Artykuł metodologiczny

Produkcja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

DOI:

10.3791/50966

⸱

22 listopada 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1CNRS UMR 7278, IRD198, INSERM U1095, Aix-Marseille Université, 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples "Federico II"

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofagi od dawna są uznawane za kluczowy składnik wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Niedawna eksplozja wiedzy dotyczącej ewolucyjnych, genetycznych i biochemicznych aspektów interakcji między makrofagami a mikroorganizmami ponownie zwróciła uwagę naukowców na makrofagi. W artykule opisano metodę różnicowania makrofagów od szpiku kostnego myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofagi są kluczowymi składnikami wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, i stanowią pierwszą linię obrony przed obcymi najeźdźcami ze względu na ich silne działanie bakteriobójcze. Makrofagi są szeroko rozpowszechnione w całym ciele i są obecne w narządach limfatycznych, wątrobie, płucach, przewodzie pokarmowym, ośrodkowym układzie nerwowym, kościach i skórze. Ze względu na ich repartycję uczestniczą w szerokim zakresie procesów fizjologicznych i patologicznych. Makrofagi to bardzo wszechstronne komórki, które są w stanie rozpoznawać zmiany mikrośrodowiskowe i utrzymywać homeostazę tkanek. Wiele patogenów wyewoluowało mechanizmy wykorzystujące makrofagi jako konie trojańskie do przetrwania, replikacji i zakażania zarówno ludzi, jak i zwierząt oraz do rozprzestrzeniania się w całym ciele. Niedawna eksplozja zainteresowania ewolucyjnymi, genetycznymi i biochemicznymi aspektami interakcji gospodarz-patogen odnowiła uwagę naukowców na makrofagi. W tym miejscu opisujemy procedurę izolacji i hodowli makrofagów z mysiego szpiku kostnego, która zapewni dużą liczbę makrofagów do badania interakcji gospodarz-patogen, a także innych procesów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istotnym aspektem funkcji makrofagów jest ich rola w odporności wrodzonej i nabytej. Ze względu na ich zdolność do fagocytozy obojętnych cząstek, bakterii lub pasożytów, makrofagi są pierwszą linią obrony przed obcymi najeźdźcami. Po internalizacji drobnoustroje są degradowane w fagolizosomach. Makrofagi wysyłają również sygnały rekrutacyjne i prezentują antygeny innym komórkom odpornościowym, takim jak limfocyty T. Makrofagi pochodzą z monocytów. Monocyty powstają w szpiku kostnym z mieloidalnych komórek macierzystych i migrują do krwi obwodowej i różnych tkanek, gdzie różnicują się w makrofagi. Szacuje się, że zdrowa dorosła mysz zawiera około10-8 makrofagów, które są rozmieszczone w całym ciele w różnych narządach i tkankach (Tabela 1)1,2. Makrofagi wykazują dużą różnorodność fenotypową i funkcjonalną ze względu na ich zdolność do przystosowania się do mikrośrodowiska3,4. Najważniejszą właściwością makrofagów jest ich aktywność bakteriobójcza, która określa się jako zdolność do fagocytozy drobnoustrojów i ich niszczenia. Odpowiedź fagocytarna jest definiowana przez aktywację złożonych sieci sygnalizacyjnych, które są stymulowane przez kontakt mikrobiologiczny; W ten sposób makrofagi odpowiednio modulują ekspresję genów w odpowiedzi na różne bodźce. Po fagocytozie drobnoustroje są eliminowane w strukturze zwanej fagolizosomem; Jednak wiele drobnoustrojów chorobotwórczych opracowało strategie mające na celu osłabienie mikrobójczej funkcji makrofagów5. Różnorodność mechanizmów wywrotowych, które są wykorzystywane przez różne gatunki drobnoustrojów, świadczy o złożoności procesu fagocytarnego6 i biogenezy fagolizosomów. Choroby zakaźne są poważnym problemem zdrowotnym człowieka, a liczne mechanizmy i cząsteczki uczestniczą w działaniu przeciwdrobnoustrojowym makrofagów. Co więcej, cele właściwości mikrobójczych, które są przejmowane przez drobnoustroje, pozostają nieznane; W związku z tym następuje eksplozja zainteresowania ewolucyjnymi, genetycznymi i biochemicznymi aspektami interakcji gospodarz-patogen, która ponownie zwróciła uwagę naukowców na makrofagi. Obecnie większość badań w tej dziedzinie prowadzona jest na liniach komórkowych makrofagów, które różnią się od pierwotnych makrofagów aktywnością fagocytarną, produkcją cytokin i regulacją wybuchu oksydacyjnego. Ponadto mniej nadają się do mikroskopii. Do zbadania interakcji makrofagi-patogeny zaleca się stosowanie makrofagów pierwotnych, takich jak makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM), które wykazują więcej cech fizjologicznych. Co więcej, możliwe jest prowadzenie prac nad genetycznie zmodyfikowanymi BMDM, ponieważ makrofagi te mogą być izolowane bezpośrednio od myszy transgenicznych, a dzięki dostępności nowych technologii, takich jak transfekcja lentiwirusowa, ich profil ekspresji genów może zostać zmieniony przez nadekspresję genów lub interferencję RNA. W tym miejscu opisujemy procedurę różnicowania mysiego szpiku kostnego na makrofagi, która dostarczy dużą liczbę makrofagów w ciągu 7 dni do różnych analiz funkcjonalnych, takich jak proteomika7, transkryptomika8, badania transportu wewnątrzkomórkowego9, badania dynamiczne10, genetyczne badania przesiewowe (RNAi) i badania przesiewowe leków11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne

