnia grzewcza: 10 cali x 10 cali.Fisher Scientific11-100-100SHMagnetyczna płytka mieszająca z dyskiem laboratoryjnym
Blender WaringFisher Scientific14-509-7PDwubiegowy; Pojemnik 1 L (34 uncje) ze stali nierdzewnej
DOZOWNIKI butelkowe BRAND Dispensette III DozownikFisher Scientific13-688-231Dozownik; zakres: 5-50 ml
Wheaton Unispense μ Pompy perystaltyczneP Fisher Scientific13-683-7Opcjonalny dozownik
Mieszadło magnetyczne FisherbrandFisher Scientific1451363SIXSłuży do mieszania gnojowicy glebowej po zmieszaniu
Misek ze szkła pyrexowegoWorld Kitchen5304218Pyrex 10 uncji kubek budyniowy
Costar 96-dołkowe czarne lite talerzeFisher Scientific07-200-590Używany do stopnia czytnika płyt
Bloki testowe Costar 96-dołkoweFisher Scientific07-200-700V-dno; 2 ml; sterylne
Thermo Scientific Nunc 96-dołkowe maty do nasadekFisher Scientific14-387-93Sterylna 96-dołkowa mata do studzienek kwadratowych
Wirówka wyposażona w uchwyty do płytek głębinowychThermo Scientific3121Centra-GP8 (ten model nie jest już dostępny)
Wielofunkcyjny czytnik mikropłytek Tecan Infinite serii 200płytek Tecan30016058(ten model nie jest już dostępny)
, Czytnik

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burns, R. G., Dick, R. P. Enzymes in the environment: activity, ecology, and applications. 86, CRC. (2002).
  2. Burns, R. G. Enzyme activity in soil: Location and a possible role in microbial ecology. Soil Biology and Biochemistry. 14 (82), 423-427 (1982).
  3. Bandick, A. K., Dick, R. P. Field management effects on soil enzyme activities. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1471-1479 (1999).
  4. Burns, R. G., et al. Soil enzymes in a changing environment: Current knowledge and future directions. Soil Biology and Biochemistry. 58, 216-234 (2013).
  5. Sinsabaugh, R. L., Hill, B. H., Follstad Shah, J. J. Ecoenzymatic stoichiometry of microbial organic nutrient acquisition in soil and sediment. Nature. 462, 795-798 (2009).
  6. Sinsabaugh, R. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology Letters. 11, 1252-1264 (2008).
  7. Wallenstein, M., Allison, S. D., Ernakovich, J., Steinweg, J. M., Vol Sinsabaugh, R. Soil Biology. Shukla, G., Varma, A. 22, Springer. Berlin Heidelberg. 245-258 (2011).
  8. Wallenstein, M. D., McMahon, S. K., Schimel, J. P. Seasonal variation in enzyme activities and temperature sensitivities in Arctic tundra soils. Global Change Biology. 15, 1631-1639 (2009).
  9. Steinweg, J. M., Dukes, J. S., Wallenstein, M. D. Modeling the effects of temperature and moisture on soil enzyme activity: Linking laboratory assays to continuous field data. Soil Biology and Biochemistry. 55, 85-92 (2012).
  10. Wallenstein, M. D., Weintraub, M. N. Emerging tools for measuring and modeling the in situ activity of soil extracellular enzymes. Soil Biology and Biochemistry. 40, 2098-2106 (2008).
  11. Sinsabaugh, R. L. Phenol oxidase, peroxidase and organic matter dynamics of soil. Soil Biology and Biochemistry. 42, 391-404 (2010).
  12. Allison, S. Soil minerals and humic acids alter enzyme stability: implications for ecosystem processes. Biogeochemistry. 81, 361-373 (2006).
  13. Deng, S., Popova, I. E., Dick, L., Bench Dick, R. scale and microplate format assay of soil enzyme activities using spectroscopic and fluorometric approaches. Applied Soil Ecology. 64, 84-90 (2013).
