Tutaj opisujemy zastosowanie techniki odchylania wiązki fototermicznej w połączeniu z umieszczonym w klatce związkiem wapnia, DM-nitrofenem, do monitorowania dynamiki mikrosekund i milisekund oraz energetyki zmian strukturalnych związanych ze związkiem wapnia z neuronalnym czujnikiem wapnia, Modulatorem Antagonisty Elementu Regulatorowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Submilisekundowe zmiany konformacyjne w białkach rozwiązane przez odchylenie wiązki fototermicznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Odchylanie wiązki fototermicznej wraz z kalorymetrią fotoakustyczną i siatką termiczną należy do rodziny metod fototermicznych, które monitorują zmiany profilu czasowego, objętości i entalpii zmian konformacyjnych w białkach wywołanych światłem w mikrosekundowych do milisekundowych skalach czasowych, które nie są dostępne przy użyciu tradycyjnych przyrządów do zatrzymywania przepływu. Ponadto, ponieważ badane są ogólne zmiany objętości i/lub entalpii, techniki te można zastosować do białek i innych biomakrocząsteczek, które nie mają etykiety fluoroforowej i/lub chromoforowej. Do monitorowania dynamiki i energetyki zmian strukturalnych związanych z wiązaniem Ca2+ z przetwornikami wapnia, takie neuronalne czujniki wapnia, związek wapnia w sadzce, DM-nitrofen, jest używany do fotowyzwalania szybkiego (τ < 20 μs) wzrostu stężenia wolnego wapnia, a związane z tym zmiany objętości i entalpii są badane za pomocą techniki odchylania wiązki fototermicznej.
Wprowadzenie
Metody fototermiczne, takie jak kalorymetria fotoakustyczna, fototermiczne odchylanie wiązki (PDB) i przejściowe siatkowanie w połączeniu z nanosekundowym wzbudzeniem laserowym, stanowią potężną alternatywę dla przejściowych spektroskopii optycznych dla czasowo-rozdzielczych badań krótkożyciowych produktów pośrednich1,2. W przeciwieństwie do technik optycznych, takich jak absorpcja przejściowa i spektroskopia w podczerwieni, które monitorują profil czasowy zmian absorpcji w otoczeniu chromoforu; Techniki fototermiczne wykrywają zależność czasową zmian ciepła/objętości i dlatego są cennymi narzędziami do badania profili czasowych optycznie "cichych" procesów. Do tej pory kalorymetria fotoakustyczna i siatka przejściowa były z powodzeniem stosowane do badania dynamiki konformacyjnej procesów fotoindukowanych, w tym dwuatomowej migracji ligandów w globinach3,4, oddziaływań ligandów z białkiem czujnika tlenu FixL5, transportu elektronów i protonów w oksydazach hemowo-miedziowych6 i fotosystemie II, a także fotoizomeryzacji w rodopsyny7 i dynamiki konformacyjnej w kryptochromie8.