Protokół postępowania ze zwierzętami został zatwierdzony przez naszą instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt "Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Experimental Médico-Chirurgical" (CFREMC, Project permit 10-300122013 dla Erica Ghigo) z Uniwersytetu Aix-Marseille zgodnie z zasadami Décret No° 87-848 z 19.10.1987. Eksperymenty przeprowadzono w Faculté de Médecine de la Timone (pozwolenie na eksperymenty numer 13.385 dla Erica Ghigo).

1. Przygotowanie materiałów i pożywek kulturowych

  1. Wysterylizuj dwa kleszcze, dwie nożyczki, dwa ostrza chirurgiczne, moździerz i tłuczek.
  2. Uzyskać kompletny DMEM zawierający 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 2 mM glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
  3. Rozcieńczyć 10x PBS w sterylnej wodzie destylowanej, aby uzyskać 1x PBS.
  4. Uzyskać lodowaty 1x PBS, lodowaty kompletny DMEM, kompletny DMEM podgrzany do 37 °C.

2. Przygotowanie supernatantów komórkowych L929

  1. Hodować komórki L929 do konfluencji (dwadzieścia kolbo długości 175 cm 2) w kompletnym DMEM w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

Uwaga: Czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) jest niezbędny do wywołania różnicowania komórek krwiotwórczych w makrofagi12. Komórki L929 wytwarzają GM-CSF.

  1. Przy zbiegu zastąp pożywkę hodowlaną świeżym, kompletnym DMEM. Przenieść kolby do temperatury 32 °C, 5% CO2 na 10 dni.
  2. Zebrać, zebrać i odwirować supernatanty w stężeniu 750 x g przez 10 minut. Wyrzucić granulki komórek.
  3. Przechowywać supernatanty w probówkach o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.

3. Przygotowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM)

  1. Poświęć 1 mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.
    1. Używaj sterylnych ostrzy chirurgicznych przez cały czas trwania eksperymentu. Zdezynfekuj skórę 70% alkoholem. Wykonaj nacięcie na górze każdej tylnej nogi i pociągnij skórę w dół w kierunku stopy, aby odsłonić mięsień.
    2. Odetnij tylne nogi, usuń skórę sterylnymi nożyczkami i sterylnymi kleszczami. Umieść nogi na sterylnej szalce Petriego (35/10 mm) zawierającej sterylny, lodowaty 1x PBS (5 ml).
    3. Usuń mięso i mięśnie, które przylegają do kości, za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy.
  2. Przenieść kości na nową, sterylną szalkę Petriego (35/10 mm) zawierającą lodowato, sterylny 1x PBS (5 ml). Umyj kości dwa razy 5 ml lodowatego, sterylnego 1x PBS.
  3. Przenieść kość do sterylnego moździerza zawierającego 5 ml lodowatego, sterylnego 1x PBS.
  4. Odetnij kość piszczelową od kości udowej w stawie sterylnymi nożyczkami. Delikatnie rozbij kości w sterylnym moździerzu zawierającym 5 ml lodowatego, sterylnego 1x PBS za pomocą tłuczka.
  5. Zebrać supernatant w lodowato zimnych probówkach o pojemności 15 ml. Powtórz ten krok 3 razy.
  6. Przefiltruj przez sitko z nylonu o średnicy 70 μm, aby usunąć fragmenty stałe. Odwirować filtrat o sile 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Delikatnie odrzucić supernatant. Oddzielić osad w 10 ml buforu do lizy czerwonych krwinek przez 30 sekund. Dodaj 20 ml lodowatego, kompletnego DMEM.

Uwaga: Celem tego kroku jest usunięcie zanieczyszczających czerwonych krwinek; dlatego ten krok musi być wykonany w ciągu 2 minut, aby uniknąć zmian w komórkach krwiotwórczych przez bufor do lizy czerwonych krwinek.

  1. Wirować przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Delikatnie odrzucić supernatant. Rozdzielić osad w 20 ml kompletnego DMEM, który został ogrzany do 37 °C.
  2. Przenieś zdysocjowane komórki na 2 szalki Petriego (100/20 mm). Inkubować je przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
  3. Zebrać supernatanty w probówkach o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej. Wyrzuć szalki zawierające rezydujące makrofagi.

Uwaga: Celem tego kroku jest wyeliminowanie rezydujących makrofagów szpiku kostnego poprzez ich zdolność do przylegania do plastiku poddanego hodowli. Te rezydujące makrofagi mogą być wykorzystane w innych eksperymentach.

  1. Odwirować zebrane supernatanty o stężeniu 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  2. Delikatnie rozdzielić osad w 10 ml kompletnego DMEM zawierającego 15% supernatantu komórkowego L929. Przefiltruj komórki przez nylonowe sitko o średnicy 40 μm.
  3. Odzyskać filtrat. Dodać zebrany filtrat (10 ml) do 140 ml kompletnego DMEM, który został uzupełniony 15% pożywką komórkową L929.
  4. Rozprowadzić 10 ml zawiesiny komórek na szalce Petriego (15 szalek Petriego, 100/20 mm). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  5. Hoduj komórki przez 3 dni
  6. Dodać 10 ml kompletnego DMEM, który został uzupełniony o 15% L929. Inkubuj komórki przez dodatkowe 4 dni.

Uwaga: Monitoruj wzrost komórek okresowo za pomocą odwróconego mikroskopu (kroki 3.14-3.16). Przylegające makrofagi będą obserwowane po 3 dniach hodowli.

4. Zbieranie BMDM

  1. Usunąć supernatant. Umyj BMDM 2 razy za pomocą kompletnego DMEM
  2. Dodać 5 ml kompletnego DMEM, który został podgrzany do temperatury 37 °C. Odczepić BMDM, delikatnie zeskrobując gumowym policjantem.
  3. Zebrać BMDM do probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 450 x g przez 10 minut. Delikatnie zdysocjować granulki komórek w 20 ml kompletnego DMEM.
  4. Policz BMDM w obecności błękitu trypanowego (nie należy zaobserwować więcej niż 10% śmiertelności).

