Analiza wideomorfometryczna niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych tętnic wewnątrzpłucnych przy użyciu mysich precyzyjnie wyciętych plastrów płuc

Podsumowanie

Niedotlenienie naczyń płucnych (HPV) jest ważnym zjawiskiem fizjologicznym, dzięki któremu przy niedotlenieniu pęcherzyków płucnych perfuzja płuc jest dopasowana do wentylacji. Głównym segmentem naczyniowym przyczyniającym się do HPV jest tętnica wewnątrzgroniasta. W tym miejscu opisujemy nasz protokół analizy HPV mysich naczyń płucnych o średnicach 20-100 μm.

Streszczenie

Ostra hipoksja pęcherzyków płucnych powoduje zwężenie naczyń płucnych (HPV) - znane również jako mechanizm von Eulera-Liljestranda - który służy do dopasowania perfuzji płuc do wentylacji. Do tej pory mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska nie są w pełni poznane. Głównym segmentem naczyniowym przyczyniającym się do HPV jest tętnica wewnątrzgroniasta. Ten odcinek naczynia jest odpowiedzialny za dopływ krwi do pojedynczego acinusa, który definiuje się jako część płuc dystalną do końcowego oskrzelika. Tętnice wewnątrzzrazikowe są najczęściej zlokalizowane w tej części płuca, do której nie można selektywnie dotrzeć za pomocą wielu powszechnie stosowanych technik, takich jak pomiar ciśnienia w tętnicy płucnej w izolowanych perfundowanych płucach lub zapisy siły z wypreparowanych bliższych odcinków tętnicy płucnej^1,2. Analiza naczyń podopłucnowych za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii luminescencyjnej w czasie rzeczywistym jest ograniczona do naczyń o średnicy do 50 μm³.

Udostępniamy technikę badania HPV mysich tętnic wewnątrzpłucnych w zakresie średnic wewnętrznych 20-100 μm. Opiera się ona na analizie wideomorfometrycznej tętnic o przekroju poprzecznym w precyzyjnie wyciętych plastrach płuc (PCLS). Metoda ta pozwala na ilościowy pomiar aktywności naczyniowej małych tętnic wewnątrzgrobiorowych o średnicy wewnętrznej w zakresie 20-40 μm, które znajdują się w klinach przegród pęcherzykowych obok przewodów pęcherzykowych oraz większych tętnic przedgroniastych o średnicach wewnętrznych w zakresie 40-100 μm, które biegną w sąsiedztwie oskrzeli i oskrzelików. W przeciwieństwie do obrazowania naczyń podopłucnowych w czasie rzeczywistym u znieczulonych i wentylowanych myszy, analiza wideomorfometryczna PCLS odbywa się w warunkach wolnych od naprężeń ścinających. W naszym modelu eksperymentalnym oba odcinki tętnic wykazują jednofazowy HPV pod wpływem medium gazowanego 1%_O2, a odpowiedź zanika po 30-40 minutach w niedotlenieniu.

Wprowadzenie

W większości układowych łożysk naczyniowych niedotlenienie powoduje rozszerzenie naczyń krwionośnych, w porównaniu do zwężenia naczyń krwionośnych spowodowanego niedotlenieniem w naczyniach płucnych. Ta specyficzna dla płuc reakcja na obniżone ciśnienie tlenu nazywana jest niedotlenieniem naczyń płucnych (HPV), pojawia się w ciągu kilku sekund i szybko odwraca się po powrocie do wentylacji normoksyjnej. Chociaż wirus HPV jest znany od ponad 60 lat, komórkowy czujnik tlenu i kaskada sygnalizacyjna powodująca zwężenie naczyń krwionośnych są nadal przedmiotem dyskusji. Istnieje względnie szeroki konsensus co do tego, że wywołane niedotlenieniem zmiany redoks i ROS są niezbędne dla HPV i rozwoju nadciśnienia płucnego (przegląd w Sylvester i wsp.⁴ oraz Schumacker i wsp.⁵). Nasze własne dane potwierdzają centralną rolę kompleksu II mitochondrialnego łańcucha oddechowego w HPV^6,7. Ostatnio Wang i wsp. przedstawili zupełnie nową koncepcję wykrywania tlenu i HPV: Na podstawie swoich danych proponują, że niedotlenienie pęcherzyków płucnych jest wyczuwane przez sąsiednie naczynia włosowate, powodując depolaryzację błony komórek śródbłonka. Odpowiedź jest propagowana poprzez połączenie 40 połączeń szczelinowych komórek śródbłonka, co prowadzi do zwężenia komórek mięśni gładkich tętniczek znajdujących się w górnym biegu⁸.

Tętnice płuc biegną wzdłuż dróg oddechowych, rozgałęziają się wraz z nimi, stale zmniejszając średnicę, aż w końcu dostarczają krew do systemu naczyń włosowatych znajdujących się w ścianach pęcherzyków płucnych. To krążenie tętnicze składa się z anatomicznie i funkcjonalnie odrębnych segmentów. Po tętnicach proksymalnych przewodowych, charakteryzujących się dużą ilością elastycznych włókien w ścianach, następują w pełni umięśnione tętnice wewnątrzpłucne, które w dużej mierze kontrolują opór naczyniowy płuc. Krok po kroku tętnice te przechodzą w segmenty, w których warstwa mięśniowa staje się niekompletna, a ostatecznie naczynia są wolne od komórek immunoreaktywnych aktyny mięśni gładkich. Tętnica wewnątrzgrobkowa zasilająca pojedynczą ziarnienkę płucną krwią reprezentuje częściowo mięśniowy segment⁶. Podobnie tętniczy układ płucny nie reprezentuje jednolitej struktury pod względem odpowiedzi niedotlenienia, ale wykazuje wyraźną różnorodność regionalną^9,10. Na przykład w proksymalnych tętnicach płucnych odizolowanych od płuc szczura niedotlenienie wywołuje reakcję dwufazową, wykazując początkowy szybki skurcz o krótkim czasie trwania, po którym - po niepełnym rozluźnieniu - następuje drugi powolny, ale trwały skurcz¹¹. W tętnicach opornych izolowanych z miąższu płuc szczura jako czwarty i piąty podział tętnic płucnych (średnica zewnętrzna <300 μm) niedotlenienie powoduje zwężenie jednofazowe⁹. Już w 1971 roku Glazier i Murray doszli do wniosku, na podstawie pomiarów zmian stężenia czerwonych krwinek włośniczkowych w płucach psów wentylowanych mieszaninami gazów hipoksycznych, że wywołany niedotlenieniem wzrost oporu naczyniowego występuje głównie przed naczyniami włosowatymi¹². Obecnie mikroskopia przyżyciowa nienaruszonych płuc znieczulonych i wentylowanych mechanicznie myszy stanowi potężne narzędzie do analizy mikrokrążenia płucnego^13,14. Wycięcie okrągłego okienka w ścianie klatki piersiowej daje mikroskopijny dostęp do powierzchni płuca i umożliwia analizę podopłucnowych naczyń płucnych o średnicy do 50 μm. Łącząc tę technikę z infuzją dekstranu FITC, Tabuchi i wsp. Wykazano, że tylko średniej wielkości tętniczki o średnicy 30-50 μm wykazują wyraźną odpowiedź na niedotlenienie, które utrzymywało się przez okres 60 minut z niewielkim osłabieniem po 30 minutach. Natomiast małe tętniczki o średnicach 20-30 μm wykazywały tylko niewielką odpowiedź na niedotlenienie³. Technika ta nie pozwala jednak na analizę tętnic o średnicy większej niż 50 μm, ponieważ naczynia te znajdują się zbyt głęboko w tkance płucnej.

