Artykuł metodologiczny

Ściskanie komórek jako solidna, mikroprzepływowa platforma dostarczania wewnątrzkomórkowego

DOI:

10.3791/50980

⸱

7 listopada 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybka mechaniczna deformacja komórek pojawiła się jako obiecująca, bezwektorowa metoda wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek i nanomateriałów. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z systemu w szerokim zakresie zastosowań.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybka mechaniczna deformacja komórek pojawiła się jako obiecująca, bezwektorowa metoda wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek i nanomateriałów. Technologia ta wykazała potencjał w radzeniu sobie z wcześniej wymagającymi zastosowaniami; w tym dostarczanie do pierwotnych komórek odpornościowych, przeprogramowywanie komórek, nanorurki węglowe i dostarczanie kropek kwantowych. Ta bezwektorowa platforma mikroprzepływowa opiera się na mechanicznym rozerwaniu błony komórkowej w celu ułatwienia cytozolowego dostarczania materiału docelowego. W niniejszym artykule opisano szczegółową metodę użycia tych urządzeń mikroprzepływowych, w tym montaż urządzenia, przygotowanie ogniw i działanie systemu. Takie podejście do dostarczania wymaga krótkiej optymalizacji typu urządzenia i warunków pracy dla wcześniej nieraportowanych aplikacji. Dostarczone instrukcje można uogólnić na większość typów komórek i materiałów podawczych, ponieważ system ten nie wymaga specjalistycznych ani etapów modyfikacji chemicznej/koniugacji. Ta praca zawiera również zalecenia dotyczące poprawy wydajności urządzenia i rozwiązywania potencjalnych problemów związanych z zatykaniem, niską wydajnością dostarczania i żywotnością komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczanie makrocząsteczek do cytoplazmy komórki jest kluczowym krokiem w zastosowaniach terapeutycznych i badawczych. Na przykład dostarczanie za pośrednictwem nanocząstek wykazało potencjał w terapii genowej1,2, podczas gdy dostarczanie białek jest obiecującym sposobem wpływania na funkcje komórkowe zarówno w warunkach klinicznych3, jak i laboratoryjnych4. Inne materiały, takie jak leki małocząsteczkowe, kropki kwantowe lub nanocząstki złota, są interesujące w zastosowaniach od terapii nowotworów5,6 po znakowanie wewnątrzkomórkowe7,8 i śledzenie pojedynczych cząsteczek9.

Błona komórkowa jest w dużej mierze nieprzepuszczalna dla makromolekuł. Wiele istniejących technik wykorzystuje nanocząstki polimerowe10,11, liposomy12 lub modyfikacje chemiczne13 w celu ułatwienia przerwania błony lub dostarczania endocytotów. W tych metodach wydajność dostarczania i żywotność komórki często zależą od struktury cząsteczki docelowej i typu komórki. Metody te mogą być skuteczne w dostarczaniu strukturalnie jednorodnych materiałów, takich jak kwasy nukleinowe, ale często nie nadają się do dostarczania materiałów o bardziej zróżnicowanej strukturze, takich jak białka14,15 i nanomateriały7. Co więcej, mechanizm rozrywania endosomów, na którym opiera się większość tych metod, jest często nieefektywny, co pozostawia wiele materiału uwięzionego w strukturach pęcherzykowych16. Wreszcie, metody, które są często opracowywane do stosowania z ustalonymi liniami komórkowymi, nie przekładają się dobrze na komórki pierwotne.

Metody poracji membrany, takie jak elektroporacja17,18 i sonoporacja19, są atrakcyjną alternatywą w niektórych zastosowaniach; jednak wiadomo, że powodują niską żywotność ogniw i mogą być ograniczone przez ładunek docelowego materiału dostarczającego.