Uwaga: Generalnie, około 6-7,5 x 107 makrofagów otrzymuje się z 15 szalek Petriego (100/20 mm) makrofagów. Istnieje około 4-5 x 106 makrofagów/szalkę Petriego (100/20 mm).

  1. Przygotuj BMDM zgodnie z wymaganiami eksperymentu. Po 16 godzinach w kompletnych pożywkach w temperaturze 37 °C, 5% CO2 makrofagi ponownie przylegają do nośnika.

5. Przechowywanie BMDM

  1. Zbierz izolowane BMDM (krok 4.3). Wirować przy 450 x g przez 10 min. Uwaga: BMDM mogą być zamrażane w ciekłym azocie.
  2. Zawiesić granulki komórkowe w pożywce do zamrażania składającej się z 10% DMSO i 90% FCS o końcowym stężeniu 4 x 106 komórek/ml i odpipetować 1 ml do każdej ampułki.
  3. Zamrozić komórki z szybkością chłodzenia 1 °C/min. Po 24 godzinach przenieść ampułkę do pojemnika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tej metody było łatwe uzyskanie dużej liczby makrofagów w ciągu kilku dni. Preparat komórek szpiku kostnego przedstawiono na rycinie 1. Kości z tylnej nogi zostały zebrane i rozbite w moździerzu. Po usunięciu rezydujących makrofagów z preparatu komórek szpiku kostnego, komórki szpiku kostnego inkubowano z GM-CSF (dzień 0). Po 3 dniach komórki, które przed hodowlą były okrągłe i nieprzylegające, zaczynają różnicować się w makrofagi i przylegać (ryc. 1A). Analiza cytometryczna z użyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje metodę wytwarzania dużej liczby BMDM. BMDM są komórkami pierwotnymi i mają biologiczną funkcję i właściwości makrofagów zróżnicowanych od monocytów, ponieważ istnieją dojrzałe, w przeciwieństwie do linii komórkowych makrofagów, które są niedojrzałe. BMDM mogą być stosowane do genetycznych badań przesiewowych (RNAi), badań przesiewowych leków, badań funkcjonalnych, badań interakcji gospodarz-patogen i wielu innych obszarów badań.

Przedstawiona w niniej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez CNRS (PICS 2012-2014 dla E.G.) oraz przez grant od Regione Campania (L.R. n.5, 28.03.2002 dla Giovanny Mottola). Filippo Conti jest stypendystą Fundacji Współpracy Naukowej "Infectiopole Sud". Nicola Boucherit jest stypendystką francuskiego Ministerstwa Badań Naukowych i Technologii. Źródła finansowania nie odgrywały żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu danych, analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowywaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMGibco Life Technologies21969-035
Surowica cielęca płoduGibco Life Technologies10270
Penicylina/StreptomycynaGibco Life Technologies15070
GlutaminaGibco Life Technologies25030-024
PBS (10x)LonzaBEM515F
Liza Czerwone Krwinki buforSigmaR7757
Sitko do komórek 70 μ m NylonBD Falcon352350
Sitko do komórek 40 μ m NylonBD Falcon352340
Probówki 50 mldowolny dostawcaNie dotyczy
Probówki 15 mldowolna dostawcaNie dotyczy
szalek Petriego (100/20 mm)dowolny dostawcaniepoddane hodowli
(35/10 mm)dowolny dostawcanie dotyczy
dotyczy Szalki Petriego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
  2. Van Furth, R. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
  3. Adams, D., Halmiton, T. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
  4. Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
  5. Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
  6. Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
  7. Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
  8. Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
  9. Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
  10. Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
  11. Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
  12. Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Makrofagi szpiku kostnegor nicowanie makrofag wekstrakcja szpiku kostnegoprotok hodowli kom rkowejanaliza cytometrycznaobrazowanie konfokalnelokalizacja LPSocena potencja u endocytowegohemoliza erytrocyt wfiltracja przez sitko kom rkowe

Powiązane artykuły