Submilisekundowe zmiany konformacyjne w białkach rozwiązane przez odchylenie wiązki fototermicznej

Podsumowanie

Tutaj opisujemy zastosowanie techniki odchylania wiązki fototermicznej w połączeniu z umieszczonym w klatce związkiem wapnia, DM-nitrofenem, do monitorowania dynamiki mikrosekund i milisekund oraz energetyki zmian strukturalnych związanych ze związkiem wapnia z neuronalnym czujnikiem wapnia, Modulatorem Antagonisty Elementu Regulatorowego.

Streszczenie

Odchylanie wiązki fototermicznej wraz z kalorymetrią fotoakustyczną i siatką termiczną należy do rodziny metod fototermicznych, które monitorują zmiany profilu czasowego, objętości i entalpii zmian konformacyjnych w białkach wywołanych światłem w mikrosekundowych do milisekundowych skalach czasowych, które nie są dostępne przy użyciu tradycyjnych przyrządów do zatrzymywania przepływu. Ponadto, ponieważ badane są ogólne zmiany objętości i/lub entalpii, techniki te można zastosować do białek i innych biomakrocząsteczek, które nie mają etykiety fluoroforowej i/lub chromoforowej. Do monitorowania dynamiki i energetyki zmian strukturalnych związanych z wiązaniem Ca²⁺ z przetwornikami wapnia, takie neuronalne czujniki wapnia, związek wapnia w sadzce, DM-nitrofen, jest używany do fotowyzwalania szybkiego (τ < 20 μs) wzrostu stężenia wolnego wapnia, a związane z tym zmiany objętości i entalpii są badane za pomocą techniki odchylania wiązki fototermicznej.

Wprowadzenie

Metody fototermiczne, takie jak kalorymetria fotoakustyczna, fototermiczne odchylanie wiązki (PDB) i przejściowe siatkowanie w połączeniu z nanosekundowym wzbudzeniem laserowym, stanowią potężną alternatywę dla przejściowych spektroskopii optycznych dla czasowo-rozdzielczych badań krótkożyciowych produktów pośrednich^1,2. W przeciwieństwie do technik optycznych, takich jak absorpcja przejściowa i spektroskopia w podczerwieni, które monitorują profil czasowy zmian absorpcji w otoczeniu chromoforu; Techniki fototermiczne wykrywają zależność czasową zmian ciepła/objętości i dlatego są cennymi narzędziami do badania profili czasowych optycznie "cichych" procesów. Do tej pory kalorymetria fotoakustyczna i siatka przejściowa były z powodzeniem stosowane do badania dynamiki konformacyjnej procesów fotoindukowanych, w tym dwuatomowej migracji ligandów w globinach^3,4, oddziaływań ligandów z białkiem czujnika tlenu FixL⁵, transportu elektronów i protonów w oksydazach hemowo-miedziowych6 i fotosystemie II, a także fotoizomeryzacji w rodopsyny7 i dynamiki konformacyjnej w kryptochromie⁸.