  14. Sinsabaugh, R., Klug, M. J., Collins, H. P., Yeager, P. E., Peterson, S. O. Standard Soil Methods For Long Term Ecological Research. Robertson, G. P., Coleman, D. C., Bledsoe, C. S., Sollins, P. , Oxford University Press. (1999).
  15. Tabatabai, M. A. Methods of Soil Analysis. Page, A. L., Miller, R. H., Keeney, D. R. 2, American Society of Agronomy, Inc. 903-947 (1994).
  16. Parham, J. A., Detection Deng, S. P. quantification and characterization of B-glucosaminidase activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
  17. Jacks, T. J., Kircher, H. W. Fluorometric assay for the hydrolytic activity of lipase using fatty acyl esters of 4-methylumbelliferone. Analytical Biochemistry. 21 (67), 279-285 (1967).
  18. Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thrombosis Research. 17 (80), 393-402 (1980).
  19. Jasinski, J. P., Woudenberg, R. C. 7-Amino-4-methylcoumarin. Acta Crystallographica Section C. 50, 1954-1956 (1994).
  20. Hoppe, H. G. SIGNIFICANCE OF EXOENZYMATIC ACTIVITIES IN THE ECOLOGY OF BRACKISH WATER - MEASUREMENTS BY MEANS OF METHYLUMBELLIFERYL-SUBSTRATES. Mar. Ecol.-Prog. Ser. 11, 299-308 (1983).
  21. Somville, M. Measurement and Study of Substrate Specificity of Exoglucosidase Activity in Eutrophic Water. Applied and Environmental Microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
  22. Darrah, P. R., Harris, P. J. A fluorimetric method for measuring the activity of soil enzymes. Plant and Soil. 92, 81-88 (1986).
  23. Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and Soil. 175, 147-152 (1995).
  24. Saiya-Cork, K. R., Sinsabaugh, R. L., Zak, D. R. The effects of long term nitrogen deposition on extracellular enzyme activity in an Acer saccharum forest soil. Soil Biology and Biochemistry. 34, 1309-1315 (2002).
  25. DeForest, J. L. The influence of time, storage temperature, and substrate age on potential soil enzyme activity in acidic forest soils using MUB-linked substrates and l-DOPA. Soil Biology and Biochemistry. 41, 1180-1186 (2009).
  26. German, D. P., et al. Optimization of hydrolytic and oxidative enzyme methods for ecosystem studies. Soil Biology and Biochemistry. 43, 1387-1397 (2011).
  27. Marx, M. C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil Biology and Biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
  28. Parton, W. J., Morgan, J. A., Wang, G., Del Grosso, S. Projected ecosystem impact of the Prairie Heating and CO2 Enrichment experiment. New Phytologist. 174, 823-834 (2007).
  29. Morgan, J., et al. C4 grasses prosper as carbon dioxide eliminates desiccation in warmed semi-arid grassland. Nature. 476, (2011).
  30. Carrillo, Y., Pendall, E., Dijkstra, F. A., Morgan, J. A., Newcomb, J. M. Response of soil organic matter pools to elevated CO2 and warming in a semi-arid grassland. Plant and Soil. , (2011).
  31. Allison, S. D., Vitousek, P. M. Responses of extracellular enzymes to simple and complex nutrient inputs. Soil Biology and Biochemistry. 37, 937-944 (2005).
  32. Moorhead, D. L., Sinsabaugh, R. L. A theoretical model of litter decay and microbial interaction. Ecological Monographs. 76, 151(2006).
  33. Allison, S. D., Weintraub, M. N., Gartner, T. B., Waldrop, M. P. Soil Biology. Shukla, G., Varma, A. 22, Springer. Berlin Heidelberg. 229-243 (2011).