Szybkie mechaniczne odkształcanie komórek, mikroprzepływowe podejście do dostarczania, ostatnio wykazało swoje zalety w porównaniu z obecnymi technikami w kontekście przeprogramowania komórek20 i dostarczania nanomateriałów21. Metoda ta polega na mechanicznym rozerwaniu błony komórkowej w celu ułatwienia cytozolowego dostarczania materiałów obecnych w otaczającym buforze. System wykazał potencjał w zakresie wykorzystania wcześniej trudnych typów komórek (np. pierwotnych komórek odpornościowych i komórek macierzystych) oraz materiałów (np. przeciwciał i nanorurek węglowych). W niniejszym artykule opisano ogólną procedurę stosowania tych urządzeń do wewnątrzkomórkowego dostarczania docelowych makrocząsteczek. Procedurę można uogólnić na większość typów komórek i materiałów podawczych; Zaleca się jednak przeprowadzenie krótkiej optymalizacji warunków, zgodnie z opisem w naszych wcześniej zgłoszonych wytycznych projektowych20, dla wszelkich wcześniej niezgłoszonych zastosowań. Do tej pory system był z powodzeniem wykorzystywany do dostarczania RNA, DNA, nanocząstek złota, kropek kwantowych, nanorurek węglowych, białek i polimerów dekstranu20,21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przechowywanie

  1. Przechowuj zbiorniki, uchwyty, O-ringi i urządzenia mikroprzepływowe w 70% etanolu. Używaj pojemnika (np. słoika lub zlewki) z pokrywką, aby zapobiec parowaniu i zanieczyszczeniu kurzem lub cząstkami zewnętrznymi. Umieść urządzenia w jednym pojemniku (1), zbiorniki i O-ringi w drugim pojemniku (2), a uchwyty w trzecim (3).

Uwaga: Użycie 70% etanolu do przechowywania ma na celu utrzymanie sterylności. Jeśli jedynymi składnikami roztworu są etanol i woda (tj. bez środków denaturujących), wszystkie elementy systemu powinny być w pełni kompatybilne i nie ulegać degradacji z upływem czasu.

  1. Zmieniaj roztwór etanolu w pojemnikach (2) i (3) przed każdym użyciem, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między eksperymentami i zminimalizować obecność niepożądanych cząstek, które mogą powodować zatkanie.

2. Przygotowanie do eksperymentu

  1. Umieść pojemniki (2) i (3) w łaźni ultradźwiękowej na 5-10 minut przed każdym użyciem. Pomaga to usunąć wszelkie zanieczyszczenia z poprzednich eksperymentów.
  2. Czysta przestrzeń robocza w komorze bezpieczeństwa biologicznego z 70% roztworem etanolu.
  3. Spryskaj wszystkie materiały (3 pojemniki i pęsetę) 70% roztworem etanolu przed umieszczeniem ich w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

3. Montaż

  1. Połóż 2-3 chusteczki o niskiej zawartości kłaczków w obszarze roboczym.
  2. Wyjmij plastikowe zbiorniki z pojemnika za pomocą pęsety i umieść je na chusteczkach, aby ułatwić odparowanie roztworu etanolu z wewnętrznych powierzchni. Delikatnie postukaj w zbiorniki o powierzchnię lub przedmuchaj je powietrzem, aby ułatwić usunięcie roztworu etanolu.
  3. Włóż O-ringi do odpowiedniego gniazda w zbiornikach.
  4. Wyjmij uchwyt i wióry z odpowiednich pojemników i pozwól etanolowi odparować (~1-2 min).
  5. Użyj pęsety, aby umieścić żądany wiór stroną zadrukowaną do góry (tj. otwory dostępowe do góry) w uchwycie. Podnieś uchwyt z chipem na poziom oczu, aby upewnić się, że wiór leży płasko w uchwycie i wyreguluj w razie potrzeby za pomocą pęsety. WAŻNE: Jeśli urządzenie nie będzie prawidłowo pasować do swojego uchwytu, istnieje ryzyko, że pęknie podczas kolejnych czynności.
  6. Następnie delikatnie umieść zbiorniki na uchwycie i wyrównaj je z klipsami. Należy uważać, aby O-ringi nie wypadły ze swoich szczelin podczas tego procesu.
  7. Delikatnie dociśnij zbiorniki, aż zatrzasną się na swoim miejscu. Upewnij się, że obie strony zbiorników są zabezpieczone i że chip wydaje się być we właściwej pozycji.