Aby wypełnić lukę w analizie dużych i bardzo małych tętnic płucnych (takich jak naczynia podopłucnowe) mysich płuc, przyjęliśmy metodę opisaną przez Martina i wsp. do analizy reaktywności dróg oddechowych¹⁵. Oparty na technice wkraplania żelu agarozowego, ułatwia przygotowanie precyzyjnie wyciętych plastrów płuc (PCLS) z tego stosunkowo miękkiego i elastycznego narządu. W obrębie PCLS aktywność naczyniową tętnic o przekroju poprzecznym o średnicy wewnętrznej od 20 do 100 μm można bezpośrednio obserwować za pomocą wideomikroskopii. Stosowanie leków podczas inkubacji hipoksyjnej PCLS pozwala na analizę ich wpływu na HPV. Szczególnie ważne jest, że technika ta może być również stosowana w przypadku myszy modyfikowanych genetycznie. Na podstawie ich lokalizacji w płucach klasyfikujemy tętnice jako naczynia przed- i wewnątrzziarniaste, o średnicach wewnętrznych odpowiednio 20-40 μm i 40-100 μm. W ujęciu funkcjonalnym tętnica wewnątrzzrazikowa zaopatruje w krew pojedynczą wycinkę zrazikową płuc, a tętnica przedzrazikowa to odcinki naczynia poprzedzającego. Zapis obrazów na aparacie cyfrowym pozwala na późniejsze ilościowe określenie reakcji wazologicznej. Oczywistą cechą tego modelu PCLS jest brak naprężeń ścinających działających na śródbłonek. Natomiast w naczyniach perfundowanych ostry HPV prowadzi do wzrostu naprężeń ścinających, indukując w ten sposób mechanizmy wtórne, takie jak uwalnianie NO¹⁶. Dodatkowo zastosowanie PCLS pozwala na pomiary HPV bez pozapłucnych wpływów nerwowych lub hormonalnych. W przeciwieństwie do systemów hodowli komórkowych, na przykład przygotowanych z komórek mięśni gładkich tętnic płucnych^{psów 17}, architektura histologiczna ściany naczynia jest prawie całkowicie zachowana.

Podsumowując, ten protokół dostarcza pomocnej metody do analizy potencjalnych czujników tlenu molekularnego i/lub szlaków komórkowych odpowiedzialnych za HPV tętnic wewnątrzpłucnych o średnicach wewnętrznych między 20-100 μm w warunkach wolnych od naprężeń ścinających.

Protokół

1. Przygotowanie mieszanin gazów, sprzętu, przyrządów i roztworów

Ta sekcja opisuje niezbędny sprzęt i ustawienia dla protokołu. Dodatkowe informacje i informacje o producencie można znaleźć w załączonej tabeli.