  34. Treseder, K. K., Vitousek, P. M. Effects of soil nutrient availability on investment in acquisition of N and P in Hawaiin rain forests. Ecology. 82 (2001), 946-954 (2001).
  35. Fujita, Y., de Ruiter, P., Wassen, M., Heil, G. Time-dependent, species-specific effects of N:P stoichiometry on grassland plant growth. Plant and Soil. 334, 99-112 (2010).
  36. Elser, J. J., Dobberfuhl, D. R., MacKay, N. A., Schampel, J. H. Organism Size, Life History, and N:P Stoichiometry. BioScience. 46, 674-684 (1996).
  37. Allison, V. J., Condron, L. M., Peltzer, D. A., Richardson, S. J., Turner, B. L. Changes in enzyme activities and soil microbial community composition along carbon and nutrient gradients at the Franz Josef chronosequence, New Zealand. Soil Biology and Biochemistry. 39, 1770-1781 (2007).
  38. German, D. P., Marcelo, K. R. B., Stone, M. M., Allison, S. D. The Michaelis - Menten kinetics of soil extracellular enzymes in response to temperature: a cross-latitudinal study. Global Change Biology. 18, 1468-1479 (2012).
  39. German, D. P., Chacon, S. S., Allison, S. D. Substrate concentration and enzyme allocation can affect rates of microbial decomposition. Ecology. 92, 1471-1480 (2011).
  40. Fierer, N., Craine, J. M., McLauchlan, K., Schimel, J. P. Liter quality and the temperature sensitivity of decomposition. Ecology. 86, 320-326 (2005).
  41. Sterner, R. W., Elser, J. J. Ch. 5. Ecological Stoichiometry: The Biology of Elements from Molecules to the Biosphere. Sterner, R. W., Elser, J. J. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 179-230 (2002).
  42. Cleveland, C., Liptzin, D. C:N:P stoichiometry in soil: is there a "Redfield ratio" for the microbial biomass. Biogeochemistry. 85, 235-252 (2007).
  43. Logan, S. R. The origin and status of the Arrhenius equation. Journal of Chemical Education. 59, 279(1982).
  44. Trasar-Cepeda, C., Gil-Sotres, F., Leirós, M. C. Thermodynamic parameters of enzymes in grassland soils from Galicia, NW Spain. Soil Biology and Biochemistry. 39, 311-319 (2007).
  45. Menten, L., Michaelis, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem Z. 49, 333-369 (1913).
  46. Wallenstein, M. D., Haddix, M. L., Lee, D. D., Conant, R. T., Paul, E. A. A litter-slurry technique elucidates the key role of enzyme production and microbial dynamics in temperature sensitivity of organic matter decomposition. Soil Biology and Biochemistry. 47, 18-26 (2012).
  47. Chrost, J. Fluorescence correction for measurements of enzyme activity in natural waters using methylumbelliferyl-substrates. Archiv für Hydrobiologie. 106, 79(1986).
  48. Reed, G. F., Lynn, F., Meade, B. D. Use of Coefficient of Variation in Assessing Variability of Quantitative Assays. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9, 1235-1239 (2002).
  49. Mead, J. A. R., Smith, J. N., Williams, R. T. Studies in detoxification. 67. Biosynthesis of the glucuronides of umbelliferone and 4- Methylumbelliferone and their use in fluorimetric determination of b-glucuronidase. Biochemical Journal. 61, 569-574 (1955).
  50. Haddix, M. L., et al. The Role of Soil Characteristics on Temperature Sensitivity of Soil Organic. Matter. Soil Sci. Soc. Am. J. 75, 56-68 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oznaczenie aktywno ci enzym w glebowychaktywno enzym w zewn trzkom rkowychp ytki g bokodobojowesubstraty fluorescencyjneprzygotowanie zawiesiny glebowejinkubacja i wirowaniedetekcja fluorescencjianaliza krzywej wzorcowejpotencjalna aktywno enzymatyczna

Powiązane artykuły