Aby rozszerzyć zastosowanie technik fototermicznych do systemów biologicznych, które nie posiadają wewnętrznego chromoforu i/lub fluoroforu, technika PBD została połączona z użyciem związku w klatce, aby fotowywołać wzrost stężenia liganda/substratu w ciągu kilku mikrosekund lub szybciej, w zależności od związku w klatce. Podejście to pozwala na monitorowanie dynamiki i energetyki zmian strukturalnych związanych z wiązaniem liganda/substratu z białkami, które nie mają wewnętrznego fluoroforu lub chromoforu i w skali czasowej, która nie jest dostępna dla komercyjnych instrumentów zatrzymujących przepływ. W artykule przedstawiono zastosowanie PBD do monitorowania termodynamiki związku klatkowego, Ca2 + DM-nitrofenu, fotorozszczepienia, a także kinetyki asocjacji Ca2 + z domeną C-końcową neuronalnego czujnika wapnia Modulator Antagonisty Elementu Regulatorowego (DREAM). Ca2+ jest fotouwalniany z Ca2 + DM-nitrofenu w ciągu 10 μs i ponownie wiąże się z niefotolizowaną klatką o stałej czasowej ~300 μs. Z drugiej strony, w obecności apoDREAM obserwuje się dodatkową kinetykę występującą w milisekundowej skali czasowej, która odzwierciedla wiązanie liganda z białkiem. Zastosowanie PBD do badania przemian konformacyjnych w systemach biologicznych zostało w pewien sposób ograniczone ze względu na trudności instrumentalne; np. żmudne ustawienie sondy i wiązki pompy w celu uzyskania silnego i powtarzalnego sygnału PBD. Jednak skrupulatne zaprojektowanie konfiguracji oprzyrządowania, precyzyjna kontrola temperatury oraz staranne ustawienie sondy i wiązki pompy zapewniają spójny i solidny sygnał PBD, który umożliwia monitorowanie czasowo rozdzielonych zmian objętości i entalpii w szerokiej skali czasowej od 10 μs do około 200 ms. Ponadto modyfikacje procedury eksperymentalnej w celu zapewnienia wykrycia próbek i śladów odniesienia w identycznej temperaturze, składzie buforu, orientacji ogniwa optycznego, mocy lasera itp. znacznie zmniejszają błąd doświadczalny w mierzonych objętościach reakcji i entalpiach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie próbek
- Przygotowanie próbek oraz wszystkie manipulacje z nimi należy przeprowadzać w ciemni, aby zapobiec niezamierzonej fotolizie (uncaging).
- Rozpuścić DM-nitrophen ((1-(2-nitro-4,5-dimetoksyfenyl)-N,N,N',N'-tetrakis [(oksy-karbonylo) metylo]-1,2-etanodiaminę) w buforze 50 mM HEPES, 100 mM KCl, pH 7,0 do stężenia końcowego 400 µM (ε350nm = 4330 M-1cm-1 9).
- Dodać CaCl2 z roztworu zapasowego 0,1 M, aby uzyskać pożądany stosunek [Ca2+]:[DM-nitrophen]. Dla białek o wartości Kd dla asocjacji Ca2+ większej niż 10 µM, preferowany jest stosunek [Ca2+]:[DM-nitrophen] wynoszący 1:1, aby zapobiec wiązaniu fotouwolnionego Ca2+ z uwolnionym DM-nitrophenem. Rzeczywiście, przyjmując wartość Kd dla DM-nitrophen na poziomie 10 nM oraz całkowite stężenie DM-nitrophen i Ca2+ wynoszące 400 mM, około 90% białka wiążącego wapń o Kd = 10 μM będzie w formie apo. Z kolei w przypadku badania wiązania Ca2+ z białkami o Kd < 10 µM, zaleca się zmniejszenie stosunku [Ca2+]:[DM-nitrophen] do 0,95, aby zapobiec kompleksowaniu Ca2+ z apo-białkiem przed fotodysocjacją klatki.
- Rozpuścić związek referencyjny, K3[Fe(III)(CN)6] lub Na2CrO4, w tym samym buforze, co w przypadku próbki.
2. Przygotowanie eksperymentu
- Podstawowa konfiguracja eksperymentalna przedstawiona jest na Rysunku 2.
- Należy użyć otworu przepustowego (P2), aby dostosować średnicę wiązki próbną (wyjście lasera He-Ne 632 nm, moc lasera ~5 mW) do 1 mm i przeprowadzić wiązkę próbną przez środek kuwety umieszczonej w uchwycie z kontrolą temperatury, wykorzystując lustro M1.
- Należy użyć lustra (M2) za próbką, aby wycentrować wiązkę próbną na środku detektora czułego na pozycję.
- Wiązkę próbną należy skupić na środku detektora w taki sposób, aby różnica napięć między dwiema górnymi a dwiema dolnymi diodami, a także różnica napięć między dwiema diodami po lewej i prawej stronie detektora wynosiła zero.
- Następnie należy uformować średnicę wiązki pompową (wyjście lasera Nd:YAG z przełączaniem Q 355 nm, FWHM 5 nsec), używając otworu przepustowego 3 mm (P1) umieszczonego pomiędzy dwoma lustrami lasera 355 nm.