1. Otrzymać lub przygotować następujące mieszaniny gazów:
   1. Dwie butle z normoksyczną mieszaniną gazów składającą się z 21% O₂, 5,3% CO₂, 73,7% N₂.
   2. Jedna butla z hipoksyjną mieszaniną gazów składającą się z 1% O₂, 5,3% CO_{2 i} 93,7% N₂.
2. Zgromadź następujący ekwipunek:
   1. Kuchenka mikrofalowa do topienia agarozy.
   2. Szafa grzewcza, do wypłukiwania agarozy z odcinków płuc (patrz poniżej). Włóż rurkę podłączoną do butelki z normoksyczną mieszaniną gazów do szafki.
   3. Wibratom z odpowiednimi żyletkami, do krojenia płuc na plastry o grubości 200 μm. Jest to korzystne, jeśli wibratom jest wyposażony w zestaw chłodniczy do schładzania bufora w basenie wibratomu.
   4. Przepływowa komora superfuzyjna zamontowana na odwróconym mikroskopie, do analizy HPV tętnic wewnątrzpłucnych.
      1. Aby ułatwić mocowanie odcinków płuc do dna komory, połącz nylonowe struny z platynowym pierścieniem (samodzielnie skonstruowanym). Połączyć komorę perfuzyjną z pompą perystaltyczną o natężeniu przepływu dostosowanym odpowiednio do 0,7 ml/min i 6 ml/min.
      2. Zmontuj sprzęt w taki sposób, aby podczas eksperymentów pożywki były przechowywane w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i bąbelkowane gazem normoksycznym lub hipoksyjnym za pomocą kaniul 21 G x 4 3/4. Dodatkowo należy użyć drugiego przyłącza z butli gazowej, aby umożliwić wprowadzenie mieszanin gazów normoksycznych/hipoksyjnych do przestrzeni powietrznej komory perfuzyjnej. Upewnij się, że wszystkie rurki tego systemu są gazoszczelne.
   5. Kamera CCD zamontowana na pionowym mikroskopie odwróconym do rejestrowania obrazów analizowanej tętnicy.
   6. Przygotuj następujące instrumenty:
      1. Do przygotowania płuc: sterylny zestaw preparacyjny zawierający szorstkie nożyczki i dwie pary kleszczy, cienkie nożyczki do otwierania klatki piersiowej, mikronożyczki do wycinania otworu w tchawicy w celu wypełnienia agarozy oraz bawełniany zestaw do szycia (około 20 cm) do podwiązania tchawicy w celu zapobieżenia odpływowi agarozy.
      2. W celu wypełnienia dróg oddechowych agarozą: podłączyć strzykawkę o pojemności 2 ml do elastycznej plastikowej rurki kaniuli dożylnej (20 G x 1 1/4).
      3. Do perfuzji płuc z buforem: umieścić strzykawkę o pojemności 50 ml jako zbiornik buforowy około 40 cm powyżej miejsca pracy dla preparatu dla myszy.
      4. W celu wypływu buforu: podłączyć strzykawkę do rurki, do której podłączona jest kaniula 25 G x 1. Użyj zacisku na probówce, aby wyregulować odpływ do około 1 kropli/s (około 0,3-0,4 ml/min).
   7. Przygotuj następujące i pożywki:
      1. Przygotować 1 000 ml buforu HEPES-Ringer (10 mM HEPES, 136,4 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1 mM MgCl₂•6H₂O, 2,2 mM CaCl₂•2H₂O, 11 mM glukozy, pH 7,4). Przechowywać sterylny przefiltrowany bufor (wielkość porów filtra: 0,2 μm) w temperaturze 4 °C.
   8. Na około 30 minut przed rozpoczęciem izolacji płuc należy przygotować następujące roztwory:
      1. Rozpuść 1,5% w/v agarozy o niskiej temperaturze topnienia w buforze HEPES-Ringer (całkowita objętość 10 ml) i rozpuść go gotując w kuchence mikrofalowej. Następnie schłodzić go do temperatury 37 °C, przechowując go w komorze grzewczej. Rozgrzej strzykawkę o pojemności 2 ml do napełnienia agarozy do płucnych dróg oddechowych.
      2. Pobrać 20 ml buforu HEPES-Ringer, dodać heparynę do końcowego stężenia 250 j.m./ml i podgrzać bufor do temperatury 37 °C. Bezpośrednio przed użyciem dodać nitroprusydek sodu do końcowego stężenia 75 μM. Jest to bufor perfuzyjny do odprowadzania krwi z naczyń płucnych.
      3. Umieścić 200 ml buforu HEPES-Ringer w szklanej zlewce i przechowywać na lodzie. Ten bufor będzie potrzebny do schładzania izolowanych płuc wypełnionych agarozą.
      4. Napełnić około 200 ml MEM uzupełnionego 1% penicyliną/streptomycyną w szklanej zlewce i przechowywać w temperaturze 37 °C w komorze grzewczej. Bąbelkować podłoże normoksyczną mieszaniną gazów. Zostanie to wykorzystane do usunięcia agarozy z odcinków płuc.
      5. Rozgrzej 2 butelki MEM uzupełnione 1% penicyliną/streptomycyną w łaźni wodnej do temperatury 37 °C i bąbelkuj je odpowiednio normoksyczną i hipoksyjną mieszaniną gazów przez co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem pomiarów wideomorfometrycznych. Na pomiar wymagane będzie około 250 ml MEM.
   9. Zbierz następujące materiały dodatkowe:
      1. 70% EtOH do dezynfekcji.
      2. Roztwór podstawowy heparyny (25 000 j.m./5 ml), przechowywany w temperaturze 4 °C (patrz wyżej).
      3. Roztwór podstawowy nitroprusydku sodu (Nipruss) będącego donorem NO: 10 mM w_H2O, przechowywany na lodzie (patrz wyżej).
      4. Roztwór podstawowy analogu tromboksanu U46619: 10 μM w etanolu, przechowywany na lodzie.
      5. Klej Superglue.
      6. Szycie bawełny do podwiązania tchawicy po wypełnieniu agarozą.

2. Zwierzęta

Używaj myszy (na przykład szczepu C57Bl6) obu płci w wieku 10-25 tygodni. HPV może być również analizowany w szczepach nokautujących i odpowiadających im szczepach typu dzikiego.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt doświadczalnych i zostały zatwierdzone przez lokalne rady instytucjonalne.