Aby rozszerzyć zastosowanie technik fototermicznych do systemów biologicznych, które nie posiadają wewnętrznego chromoforu i/lub fluoroforu, technika PBD została połączona z użyciem związku w klatce, aby fotowywołać wzrost stężenia liganda/substratu w ciągu kilku mikrosekund lub szybciej, w zależności od związku w klatce. Podejście to pozwala na monitorowanie dynamiki i energetyki zmian strukturalnych związanych z wiązaniem liganda/substratu z białkami, które nie mają wewnętrznego fluoroforu lub chromoforu i w skali czasowej, która nie jest dostępna dla komercyjnych instrumentów zatrzymujących przepływ. W artykule przedstawiono zastosowanie PBD do monitorowania termodynamiki związku klatkowego, Ca^{2 +} DM-nitrofenu, fotorozszczepienia, a także kinetyki asocjacji Ca^{2 +} z domeną C-końcową neuronalnego czujnika wapnia Modulator Antagonisty Elementu Regulatorowego (DREAM). Ca²⁺ jest fotouwalniany z Ca^{2 +} DM-nitrofenu w ciągu 10 μs i ponownie wiąże się z niefotolizowaną klatką o stałej czasowej ~300 μs. Z drugiej strony, w obecności apoDREAM obserwuje się dodatkową kinetykę występującą w milisekundowej skali czasowej, która odzwierciedla wiązanie liganda z białkiem. Zastosowanie PBD do badania przemian konformacyjnych w systemach biologicznych zostało w pewien sposób ograniczone ze względu na trudności instrumentalne; np. żmudne ustawienie sondy i wiązki pompy w celu uzyskania silnego i powtarzalnego sygnału PBD. Jednak skrupulatne zaprojektowanie konfiguracji oprzyrządowania, precyzyjna kontrola temperatury oraz staranne ustawienie sondy i wiązki pompy zapewniają spójny i solidny sygnał PBD, który umożliwia monitorowanie czasowo rozdzielonych zmian objętości i entalpii w szerokiej skali czasowej od 10 μs do około 200 ms. Ponadto modyfikacje procedury eksperymentalnej w celu zapewnienia wykrycia próbek i śladów odniesienia w identycznej temperaturze, składzie buforu, orientacji ogniwa optycznego, mocy lasera itp. znacznie zmniejszają błąd doświadczalny w mierzonych objętościach reakcji i entalpiach.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Przygotowanie próbki i wszystkie czynności związane z próbką należy przeprowadzić w ciemnym pomieszczeniu, aby zapobiec niepożądanemu wyjęciu z klatek.
2. Rozpuścić DM-nitrofen ((1-(2-nitro-4,5-dimetoksyfenylo)-N,N,N',N',N'--tetrakis [(oksy-karbonylo)metylo]-1,2-etanodiamina) w 50 mM buforze HEPES, 100 mM KCl, pH 7,0 do końcowego stężenia 400 μM (ε_350nm = 4330 ^{M-1 cm-1 9}).
3. Dodać CaCl₂ z 0,1 M roztworu podstawowego, aby uzyskać pożądany stosunek [Ca²⁺]:[DM-nitrofen]. W przypadku białek z asocjacją K_d dla Ca²⁺ większą niż 10 μM, stosunek [Ca²⁺]:[DM-nitrofen] wynoszący 1:1 jest preferowany, aby zapobiec wiązaniu uwolnionego foto Ca²⁺ z nieklatkowym DM-nitrofenem. Rzeczywiście, biorąc pod uwagę, że wartość K_d dla azotfenu DM wynosi 10 nM, a całkowite stężenie DM-nitrofenu i Ca²⁺ wynosi 400 mM, ~ 90% białka wiążącego wapń o K_d = 10 μM będzie znajdować się w apoformie. Z drugiej strony, w przypadku badania wiązania Ca^{2 +} z białkami o K_d < 10 μM, lepiej jest zmniejszyć stosunek [Ca^{2 +}] : [DM - nitrofen] do 0,95, aby zapobiec kompleksowaniu Ca^{2 +} z białkiem apo przed fotodysocjacją klatki.
4. Rozpuszczony jest związek odniesienia, K₃[Fe(III)(CN)₆] lub Na₂CrO₄ w tym samym buforze, co w przypadku próbki.

2. Przygotowanie eksperymentu

1. Podstawowa konfiguracja eksperymentalna jest pokazana na rysunku 2.
2. Użyj otworu na szpilkę (P₂), aby wyregulować średnicę wiązki sondy (wyjście 632 nm lasera He-Ne, moc lasera ~5 mW) do 1 mm i rozchodzić wiązkę sondy przez środek ogniwa umieszczonego w uchwycie ogniwa o kontrolowanej temperaturze za pomocą lustra M₁.
3. Użyj lustra (_M2) za próbką, aby wyśrodkować wiązkę sondy na detektorze wrażliwym na środek położenia.
4. Skoncentruj wiązkę sondy na środku detektora w taki sposób, aby różnica napięcia między dwiema górnymi diodami i dwiema dolnymi diodami, a także różnica napięcia między dwiema diodami po lewej i prawej stronie detektora wynosiła zero.
5. Następnie ukształtuj średnicę wiązki pompy, wyjście 355 nm lasera Nd:YAG z przełączaniem Q, FWHM 5 nsec) za pomocą otworu o średnicy 3 mm (P₁) umieszczonego między dwoma lustrami laserowymi 355 nm.
6. Rozpłynąć belkę pompy przez środek kuwety, jak pokazano na rysunku 2. Ważne jest, aby obie wiązki laserowe rozchodziły się przez środek komórki optycznej w sposób niemal współliniowy, aby uzyskać mierzalny kąt odchylenia, a tym samym wysoką amplitudę sygnału PBD. W warunkach eksperymentalnych kąt przecięcia belek sondy i pompy jest mniejszy niż 15°.
7. Użyj związku referencyjnego, aby wyrównać sondę i wiązkę pompy, aby uzyskać zadowalający sygnał PBD, tj. dobry stosunek sygnału do szumu i stabilną amplitudę PBD w dłuższych skalach czasowych (~100 ms).
8. Dostosuj położenie belki pompy w stosunku do wiązki sondy poprzez stopniową regulację luster laserowych 355 nm.
9. Zmierz amplitudę sygnału referencyjnego PBD jako różnicę między dwiema górnymi i dolnymi fotodiodami na detektorze czułym na położenie. Sygnał PBD powinien wykazywać szybki wzrost amplitudy w szybkiej skali czasowej (<10 μs) i pozostawać stabilny w skali czasowej 100 ms, jak pokazano na rysunku 3. Zmienność amplitudy PDB między strzałami mieści się w granicach 5% amplitudy sygnału, a na odtwarzalność sygnału wpływają głównie drgania.
10. Sprawdź liniowość amplitudy sygnału PBD w odniesieniu do uwolnionej energii cieplnej, mierząc liniową zależność sygnału PBD od mocy lasera wzbudzającego i od liczby pochłoniętych Einsteinów, E_a = (1-10-A), gdzie A odpowiada absorbancji odniesienia na długości fali wzbudzenia.
11. Utrzymuj moc lasera poniżej około 1,000 μJ i absorbancję próbki/związku odniesienia przy długości fali wzbudzenia mniejszej niż 0,5, aby zapobiec odpowiednio absorpcji wielofotonowej i spadkowi mocy wiązki pompy oraz zapewnić liniowość sygnału PBD.