4. Przygotowanie komórek

  1. Dla komórek przylegających (linie pierwotne lub ustalone): Komórki płytki 1-2 dni przed eksperymentem tak, aby nie zlewały się w więcej niż 80% w dniu eksperymentu.
  2. Umieść komórki w zawiesinie (w PBS lub odpowiedniej pożywce) i dąż do stężenia roboczego od 1,0 x 106 komórek/ml do 1,0 x 107 komórek/ml. UWAGA: Nie zaobserwowaliśmy znaczących zmian w wydajności dostarczania ze względu na stężenie komórek.
  3. Wymieszaj komórki i żądany materiał do dostarczania w osobnej probówce, aby uzyskać pożądane stężenie materiału do eksperymentu. WAŻNE: Ponieważ opisana metoda dostarczania opiera się na dyfuzji w celu ułatwienia dostarczania, wyższe stężenie materiału zapewni wyższą dostawę. Jeśli to możliwe, zaleca się użycie roztworu 1 μM pożądanego materiału do wstępnych prób. Stężenie to można następnie zmniejszyć w przyszłych eksperymentach w razie potrzeby. Najniższe zgłoszone stężenie stosowane w tym urządzeniu to 10 nM21.

5. Operacja

  1. Pipetowana mieszanina komórek i materiału doprowadzającego do zbiornika (obecna konstrukcja ma maksymalną pojemność 150 μl). UWAGA: Większość konstrukcji urządzeń jest w pełni odwracalna, dlatego kierunek przepływu przez kanały nie ma znaczenia. Próbki mogą być ładowane do jednego z dwóch zbiorników.
  2. Przymocuj rurkę ciśnieniową do napełnionego zbiornika i dokręć nakrętkę, aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie (często wystarczy dokręcenie palcami).
  3. Dostosuj ciśnienie do żądanego poziomu na regulatorze. Kontroluje to prędkość, z jaką komórki przemieszczają się przez urządzenie. Zwróć uwagę, że przepływ komórek nie rozpoczyna się, dopóki nie zostanie naciśnięty przycisk.

UWAGA: W poprzednich pracach azot lub sprężone powietrze działały równie dobrze jak gaz nośny.

  1. Podnieś urządzenie na wysokość oczu i ustaw je tak, aby płyn w zbiorniku był dobrze widoczny. UWAGA: Śledź kolumnę cieczy, aby wyłączyć system przed opróżnieniem zbiornika.
  2. Naciśnij przycisk, aby zwiększyć ciśnienie w zbiorniku i rozpocząć przepływ komórek.
  3. Gdy poziom cieczy znajduje się około 2 mm od dna zbiornika, szybko przekręć regulator na 0 psi, aby zatrzymać przepływ. WAŻNE: Jeśli nie uda się zatrzymać przepływu przed opróżnieniem zbiornika, istnieje ryzyko wyrzucenia próbki ze zbiornika zbiorczego. Należy również pamiętać, że jeśli kolumna płynu nie porusza się w znacznym tempie lub znacznie zwolniła w stosunku do początkowego natężenia przepływu (np. 3 razy wolniej), zamontowane urządzenie jest prawdopodobnie zatkane i wymaga wymiany. Działanie zatkanego urządzenia może prowadzić do większej śmierci komórek.
  4. Zbierz leczone komórki z odpowiedniego zbiornika i umieść je w żądanej probówce/płytce do pobierania opłat. WAŻNE: Na tym etapie nie należy rozcieńczać pobranych komórek w żadnych, ponieważ porowane komórki będą nadal pobierać materiał przez okres do 10 minut20. Po upływie tego okna rozcieńczyć komórki w żądanym pożywce/buforze.
  5. Aby zebrać więcej leczonych komórek lub wypróbować alternatywne warunki eksperymentalne, w razie potrzeby powtórz kroki 5.1 - 5.7. Przypomnijmy, że chipy są odwracalne, dlatego próbki można montować w dowolnym zbiorniku. Pamiętaj, aby wymienić żetony w razie potrzeby, jeśli się zatkają. Wyrzuć zatkane urządzenia.