- Wiązkę pompową należy przeprowadzić współbieżnie przez środek kuwety, zgodnie z Rysunkiem 2. Ważne jest, aby obie wiązki laserowe przechodziły przez środek ogniwa optycznego w sposób niemal koliniowy, aby uzyskać mierzalny kąt odchylenia, a tym samym wysoką amplitudę sygnału PBD. W warunkach eksperymentalnych kąt przecięcia się wiązki próbnej i pompowej wynosi mniej niż 15°.
- Należy użyć związku referencyjnego do wyrównania wiązki próbnej i pompowej w celu uzyskania satysfakcjonującego sygnału PBD, tj. dobrego stosunku S/N i stabilnej amplitudy PBD w dłuższych skalach czasowych (~100 msec).
- Pozycję wiązki pompowej względem wiązki próbnej należy regulować poprzez stopniową korektę luster lasera 355 nm.
- Amplitudę referencyjnego sygnału PBD mierzy się jako różnicę między dwiema górnymi a dolnymi fotodiodami na detektorze czułym na pozycję. Sygnał PBD powinien wykazywać gwałtowny wzrost amplitudy w krótkiej skali czasowej (<10 µsec) i pozostawać stabilny w skali 100 msec, jak pokazano na Rysunku 3. Zmienność amplitudy PBD z impulsu na impuls mieści się w granicach 5% amplitudy sygnału, a na powtarzalność sygnału wpływają głównie wibracje.
- Liniowość amplitudy sygnału PBD w stosunku do wydzielonej energii cieplnej należy sprawdzić, mierząc liniową zależność sygnału PBD od mocy lasera wzbudzającego oraz od liczby pochłoniętych Einsteinów, Ea = (1-10-A), gdzie A odpowiada absorbancji referencyjnej przy długości fali wzbudzenia.
- Aby zapobiec absorpcji wielofotonowej oraz spadkowi mocy wiązki pompowej i zapewnić liniowość sygnału PBD, moc lasera należy utrzymywać poniżej około 1,000 µJ, a absorbancję próbki/związku referencyjnego przy długości fali wzbudzenia poniżej 0,5.
3. Pomiary PBD
- Rozpocząć od pomiaru śladów PBD dla wzorca. Umieścić roztwór związku wzorcowego w kwarcowej kuciecie o wymiarach 1,0 cm x 1,0 cm lub 1,0 cm x 0,5 cm i umieścić kuwetę w uchwycie z kontrolą temperatury. Obie długości drogi optycznej zapewniają porównywalną amplitudę PBD.
- Wykryć sygnał PBD dla wzorca w funkcji temperatury w zakresie od 16-35 °C z przyrostem temperatury wynoszącym 3 °C.
- Po każdej zmianie temperatury sprawdzić pozycję wiązki sondy na detektorze pozycyjnie czułym i w razie potrzeby ponownie ustawić ją na środku detektora.
- Sprawdzić liniowość sygnału PBD w funkcji członu [(dn/dt)/Cpρ] zgodnie z Równaniem 2.
- Umieścić roztwór próbki w tej samej kuciecie optycznej, co w przypadku związku wzorcowego, zachowując tę samą orientację kuwety, co podczas pomiaru wzorca.
- Wykryć ślady PBD próbki w tym samym zakresie temperatur, co dla wzorca, i sprawdzić liniowość amplitudy PBD próbki względem członu [(dn/dt)/Cpρ].
4. Analiza danych
Wielkość ugięcia jest bezpośrednio proporcjonalna do zmiany objętości wynikającej z nagrzewania próbki (ΔVth) oraz nietermicznej zmiany objętości (ΔVnonth) zgodnie z Równaniem 1: 
Amplitudę sygnału PBD próbki (AS) oraz referencji (Ar) można opisać odpowiednio za pomocą Równania 2 i 3.
