Szybka mechaniczna deformacja komórek pojawiła się jako obiecująca, bezwektorowa metoda wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek i nanomateriałów. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z systemu w szerokim zakresie zastosowań.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ściskanie komórek jako solidna, mikroprzepływowa platforma dostarczania wewnątrzkomórkowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Szybka mechaniczna deformacja komórek pojawiła się jako obiecująca, bezwektorowa metoda wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek i nanomateriałów. Technologia ta wykazała potencjał w radzeniu sobie z wcześniej wymagającymi zastosowaniami; w tym dostarczanie do pierwotnych komórek odpornościowych, przeprogramowywanie komórek, nanorurki węglowe i dostarczanie kropek kwantowych. Ta bezwektorowa platforma mikroprzepływowa opiera się na mechanicznym rozerwaniu błony komórkowej w celu ułatwienia cytozolowego dostarczania materiału docelowego. W niniejszym artykule opisano szczegółową metodę użycia tych urządzeń mikroprzepływowych, w tym montaż urządzenia, przygotowanie ogniw i działanie systemu. Takie podejście do dostarczania wymaga krótkiej optymalizacji typu urządzenia i warunków pracy dla wcześniej nieraportowanych aplikacji. Dostarczone instrukcje można uogólnić na większość typów komórek i materiałów podawczych, ponieważ system ten nie wymaga specjalistycznych ani etapów modyfikacji chemicznej/koniugacji. Ta praca zawiera również zalecenia dotyczące poprawy wydajności urządzenia i rozwiązywania potencjalnych problemów związanych z zatykaniem, niską wydajnością dostarczania i żywotnością komórek.
Wprowadzenie
Dostarczanie makrocząsteczek do cytoplazmy komórki jest kluczowym krokiem w zastosowaniach terapeutycznych i badawczych. Na przykład dostarczanie za pośrednictwem nanocząstek wykazało potencjał w terapii genowej1,2, podczas gdy dostarczanie białek jest obiecującym sposobem wpływania na funkcje komórkowe zarówno w warunkach klinicznych3, jak i laboratoryjnych4. Inne materiały, takie jak leki małocząsteczkowe, kropki kwantowe lub nanocząstki złota, są interesujące w zastosowaniach od terapii nowotworów5,6 po znakowanie wewnątrzkomórkowe7,8 i śledzenie pojedynczych cząsteczek9.
....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przechowywanie
- Przechowuj zbiorniki, uchwyty, O-ringi i urządzenia mikroprzepływowe w 70% etanolu. Używaj pojemnika (np. słoika lub zlewki) z pokrywką, aby zapobiec parowaniu i zanieczyszczeniu kurzem lub cząstkami zewnętrznymi. Umieść urządzenia w jednym pojemniku (1), zbiorniki i O-ringi w drugim pojemniku (2), a uchwyty w trzecim (3).
Uwaga: Użycie 70% etanolu do przechowywania ma na celu utrzymanie sterylności. Jeśli jedynymi składnikami roztworu są etanol i woda (tj. bez środków denaturujących), wszystkie elementy systemu powinny być w pełni kompatybilne i nie ulegać degradacji z upływem czasu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 1 zawiera opisowy schemat mikrofluidycznego systemu dostarczania. Ryciny 2a-b ilustrują typowe wyniki traktowania komórek HeLa za pomocą różnych konstrukcji urządzeń w obecności dekstranu 3 kDa sprzężonego z fluoresceincją20. Przy prawidłowym przeprowadzeniu procedury wydajność systemu będzie zależała od typu urządzenia i prędkości pracy. Należy zatem zoptymalizować te warunki dla danej aplikacji przed przystąpieniem do bardziej złożonych eksperymentów. W zakresie warun.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niektóre aspekty opisanej procedury eksperymentalnej (tj. czynniki inne niż konstrukcja chipa i szybkość operacyjna) mogą wymagać optymalizacji w zależności od typu ogniwa i materiału dostarczającego, do którego system jest stosowany. Poniższa dyskusja dotyczy niektórych z najczęstszych czynników, które należy wziąć pod uwagę podczas projektowania eksperymentów.
Aby poprawić sygnał dostarczania dla związków znakowanych fluorescencyjnie, należy zająć się źródłami fluorescencji tła. Wią.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy Armon Sharei, Robert Langer i Klavs F. Jensen są udziałowcami firmy SQZ Biotechnologies, która produkuje urządzenia mikroprzepływowe użyte w tym artykule.
Podziękowania
Dziękujemy T. Shatova za pomocną dyskusję na temat projektowania eksperymentów i analizy danych. Z wdzięcznością dziękujemy za pomoc i wiedzę fachową G. Paradisa, personelu zajmującego się cytometrią przepływową w Instytucie Kocha oraz pracowników Laboratorium Technologii Mikrosystemów w Massachusetts Institute of Technology. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health Grants RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351 oraz częściowo przez National Cancer Institute Cancer Center Support (Core) Grants P30-CA14051 i MPP-09Call-Langer-60.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Uchwyt na urządzenie i Zbiornik z tworzywa sztucznego | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Maszyna do cytometrii przepływowej używana w Instytucie Kocha Podstawowe obiekty |
| Urządzenie mikroprzepływowe | SQZ Biotechnologies | wyciskania | |
| McMaster | 9452K311 | ||
| System ciśnieniowy do obsługi urządzenia | SQZ Biotechnologies | System | |
| Pęseta | |||
| Kąpiel |
Bibliografia
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