6. Demontaż

  1. Delikatnie odłącz zbiorniki od głównego uchwytu, odsuwając na bok ramiona zacisku.
  2. Umieść każdą część w odpowiednim pojemniku do przechowywania (szczegółowo w sekcji 1).
  3. Umieść zużyte wióry w osobnym pojemniku do utylizacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 zawiera opisowy schemat systemu dostarczania mikroprzepływów. Ryciny 2a-b ilustrują typowe wyniki leczenia komórek HeLa za pomocą różnych konstrukcji urządzeń w obecności fluorescencyjnie sprzężonego dekstranu 3 kDa20. Jeśli procedura zostanie wykonana poprawnie, wydajność systemu będzie wrażliwa na typ urządzenia i szybkość działania. Dlatego przed przystąpieniem do bardziej złożonych eksperymentów należy zoptymalizować te warunki dla danej aplikacji. W zakresie war...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niektóre aspekty opisanej procedury eksperymentalnej (tj. czynniki inne niż konstrukcja chipa i szybkość operacyjna) mogą wymagać optymalizacji w zależności od typu ogniwa i materiału dostarczającego, do którego system jest stosowany. Poniższa dyskusja dotyczy niektórych z najczęstszych czynników, które należy wziąć pod uwagę podczas projektowania eksperymentów.

Aby poprawić sygnał dostarczania dla związków znakowanych fluorescencyjnie, należy zająć się źródłami fluorescencji tła. Wią...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy Armon Sharei, Robert Langer i Klavs F. Jensen są udziałowcami firmy SQZ Biotechnologies, która produkuje urządzenia mikroprzepływowe użyte w tym artykule.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy T. Shatova za pomocną dyskusję na temat projektowania eksperymentów i analizy danych. Z wdzięcznością dziękujemy za pomoc i wiedzę fachową G. Paradisa, personelu zajmującego się cytometrią przepływową w Instytucie Kocha oraz pracowników Laboratorium Technologii Mikrosystemów w Massachusetts Institute of Technology. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health Grants RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351 oraz częściowo przez National Cancer Institute Cancer Center Support (Core) Grants P30-CA14051 i MPP-09Call-Langer-60.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Uchwyt na urządzenie i Zbiornik z tworzywa sztucznegoSQZ BiotechnologiesHolder
LSRFortessa AnalyzerBecton DickinsonN/AMaszyna do cytometrii przepływowej używana w Instytucie Kocha Podstawowe obiekty
Urządzenie mikroprzepływoweSQZ Biotechnologieswyciskania
McMaster9452K311
System ciśnieniowy do obsługi urządzeniaSQZ BiotechnologiesSystem
Pęseta
Kąpiel
O-ringi do komórekciśnieniowy ultradźwiękowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
  2. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
  3. Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
  4. Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  5. Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
  6. Jiang, Z. -X., Zhang, Z. -Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
  7. Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
  8. Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
  9. Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
  10. Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
  12. Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).
  13. Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
  14. Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
  15. Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
  16. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
  17. li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
  18. Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
  19. Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
  20. Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
  21. Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cell SqueezingMicrofluidic DeliveryIntracellular DeliveryVector Free DeliveryMechanical DisruptionFlow CytometryDevice AssemblyCell PreparationPressure OptimizationClogging Prevention

Powiązane artykuły