3. Izolacja płuc myszy i przygotowanie precyzyjnie ciętych plastrów płuc (PCLS)

1. Zabij mysz przez zwichnięcie szyjki macicy. Natychmiast po uśmierceniu wysterylizuj brzuszną powierzchnię ciała 70% EtOH i użyj szorstkich nożyczek, aby przeciąć skórę wzdłuż brzusznej linii środkowej od podbródka do miednicy.
   Uwaga: Ponieważ wiadomo, że wziewne środki znieczulające, takie jak izofluran, mają wpływ na napięcie naczyniowe^18,19, nie należy stosować lotnych środków znieczulających.
2. Po otwarciu jamy brzusznej odłóż pętle jelitowe na bok i odetnij duże naczynia brzuszne w celu krwawienia. Po przebiciu przepony cienkimi nożycami płuca zapadną się w wyniku wniknięcia powietrza do jamy opłucnej. Użyj nożyczek, aby odłączyć membranę od dolnego otworu klatki piersiowej. Przetnij żebra i obojczyk z boku, aby usunąć brzuszną część klatki rozrywającej.
   Uwaga: Ważne jest, aby na tym etapie nie doszło do uszkodzenia płuc, ponieważ w przeciwnym razie wzdęcia płuc z agarozą będą niemożliwe! Używaj wyłącznie sterylnych narzędzi i szkła laboratoryjnego.
3. Przed rozpoczęciem perfuzji układu krążenia płucnego należy wyciąć mały otwór w lewej komorze serca w celu odprowadzenia buforu. Napełnić zbiornik strzykawki ciepłym (37 °C) buforem HEPES-Ringer zawierającym heparynę i nitroprusydek sodu (bufor perfuzyjny) i powoli perfekować układ płucny przez prawą komorę.
   Uwaga: Perfuzja jest skuteczna, gdy płuca zmieniają kolor i uzyskują biały wygląd. Na tym etapie ważne jest, aby dodać nitroprusydek sodu do buforu perfuzyjnego; Zapobiega to odrywaniu się tętnic przedgroniastych od otaczającej tkanki.
4. Usuń gruczoły ślinowe, małe mięśnie i tkankę łączną z tchawicy. Odłącz tchawicę od otaczającej tkanki łącznej i nawij bawełnę do wszywania nici między przełykiem a tchawicą w celu późniejszego podwiązania.
5. Użyj mikronożyczek, aby wyciąć mały otwór w górnej części tchawicy między dwiema sąsiednimi chrząstkami tchawicy. Teraz włóż elastyczną plastikową rurkę kaniuli dożylnej przez mały otwór do tchawicy i ostrożnie przymocuj ją bawełną do szycia. Powoli napełniaj drogi oddechowe ciepłą (37 °C) agarozą o niskiej temperaturze topnienia. Obserwuj płuca: Najpierw prawe płuco zaczyna się rozszerzać, a następnie lewe płuco. Napełnianie jest zakończone, gdy oba płuca są napompowane do objętości porównywalnej z sytuacją in vivo (około 1,2-2,0 ml w zależności od płci, wieku i masy ciała).
   Uwaga: Jeśli rozszerza się tylko jedno płuco, plastikowa rurka mogła zostać włożona zbyt głęboko, tak że dotarła do oskrzeli. W takim przypadku trzeba go trochę wyciągnąć. Należy pamiętać, że agaroza zestala się, gdy stopniowo ostygnie.
6. Gdy płuca są pełne, jednocześnie wyciągnij plastikową rurkę i podwiąż tchawicę bawełną do szycia, aby zapobiec odpływowi agarozy. Następnie przeciąć tchawicę powyżej ligatury i odłączyć płuca i serce na bloku od klatki piersiowej.
   Uwaga: Dla początkujących pomocne może być poproszenie kolegi o wsparcie na etapie podwiązywania.
7. Przenieś pakiet narządów do lodowatego buforu HEPES-Ringer w celu zestalenia agarozy. Dzieje się to w ciągu kilku minut.
8. Oddziel poszczególne płaty płuc i przymocuj jeden płat za pomocą superglue do uchwytu próbki wibratomu.
   Uwaga: Pomocne jest przyklejenie kawałka korka od szampana na uchwycie, który służy jako odchylenie do tyłu podczas cięcia elastycznej tkanki płucnej. W zależności od użytego płata płuca i jego ułożenia na uchwycie próbki, uzyskany PCLS może być bardziej odpowiedni do analizy małych lub dużych naczyń. Najczęściej używamy lewego płata i prawego płata czaszki do przygotowania PCLS. Aby uzyskać przecięte małe tętnice wewnątrzzrazikowe, przyklej prawy płat czaszki z wnęką do uchwytu i przetnij od obwodu. Aby uzyskać przecięte tętnice przedziarniaste, wyrównaj wnękę prawego płata z korkiem od szampana.
9. Użyj wibratomu wyposażonego w świeżą żyletkę, aby pociąć płat płuca na plastry o grubości 200 μm (prędkość: 12 = 1,2 mm/s; częstotliwość: 100; amplituda: 1,0). Zebrać PCLS w misce wibratomu wypełnionej zimnym buforem HEPES-Ringer o temperaturze 4 °C.
   Uwaga: Chłodzenie dzwonka HEPES-Ringer jest zalecane, ale nie jest to konieczne.
10. W celu usunięcia agarozy należy przenieść skrawki narządów do szklanej zlewki wypełnionej około 200 ml ciepłego MEM o temperaturze 37 °C. Włóż zlewkę do szafki grzewczej, do której wkładana jest rurka połączona z butelką z normoksyczną mieszanką gazów. Pęcherzyk MEM z gazem normoksykowym tak, aby sekcje płuc powoli poruszały się w pożywce. Po około 2 godzinach "blaszki agarozowe" wypełniające przestrzenie powietrzne zostaną usunięte z tkanki płucnej. Można to rozpoznać po tym, że sekcje nie pływają już na górze podłoża, ale osiadają na dnie zlewki.

4. Analiza wideomorfometryczna tętnic wewnątrzpłucnych PCLS

1. W celu analizy wideomorfometrycznej tętnic wewnątrzpłucnych należy przenieść jeden PCLS do przepływowej komory superfuzyjnej wypełnionej 1,2 ml normoksycznego gazowanego MEM. Zamocuj PCLS na dnie komory za pomocą nylonowych sznurków połączonych z platynowym pierścieniem (średnica zewnętrzna/wewnętrzna: 14/10 mm).
2. Skanuj PCLS pod mikroskopem w poszukiwaniu tętnic o przekroju poprzecznym o średnicach wewnętrznych między 20-100 μm.
   
   Uwaga: Światło tętnic jest wyściełane płaskimi komórkami śródbłonka. Otaczające komórki mięśni gładkich można zidentyfikować na obrazie kontrastu fazowego jako "ciemny pierścień" otaczający światło (patrz obrazy kontrastu fazowego na rycinie 2). W przeciwieństwie do tego, drogi oddechowe można zidentyfikować po początkowo pseudostratyfikowanym nabłonku walcowatym, który przechodzi w drodze do powierzchni opłucnej do prostego nabłonka walcowatego, a następnie prostego nabłonka prostopadłościennego.
   