![Równowaga statyczna; równanie; AS=KEa[(dn/dt)(1/ρCp)Q+ρ(dn/dp)ΔVnonth+Δnabs].](/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg "figure-protocol-2")
![Równanie dyfuzyjności cieplnej; wzór: Aᵗ = KEₐEₙ[(dn/dt)(1/ρCₚ)]; stosowane w badaniach nad przekazywaniem ciepła.](/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg "figure-protocol-3")
Sygnał PBD jest wprost proporcjonalny do parametru odpowiedzi urządzenia (K) oraz liczby pochłoniętych jednostek Einsteina (Ea). Pierwszy człon w równaniu 2, (dn/dt)(1/ρCp)Q, odpowiada zmianie sygnału wynikającej z ciepła oddanego do rozpuszczalnika. Człon dn/dt reprezentuje zależną od temperatury zmianę współczynnika załamania światła, ρ to gęstość rozpuszczalnika, a Cp to pojemność cieplna. Wszystkie parametry dla wody destylowanej są znane i mogą zostać określone dla roztworu buforowego poprzez porównanie sygnału PBD dla związku referencyjnego w wodzie destylowanej i w odpowiednim buforze. Q to ilość ciepła oddanego do rozpuszczalnika. Człon ρ (dn/d ρ ) jest bezwymiarową stałą, która w zakresie temperatur od 10-40 °C jest niezależna od temperatury 10. Człon Δnabs odpowiada zmianie współczynnika załamania światła wynikającej z obecności gatunków absorbujących w roztworze i jest pomijalny, jeśli długość fali wiązki badawczej jest przesunięta względem widm absorpcyjnych jakichkolwiek gatunków w roztworze. Sygnał pochodzący od związku referencyjnego (Ar) jest wyrażony w równaniu 3, gdzie Ehν to energia fotonu przy długości fali wzbudzenia; Ehν = 80.5 kcal/mol dla wzbudzenia przy 355 nm.
- Przyjmij amplitudę referencyjnego sygnału PBD jako różnicę między sygnałem PBD przed wyzwalaczem a sygnałem po wyzwalaczu, zgodnie z przedstawionym na Rysunku 3. W podobny sposób wyznacz amplitudę fazy szybkiej (Asfast) i powolnej (Asslow) sygnału PBD próbki.
- Aby wyeliminować parametr odpowiedzi instrumentu, K, przeskaluj amplitudę sygnału PBD próbki przez amplitudę sygnału PBD dla referencji. Stosunek sygnału próbki do sygnału referencyjnego daje Równanie 4 i może być zapisany jako:
- Korzystając z tego równania, wyznacz ciepło oddane do roztworu (Q) oraz nietermiczną zmianę objętości (ΔVnonth) związaną z reakcją fotoinicjowaną, odpowiednio z nachylenia i punktu przecięcia wykresu zależności składnika [(As/Ar) Ehν] od składnika zależnego od temperatury [(dn/dt)(1/ρCp)].
- Aby wyznaczyć objętość reakcji i zmianę entalpii dla procesu szybkiego i powolnego, przeskaluj zaobserwowaną zmianę objętości i entalpii do odpowiedniej wydajności kwantowej zgodnie z Równaniami 5-7.
W przypadku procesu wieloetapowego z kinetyką przebiegającą w skali czasowej od 10 µsec do 200 msec można wyznaczyć zmiany objętości i entalpii związane z poszczególnymi etapami reakcji. Amplitudy i czasy życia dla poszczególnych etapów analizuje się poprzez dopasowanie danych do funkcji F(t), która opisuje profil czasowy zmian objętości i entalpii.