3. Pomiary PBD

1. Rozpocznij od pomiaru śladów PBD dla odniesienia. Umieścić roztwór związku odniesienia w kuwetce kwarcowej o wymiarach 1,0 cm x 1,0 cm lub 1,0 cm x 0,5 cm i umieścić ogniwo w uchwycie o kontrolowanej temperaturze. Obie długości ścieżek zapewniają porównywalną amplitudę PBD.
2. Wykrywać referencyjny sygnał PBD w funkcji temperatury w zakresie temperatur od 16 do 35 °C ze wzrostem temperatury o 3 °C.
3. Przy każdej zmianie temperatury sprawdź położenie wiązki sondy na detektorze czułym na położenie i w razie potrzeby ponownie dostosuj pozycję do środka detektora.
4. Sprawdź liniowość sygnału PBD w funkcji składnika [(dn/dt)/C_pρ] zgodnie z równaniem 2.
5. Umieścić roztwór próbki w tej samej celi optycznej, co w przypadku związku odniesienia, zachowując tę samą orientację celi optycznej, co w przypadku pomiaru referencyjnego.
6. Wykryć ślady PBD próbki w tym samym zakresie temperatur, co dla wzorca i sprawdzić liniowość amplitudy PBD próbki w odniesieniu do składnika [(dn/dt)/C_pρ].

4. Analiza danych

Wielkość ugięcia jest wprost proporcjonalna do zmiany objętości spowodowanej nagrzewaniem próbki (ΔV_th) i nietermicznej zmiany objętości (ΔV_nonth) zgodnie z równaniem 1:

Amplitudę próbki (A_{, S}) i sygnał odniesienia (A_r) PBD można opisać za pomocą równań odpowiednio 2 i 3.

Sygnał PBD jest wprost proporcjonalny do parametru odpowiedzi instrumentu (K) i liczby wchłoniętych Einsteinów (E_a). Pierwszy składnik równania 2, (dn/dt)(1/ρC_p)Q, odpowiada zmianie sygnału spowodowanej ciepłem uwolnionym do rozpuszczalnika. Składnik dn/dt reprezentuje zależną od temperatury zmianę współczynnika załamania, ρ to gęstość rozpuszczalnika, C_p to pojemność cieplna. Wszystkie parametry są znane dla wody destylowanej i można je określić dla roztworu buforowego, porównując sygnał PBD dla związku odniesienia w wodzie destylowanej i w odpowiednim buforze. Q jest ilością ciepła zwróconego do rozpuszczalnika. Człon ρ (dn/d ρ ) jest stałą bezjednostkową, która jest niezależna od temperatury w zakresie temperatur od 10-40 °C ¹⁰. Termin Δn_abs odpowiada zmianie współczynnika załamania światła spowodowanej obecnością związków absorbujących w roztworze i jest nieistotny, jeśli długość fali wiązki sondy jest przesunięta względem widm absorpcyjnych dowolnego rodzaju w roztworze. Sygnał powstający ze związku odniesienia (A_r) jest wyrażony równaniem 3, gdzie E_hν jest energią fotonu o długości fali wzbudzenia, E_hν = 80,5 kcal/mol dla wzbudzenia 355 nm.