   1. Zmierz średnicę wewnętrzną na początku każdego eksperymentu.
      Uwaga: W naczyniach o lekko ukośnym cięciu rzeczywistą średnicę wewnętrzną konstrukcji rurowej można określić pod kątem 90° do najdłuższej osi światła. Duże tętnice przedziarniaste o średnicach wewnętrznych >40 μm biegną w sąsiedztwie oskrzeli i oskrzelików. Małe tętnice wewnątrzzrazikowe o średnicy wewnętrznej <40 μm zlokalizowane są w klinach przegród pęcherzykowych obok wyrostka zębodołowego i wyrostka zębodołowego⁶.
3. Projekt eksperymentalny:
   1. Każdy eksperyment należy rozpocząć od "fazy adaptacyjnej", w której komora jest perfundowana normoksycznym medium gazowym (natężenie przepływu: 0,7 ml/min; 10 min). Następnie przetestuj żywotność naczynia: Przeanalizuj kurczliwość tętnicy przez dodanie 12 μl 10 μM U46619 (końcowe stężenie 0,1 μM; 10 min; brak przepływu).
      Uwaga: W tej pracy naczynie definiuje się jako żywotne, gdy powierzchnia światła jest zmniejszona o co najmniej 30% (metoda pomiaru patrz poniżej).
   2. Po wypłukaniu leku normoksycznym medium gazowym (przepływ: 6 ml/min; 10 min) rozszerzyć tętnicę przez zastosowanie 3 μl 10 mM Nipruss (stężenie końcowe 25 μM; 10 min; brak przepływu).
   3. Ponownie usunąć lek przez 10-minutowe przemycie normoksycznym medium gazowym (szybkość przepływu: 6 ml/min), a następnie 10 minut przy przepływie 0,7 ml/min.
   4. Wywołać niedotlenienie naczyń płucnych poprzez inkubację PCLS z niedotlenionym gazowym medium (szybkość przepływu: 0,7 ml/min; 40 min). Za pomocą dodatkowego systemu rurek wprowadzić mieszaninę gazów hipoksycznych do przestrzeni powietrznej komory perfuzyjnej.
   5. Usunąć podłoże hipoksyjne przez 20-minutowe przemycie gazowym medium normoksyjnym (natężenie przepływu: 6 ml/min).
   6. Na koniec każdego eksperymentu dodaj 1,2 μl 10 μM U46619 (końcowe stężenie 0,01 μM; 20 min; brak przepływu) do komory perfuzyjnej, aby wywołać zwężenie naczyń krwionośnych.
      Uwaga: Ten ostatni etap pozwala na określenie, czy zmiana w odpowiedzi hipoksyjnej (na przykład wywołana przez jednoczesne zastosowanie leku w fazie niedotlenienia lub zaobserwowana w PCLS przygotowanym z nokautującego szczepu myszy) jest specyficzna dla zwężenia wywołanego hipoksją, czy też odzwierciedla ogólny wpływ na kurczliwość. Stężenie 0,01 μM odpowiada wartości EC50 U46619, która została oszacowana w poprzednich pomiarach stężenia-skurczu (nieopublikowanych).
   7. Użyj innego PCLS do przeprowadzenia eksperymentów kontrolnych z normoksycznym zamiast hipoksyjnego MEM gazowanego i normoksyjną mieszaniną gazów w przestrzeni powietrznej komory perfuzyjnej.

5. Analiza wazoreaktywności i prezentacja graficzna

1. Za pomocą odpowiedniego oprogramowania wykonuj zdjęcia z przeciętej tętnicy co minutę podczas całego eksperymentu.
2. Za pomocą odpowiedniego oprogramowania oceń zmiany obszaru świetlnego naczyń, ręcznie wykładając wewnętrzne granice, korzystając z pełnoekranowych obrazów.
   Uwaga: Wystarczy przeanalizować co drugi obraz, aby uzyskać wyraźne wykresy. Jednakże, gdy jeden warunek w przepływowej komorze superfuzyjnej zostanie zmieniony na inny, przeanalizuj każdy obraz. Pozostałe zdjęcia służą jako kopia zapasowa na wypadek, gdyby jedno zdjęcie nie mogło zostać przeanalizowane.
   Niestety, ten czasochłonny krok musi być wykonany ręcznie, a nie za pomocą odpowiednich programów, ponieważ czasami komórki krwi są przyczepione do ściany naczyniowej, która porusza się podczas pomiaru lub nie jest to idealny przekrój naczynia, ale przekrój styczny, w którym wiarygodną lokalizację wewnętrznych granic można wykonać tylko pod kontrolą wzrokową.
3. Określ wartość uzyskaną dla obszaru światła naczynia na początku eksperymentu jako 100% i wyraź zwężenie lub rozszerzenie naczyń krwionośnych jako względny spadek lub wzrost tej wartości.
4. Dla każdego eksperymentu należy wykreślić względny obszar światła w funkcji czasu za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
5. Aby podsumować kilka eksperymentów, wykreśl średnie względnych obszarów świetlnych +/- błąd standardowy średniej (SEM) w funkcji czasu.
   Uwaga: W celu jasnego przedstawienia wpływu różnych substancji na zwężenie naczyń płucnych wywołane niedotlenieniem lub U46619 lub niedotlenienie reakcji szczepów myszy z nokautem, początkowa faza doświadczeń, w której badana jest żywotność naczynia, może być pominięta na wykresie. W tym przypadku wartości uzyskane na początku ekspozycji na zredukowany tlen określa się jako 100%.

6. Analiza statystyczna

1. Analizuj różnice między grupami eksperymentalnymi za pomocą testu Kruskala-Wallisa i Manna-Whitneya, przy czym p≤0,05 jest uważane za istotne, a p≤0,01 za wysoce istotne.
   Uwaga: Dodatkowe informacje na temat przygotowania i operacyjnego stosowania PCLS można znaleźć w^{pkt 20,21}.

Wyniki

Na rysunku 1 podane są wyniki pomiaru HPV dużej tętnicy przedzrazikowej, a na rysunku 2 małych tętnic wewnątrzzrazikowych. Na obrazach kontrastu fazowego (ryc. 1A i 2A) staje się jasne, że możliwe jest rozróżnienie tych 2 klas tętnic na podstawie ich lokalizacji w tkance płucnej: tętnice przedziarniaste biegną w bliskim sąsiedztwie oskrzeli i oskrzelików (ryc. 1A), podczas gdy tętnice wewnątrzgroniaste znajdują się w klinach przegród pęcherzykowych i otoczone pęcherzykami płucnymi (ryc. 2A). Przy odrobinie wprawy możliwe jest zaobserwowanie zmian w obszarze światła w odpowiedzi na U46619 na obrazach kontrastu fazowego (rysunki 1A i 2A). Jednak niedotlenienie naczyń płucnych często nie jest tak wyraźne i staje się jasne dopiero po pełnej ocenie zmian w obszarach świetlnych (ryc. 1B, 1C, 2B i 2C). Ze względów dydaktycznych podaliśmy przykład tętnicy przedgroniastej, która wykazuje niezwykle wyraźne zwężenie naczyń krwionośnych. Średnio HPV powoduje zmniejszenie powierzchni światła o 20-30%.