![Absorpcja przejściowa, wzór F(t)=α₀+Σαᵢ[1-exp(-t/τᵢ)], równanie w badaniach naukowych.](/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg "figure-protocol-8")
gdzie α0 odpowiada Asfast, a αi odpowiada Asslow dla każdego poszczególnego procesu, a τ i to czas życia poszczególnych etapów reakcji. Z zależności stałej szybkości dla poszczególnych procesów (ki = 1/τi) od temperatury można łatwo wyznaczyć parametry entalpii i entropii aktywacji, korzystając z wykresów Eyringa.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywny przykład śladów PBD dla fotoutwalniania Ca2+ z Ca2+DM-nitrophenu przedstawiono na Rysunku 3. Faza szybka odpowiada fotolizie Ca2+DM-nitrophenu i uwalnianiu Ca2+, natomiast faza wolna odzwierciedla wiązanie Ca2+ do niefotolizowanego klatkowanego związku. Wykresem amplitudy PBD próbki dla fazy szybkiej i wolnej, przeskalowanej do amplitudy związku referencyjnego, w funkcji czynnika zależnego od temperatury [Cpρ/(dn/dt)] zgodn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zasada fizyczna metod fototermicznych polega na tym, że fotowzbudzona cząsteczka rozprasza nadmiar energii poprzez relaksację wibracyjną do stanu podstawowego, co powoduje termiczne podgrzanie otaczającego rozpuszczalnika1,12. W przypadku rozpuszczalników, takich jak woda, powoduje to szybkie rozszerzanie objętości (ΔVth). Cząsteczki w stanie wzbudzonym mogą również ulegać procesom fotochemicznym, które powodują nietermiczne zmiany objętości (ΔVnonth) z powodu rozszczepienia/tworzenia wią...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Science Foundation (MCB 1021831, JM) oraz J. & E. Biomedical Research Program (Departament Zdrowia Florydy, JM).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1-(4,5-dimetoksy-2-nitrofenylo)-1,2-diaminoetan-N,N,N',N' -Tetraoctowy kwas | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrofen, klatkowy związek wapnia, roztwory podstawowe należy przechowywać w ciemności, aby zapobiec fotodysocjacji |
| Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy, N-(2-hydroksyetylo)piperazyna-N′ -(kwas 2-etanosulfonowy) | Sigma Adrich | 0909C | Bufor HEPES |
| Żelazocyjanek potasu (III) | Sigma Aldrich | 702587 | związek referencyjny do pomiarów PBD |
| Chromian sodu | Sigma Aldrich | 307831 | związek referencyjny do pomiarów PBD |
| Dioda laserowa He-Ne 5 mW 635 nm | Edmund Optics | 54-179 | zastosowanie jako wiązka sondy do pomiarów PBD |
| Oscyloskop, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz pasmo |
| laserem Nd:YAG | Continuum | ML II | wiązka pompy do pomiarów PBD |
| M355; Lustro laserowe Nd:YAG | laserowe Edmund Optics | 47-324 | do linii laserowej 355 nm |
| M1 i M2; Lustro diody laserowej | Edmund Optics | 43-532 | wijące płaskie zwierciadło laserowe, zakres długości fal 300-700 nm |
| P1 i P2; Przysłona irysowa | Edmund Optics | 62-649 | otwór na pin do kształtowania sondy i wiązki pum |
| L1; soczewka dwuwypukła | Thorlabs | LB1844 | soczewka do ogniskowania wiązki sondy na detektorze, EFL 50 mm, zakres długości fal 350-2,000 nm |
| DM, zwierciadło dichroiczne | Thorlabs | DMLP505 | długoprzepustowe zwierciadło dichroiczne o długości fali granicznej 505 nm |
| F1; Filtr krawędziowy | Andower | 500FH90-25 | filtr długoprzepustowy o długości fali granicznej 500 nm |
| Uchwyt kuwety z kontrolowaną temperaturą | Quantum Northwest | FLASH 300 |
Bibliografia
- Gensch, T., Viappiani, C. Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology. Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).
- Larsen, R. W., Mikšovská, J. Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins. Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).
- Westrick, J. A., Peters, K. S. A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin. Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).
- Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin. J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).
- Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL. Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).
- Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3. FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).
- Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation. Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).
- Kondoh, M., et al. Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome. J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).
- Eisenberg, H. Equation for the Refractive Index of Water. J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).
- Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen. Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).
- Miksovska, J., Larsen, R. W. Structure-function relationships in metalloproteins. Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).
- Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands. Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).
- Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