1. Przyjmij amplitudę referencyjnego sygnału PBD jako różnicę między sygnałem PBD przed i po wyzwoleniu, jak pokazano na rysunku 3. W podobny sposób określ amplitudę szybkiej (A^{s fast}) i wolnej fazy (A_s^wolno) próbki sygnału PBD.
2. Aby wyeliminować parametr odpowiedzi przyrządu, K, przeskaluj amplitudę sygnału PBD próbki przez amplitudę sygnału PBD dla odniesienia. Stosunek sygnału próbki do sygnału odniesienia daje równanie 4 i można go zapisać jako:
   
   
3. Korzystając z tego równania, określ ciepło uwolnione do roztworu (Q) i nietermiczną zmianę objętości (ΔV_nonth) związaną z reakcją zainicjowaną światłem ze zbocza i przecięcie, odpowiednio, wykresu terminu [(A_s/A_r) E_hν] w zależności od temperatury składnika [(dn/dt)(1/ρCp)].
4. Aby określić objętość reakcji i zmianę entalpii dla procesu szybkiego i wolnego, przeskaluj obserwowaną objętość i zmianę entalpii do odpowiedniej wydajności kwantowej zgodnie z równaniami 5-7.
   
   
   
   
   
   
   Dla procesu wieloetapowego, w którym kinetyka zachodzi w skali czasowej między 10 μsec~200 ms, można określić zmiany objętości i entalpii związane z poszczególnymi etapami reakcji. Amplitudy i czasy życia dla poszczególnych kroków są analizowane poprzez dopasowanie danych do funkcji F(t), która opisuje profil czasowy zmian objętości i entalpii.
   
   gdzie α₀ odpowiada szybkiemu A_,^a _{α i} odpowiada ^wolnemu A_s dla każdego pojedynczego procesu, a τ _i oznacza czas życia poszczególnych etapów reakcji. Na podstawie zależności od temperatury stałej szybkości dla poszczególnych procesów (k_i = 1/τ_i) parametry entalpii aktywacji i entropii można łatwo określić za pomocą wykresów Eyringa.

Wyniki

Reprezentatywny przykład śladów PBD dla fotouwalniania Ca²⁺ z Ca²⁺DM-nitrofenu jest pokazany na rysunku 3. Faza szybka odpowiada fotorozszczepieniu Ca^{2 +} DM - nitrofenu i uwolnieniu Ca^{2 +}, podczas gdy faza wolna odzwierciedla wiązanie Ca^{2 +} z klatką niefotolizowaną. Wykres amplitudy PBD próbki dla fazy szybkiej i wolnej przeskalowany do amplitudy związku odniesienia w funkcji współczynnika zależnego od temperatury [C,_p, ρ/(dn/dt)], współcz...

Dyskusja

Zasada fizyczna metod fototermicznych polega na tym, że fotowzbudzona cząsteczka rozprasza nadmiar energii poprzez relaksację wibracyjną do stanu podstawowego, co powoduje termiczne podgrzanie otaczającego rozpuszczalnika^1,12. W przypadku rozpuszczalników, takich jak woda, powoduje to szybkie rozszerzanie objętości (ΔV_th). Cząsteczki w stanie wzbudzonym mogą również ulegać procesom fotochemicznym, które powodują nietermiczne zmiany objętości (ΔV_nonth) z powodu rozszczepienia/tworzenia wią...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1-(4,5-dimetoksy-2-nitrofenylo)-1,2-diaminoetan-N,N,N',N' -Tetraoctowy kwas	Life Technologies	D-6814	DM-nitrofen, klatkowy związek wapnia, roztwory podstawowe należy przechowywać w ciemności, aby zapobiec fotodysocjacji
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy, N-(2-hydroksyetylo)piperazyna-N′ -(kwas 2-etanosulfonowy)	Sigma Adrich	0909C	Bufor HEPES
Żelazocyjanek potasu (III)	Sigma Aldrich	702587	związek referencyjny do pomiarów PBD
Chromian sodu	Sigma Aldrich	307831	związek referencyjny do pomiarów PBD
Dioda laserowa He-Ne 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	zastosowanie jako wiązka sondy do pomiarów PBD
Oscyloskop,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz pasmo
laserem Nd:YAG	Continuum	ML II	wiązka pompy do pomiarów PBD
M355; Lustro laserowe Nd:YAG	laserowe Edmund Optics	47-324	do linii laserowej 355 nm
M1 i M2; Lustro diody laserowej	Edmund Optics	43-532	wijące płaskie zwierciadło laserowe, zakres długości fal 300-700 nm
P1 i P2; Przysłona irysowa	Edmund Optics	62-649	otwór na pin do kształtowania sondy i wiązki pum
L1; soczewka dwuwypukła	Thorlabs	LB1844	soczewka do ogniskowania wiązki sondy na detektorze, EFL 50 mm, zakres długości fal 350-2,000 nm
DM, zwierciadło dichroiczne	Thorlabs	DMLP505	długoprzepustowe zwierciadło dichroiczne o długości fali granicznej 505 nm
F1; Filtr krawędziowy	Andower	500FH90-25	filtr długoprzepustowy o długości fali granicznej 500 nm
Uchwyt kuwety z kontrolowaną temperaturą	Quantum Northwest	FLASH 300