Na rysunku 2 pokazane są zapisy małych tętnic wewnątrzgroniastych inkubowanych z hipoksyjnym gazem z lub bez 50 μM pinacidylu (nieselektywny otwieracz mitochondrialnych kanałów potasowych wrażliwych na ATP) i wyraźnie widoczne staje się hamujące działanie leku. Końcowa część eksperymentu wykazuje selektywność działania leku na HPV: Zwężenie naczyń krwionośnych wywołane przez analog tromboksanu U46619 nie zmienia się przez dodanie pinacidylu. Rzeczywiście, krzywa dla tętnicy odsłoniętej przez pinacidil jest wyraźnie niższa niż pozostałe dwie, ale zakres zmniejszenia obszaru świetlnego przez sam U46619 jest porównywalny. W tym przypadku to właśnie niepełna rewersja wirusa HPV powoduje różnicę między krzywymi. Na tym wykresie uwzględniono również tętnicę wystawioną na działanie normoksycznego ośrodka gazowego jako dodatkową kontrolę. W tym stanie nie są wykrywalne żadne zmiany obszaru światła.

Na rysunku 3 pokazane są dane z pełnej serii pomiarów dotyczących wpływu pinacidylu na HPV. W celu porównania obu grup pod kątem różnic statystycznych zestawy danych wskazanych punktów czasowych przeanalizowano za pomocą testu Kruskala-Wallisa i Manna-Whitneya. HPV został wyraźnie zniesiony w obecności pinacidilu, podczas gdy skurcz wywołany przez U46619 pozostał niezmieniony.

Alternatywnie, możliwe jest zidentyfikowanie różnic między grupami poprzez porównanie obszaru pod krzywą, jak opisano w Müller-Redetzky et al.^{22 Rozdział 22}

Rysunek 1. Pomiar HPV dużej tętnicy przedziarniastej. (A) Obrazy z kontrastem fazowym przeciętej tętnicy przedzrazikowej (a), która biegnie w bliskim sąsiedztwie przeciętego oskrzela (B). Zdjęcia wykonywane są w punktach czasowych oznaczonych w (B) okręgami: na początku pomiaru (a), na końcu leczenia U46619 (b), pod koniec ekspozycji na Nipruss (c), po 30 lub 40 minutach w niedotlenionym podłożu gazowym (d, e), po przemyciu normoksycznym medium gazowym (f) i po końcowym zastosowaniu U46619 (g). Na wykresie (B) zmiany obszaru światła są wykreślane w funkcji czasu, podczas gdy obszar światła na początku eksperymentu jest zdefiniowany jako 100%, a zwężenie/rozszerzenie naczyń krwionośnych są podane jako wartości względne. W tym przypadku niedotlenienie powoduje zmniejszenie powierzchni światła o 60%. (C) W celu wyraźniejszego przedstawienia odpowiedzi hipoksyjnej, początkowa faza eksperymentu, w której badano aktywność naczyniową, nie jest uwzględniona, ale wartość uzyskana bezpośrednio przed ekspozycją na zredukowany tlen jest ustalana na 100% (patrz również rysunek 2). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 2. Wpływ pinacidylu (nieselektywnego otwieracza mitochondrialnych kanałów potasowych wrażliwych na ATP; mitoKATP) na HPV małych tętnic wewnątrzgroniastych. (A) Tętnice wewnątrzgroniaste (a) znajdują się w klinach przegród pęcherzykowych. Alv = zębodołowy. Sekwencja poszczególnych warunków zastosowanych w tych doświadczeniach jest podana w nagłówku wykresu (B). Narażenie na niedotlenienie przeprowadza się w obecności lub bez 50 μM pinacidilu. Inkubacje kontrolne wykonuje się za pomocą normoksycznego podłoża gazowego. Zdjęcia pokazane w (A) są wykonywane na początku pomiaru (a, a', a"), na końcu leczenia U46619 (b, b', b"), na końcu ekspozycji na Nipruss (c, c', c"), po 30 lub 40 minutach w niedotlenionym lub normoksyjnym podłożu gazowym (d, d', d"; e, e', e"), po przemyciu normoksycznym medium gazowym (f, f', f") i po końcowym zastosowaniu U46619 (g, g', g"). W celu wyraźniejszego przedstawienia odpowiedzi na normoksyj/niedotlenienie/niedotlenienie+pinacidyl, wartości uzyskane bezpośrednio przed ekspozycją na podłoże gazowane normoksycznie/hipoksyjnie ustala się na 100% (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 3. Hamowanie HPV przez pinacidil. Zapisy małych tętnic wewnątrzzrazikowych wystawionych na działanie niedotlenionego podłoża gazowego z lub bez 50 μM pinacidylu są sumowane i przedstawiane jako średnie ± SEM. W (A) podane są pełne zapisy, w (B) pokazane są względne dane w stosunku do wartości na początku inkubacji hipoksyjnej. Nie wykrywa się aktywności naczyniowej u PCL, które są wystawione na działanie pożywki z gazem hipoksyjnym zawierającej pinacidyl. Lek nie ma wpływu na zwężenie naczyń krwionośnych wywołane przez U46619. "n" w nawiasach odnosi się do liczby tętnic/liczby zwierząt, z których wykonano PCLS. Innymi słowy, pierwsza liczba opisuje liczbę analizowanych skrawków płuc, a druga liczba podaje liczbę myszy, od których te skrawki zostały przygotowane. W podanych punktach czasowych różnice między obiema grupami są badane pod kątem istotności. n.s.: nieistotne, *: p≤0,05, **: p≤0,01, ***: p≤0,001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 4. Schematyczny przegląd metody. Krótko mówiąc, myszy są zabijane przez zwichnięcie szyjki macicy. Po otwarciu klatki piersiowej płuca wypełnia się agarozą o niskiej temperaturze topnienia i po ostygnięciu kroi się na precyzyjnie pokrojone plastry płuc (PCLS) o grubości 200 μm. Po usunięciu agarozy w temperaturze 37 °C jeden PCLS przenosi się do przepływowej komory przefuzyjnej, w której poddaje się go działaniu medium normoksycznego lub medium gazowanego 1%_O2. Aktywność nazóżkowa jest rejestrowana jako zmiany w obszarze światła. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Dyskusja

Izolowane, wentylowane i perfundowane płuco myszy jest doskonałym modelem do analizy fizjologicznej odpowiedzi układu naczyniowego płuc na zmiany w dopływie tlenu i umożliwia m.in. ciągły pomiar ciśnienia tętniczego w płucach¹. Model ten nie pozwala jednak na identyfikację i analizę tych segmentów naczyń krwionośnych, które wykazują najsilniejszą odpowiedź na niedotlenienie. Jest to zaleta naszej wideomorfometrycznej analizy PCLS, która ułatwia pomiar HPV poszczególnych tętnic o średnicach wewnętrznych 20-100 μm. PCLS stanowią atrakcyjny model in vitro , ponieważ są bardzo podobne do narządu, z którego są przygotowywane. W przeciwieństwie do systemów hodowli komórkowych, wszystkie typy komórek są obecne w swojej pierwotnej konfiguracji tkankowo-macierzowej. Co więcej, jedno płuco wystarcza do przygotowania wielu PCLS, tak że przynajmniej częściowo eksperymenty mogą być ustandaryzowane poprzez użycie wycinków tej samej myszy. Zgodnie z koncepcją 3R (redukcja, udoskonalenie i zastąpienie zwierząt laboratoryjnych w naukach przyrodniczych) Russella i Burcha²³ fakt ten również przemawia za stosowaniem PCLS.

Należy jednak pamiętać, że tkanka jest uszkadzana przez cięcie wibratomem i sygnalizację podłużną, na przykład za pośrednictwem komórek śródbłonka, jak postulują Kübler i wsp. ¹⁴ nie jest już możliwe.

Początkowo PCLS były stosowane głównie w badaniach biochemicznych, farmakologicznych i toksykologicznych, ale w międzyczasie są również wykorzystywane do pomiaru kurczliwości oskrzeli, funkcji śluzowo-rzęskowej i odpowiedzi naczyniowych (przeglądy patrz Sanderson²⁰ i Davies²¹). Held i wsp. przeprowadzili badanie, w którym porównali modele izolowanych, perfundowanych i wentylowanych płuc myszy oraz PCLS²⁴. Na podstawie analizy reakcji dróg oddechowych i naczyń płucnych na różne mediatory endogenne odkryli, że w PCLS zachowały się ważne cechy całego płuca.

W PCLS warunki niedotlenienia nie są ustalane przez drogi oddechowe, jak w nienaruszonym płucu, ale przez inkubację odcinka płuca w podłożu podgazowanym hipoksyjnie. Przeanalizowaliśmy ciśnienie parcjalne tlenu (pO₂) medium wstępnie zagazowanego odpowiednio 1% O_{2 ,} 5,3 % CO₂ , 93,7% N₂ i 21% O₂, 5,3% CO₂, 73,7% N₂ za pomocą analizatora gazometrii krwi. Bezpośrednio przed wprowadzeniem go do komory perfuzyjnej pO₂ hipoksyjnego gazowanego MEM wynosiło 40 mmHg, a normoksycznego gazowanego medium 160 mmHg⁶. W nienaruszonym płucu HPV jest indukowany, gdy pO₂ w pęcherzykach płucnych spada poniżej 50 mmHg²⁵, co można oczywiście naśladować przez zastosowanie pożywki z gazem hipoksyjnym. Nasze dane dotyczące zasięgu HPV dobrze pasują do wyników uzyskanych przy użyciu innego podejścia eksperymentalnego. Yamaguchi i wsp. zastosowali izolowane płuca szczura do badania mikronaczyń o średnicy 20-30 μm za pomocą konfokalnej laserowej skaningowej mikroskopii luminescencyjnej w czasie rzeczywistym sprzężonej z kamerą o wysokiej czułości ze wzmacniaczem obrazu¹⁰. Zaobserwowali średnie zmniejszenie średnicy o 2,7 μm po wystawieniu płuc na niedotlenienie. Można obliczyć, że zmniejszenie o 20% powierzchni światła, tak jak ją mierzymy w naszym systemie, odpowiada około 15% zmniejszeniu średnicy.

W naszych doświadczeniach sklasyfikowaliśmy tętnice odpowiednio jako naczynia przed- i wewnątrzziarniaste o średnicach wewnętrznych 40-100 μm i 20-40 μm. U ludzi przejście z tętnic mięśniowych do niemięśniowych następuje w zakresie średnic 70-100 μm. U myszy komórki mięśni gładkich są obecne do średnicy zewnętrznej 20 μm²⁶. Z tego powodu nie jest możliwa analiza tętnic o średnicach poniżej 20 μm, ponieważ nie można ich wiarygodnie zidentyfikować na podstawie obrazu kontrastu fazowego. Na drugim końcu skali znajdują się naczynia o średnicy powyżej 100 μm, które są prawie niemożliwe do znalezienia w PCLS i często są usuwane z otaczającej tkanki.

W rzeczywistości wiele kandydatów molekularnych jest omawianych jako molekularne czujniki tlenu lub jako składnik kaskady sygnalizacyjnej skutkującej HPV (przegląd patrz Sylvester i wsp.⁴). Gdy dostępne są odpowiednie myszy z nokautem, można zastosować wideomorfometrię do analizy wazoreaktywności tętnic przed- i wewnątrzzrazikowych w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego. Jednak PCLS był również używany do innych problemów: Faro i wsp. wykorzystano je do scharakteryzowania rozwoju zależnego od śródbłonka rozszerzenia płuc po urodzeniu²⁹ , a PCLS przygotowane ze świnek morskich wystawionych na dym lub powietrze codziennie przez 2 tygodnie wykorzystano do wykazania wpływu dymu papierosowego na aktywność naczyniową poprzez indukcję dysfunkcji śródbłonka³⁰.

Krytyczne kroki w ramach protokołu

W naszych doświadczeniach sklasyfikowaliśmy tętnice jako przedziarniaste (średnice wewnętrzne 40-100 μm) i wewnątrzziarniaste (średnice wewnętrzne 20-40 μm). Szczególnie w przypadku przygotowania wycinków płuc, które powinny być używane do analizy większych naczyń, ważne jest dodanie nitroprusydku sodu do buforu perfuzyjnego. Lek ten zapobiega kurczeniu się naczyń podczas przygotowywania próbki, a tym samym ich oderwaniu od otaczającej tkanki, co prowadzi do niepełnego rozszerzenia naczyń krwionośnych. Nitroprusydek sodu w buforze perfuzyjnym nie jest tak istotny dla przygotowania wycinka płuc, który powinien być wykorzystany do analizy małych tętnic, ponieważ są one silnie zakotwiczone w przegrodach pęcherzykowych.

Wszystkie eksperymenty należy rozpocząć od inkubacji, w których badana jest reaktywność tętnic. Rzadko otrzymywaliśmy preparaty płucne, w których nie wykrywano reakcji naczyń krwionośnych na naciągi lub rozszerzacze. Nie znamy przyczyny takiego stanu rzeczy: być może objętość agarozy wypełnionej w płucach była zbyt duża lub zbyt mała, tak że przecięcie narządu na PCLS nie było optymalne. Alternatywnie można sobie wyobrazić, że agaroza ochładzała się zbyt szybko podczas procedury wkraplania, co powodowało szkodliwe naprężenia ścinające. W przypadku, gdy w pojedynczym PCLS nie jest wykrywalna żywa tętnica, odcinek należy odrzucić i zastąpić innym.

Decyzja o żywotności tętnicy została podjęta na podstawie odpowiedzi na U46619. Zastosowanie U46619 w stężeniu 0,1 μM wywołuje zwężenie naczyń krwionośnych, które - po pewnym wysiłku fizycznym - jest widoczne bezpośrednio w sekwencji obrazu na ekranie. Ponieważ istnieją pewne różnice w aktywności naczyniowej, badamy wpływ leku na HPV, mierząc odpowiedź naczyniową w odcinkach płuc narażonych na działanie leku lub na samą pożywkę.

HPV pojedynczej tętnicy jest często ledwo wykrywalny pod mikroskopem, a średnio powoduje zmniejszenie powierzchni światła o około 20-30%. Jednak niewielkie zmiany średnicy tętnicy mają wyraźny wpływ na opór przepływu. Zgodnie z równaniem "R = 1/r⁴" przy R = rezystancji i r = promieniu, opór przepływu jest odwrotnie proporcjonalny do czwartej potęgi promienia. Podam przykład: "Tętnica idealna" o przekroju kołowym o średnicy 40 μm (r=20 μm) ma pole świetlne około 1 260^μm2. Gdy powierzchnia światła zmniejszy się o 20%, możemy obliczyć, że średnica naczynia zmniejsza się o 10,5% do 35,8 μm (r=17,9 μm). Zgodnie z powyższym równaniem, opory przepływu tego naczynia wzrosłyby z 6,25 x ^10-6 do 9,71 x ^10-6 , czyli o około 55%. W przypadku zmniejszenia powierzchni świetlnej o 30% promień zmniejszyłby się o około 16%, ale opory przepływu wzrosłyby o około 100%. Jakkolwiek obliczenia te są nadmiernym uproszczeniem, w którym zakłada się laminarny przepływ krwi i formę naczynia w postaci sztywnej rury, sugeruje to wpływ już niewielkich zmian średnicy na opory przepływu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Vibratome "Microm HM 650 V"	Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy
Kuchenka mikrofalowa	Bosch, Frankfurt, Niemcy	HMT 702C
Szafa grzewcza	Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy
Przepływowa komora superfuzyjna	Hugo Sachs Elektronik, marzec, Niemcy	Typ wanny PCLS: 847 SN:4017
Pionowy mikroskop odwrócony wyposażony w obiektywy 4X, 10X, 20X i 40X	Leica, Wetzlar, Niemcy
Kamera CCD	Stemmer Imaging, Puchheim, Niemcy
Pompa perystaltyczna Minipuls 3	Gilson, Limburgia-Offheim, Niemcy
Łaźnia wodna " Uniwersalny Wasserbad Isotem 205"	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy	9452450
Rury gazoszczelne Tygon R3603-13         Ø i: 3/32 cala i Oslash; a: 5/32 cala, ściana: 1/32 cala	VWR, Darmstadt, Niemcy
Różne nożyczki i kleszcze
do szycia bawełny
2 ml	Braun-Melsungen AG, Melsungen, Niemcy
Strzykawka 50 ml	Braun-Melsungen AG, Melsungen, Niemcy
Elastyczna plastikowa rurka kaniuli dożylnej " IntrocanR-W" (kaniula 20 G x 1 i frac14; cal, 1,1 x 32 mm)	Braun-Melsungen AG, Melsungen, Niemcy	4254112B	Do wkraplania agarozy do płuc
Kaniula 21 G x 4 ¾ w; 0,8 x 120 mm	Braun-Melsungen AG, Melsungen, Niemcy	4665643	Do bulgotania podłoża
Kaniula nr 17, 24 G x 1, 0,55 x 25 mm	Terumo, Eschborn, Niemcy	NN 2425 88DSF18	Do perfuzji płuc
Normoksyjna mieszanina gazów (21% O2, 5,3% CO2, 73,7% N2)	Linde, Hildesheim, Niemcy
Mieszanina gazów hipoksyjnych (1% O2, 5,3% CO2, 93.7% N2)	Linde, Hildesheim, Niemcy
HEPES	Sigma, Deisenhofen, Niemcy	H 4034
NaCl	Roth, Karlsruhe, Niemcy	3957.1
KCl	Merck, Darmstadt, Niemcy	1.04936.0500
MgCl2• 6H2O	Merck, Darmstadt, Niemcy	1.05833.0250
CaCl2• 2H2O	Merck, Darmstadt, Niemcy	1.02382.0500
Glukoza D-(+)	Sigma, Deisenhofen, Niemcy	G 7021
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Bio-Rad, Monachium, Niemcy	161-3111
Heparyna sodowa	Ratiopharm, Ulm, Niemcy	5120046
Minimalna pożywka egzogenna (MEM) bez fenolu	Invitrogen, Darmstadt, Niemcy	5120046
70% EtOH do dezynfekcji	Stockmeier Chemie, Dillenburg, Niemcy
Superglue	UHU, Bü hl/Baden, Niemcy lub w supermarkecie
U46619 (analog tromboksanu)	Calbiochem/Merck, Darmstadt, Niemcy	538944
Nitrorusydek sodu (Nipruss)	Schwarz Pharma, Monheim, Niemcy	5332804
Oprogramowanie Optimas 6.5	Stemmer, Puchheim, Niemcy
SPSS 19	AskNet, Karlsruhe, Niemcy