Izolacja kropelek lipidów komórkowych: dwie techniki oczyszczania, zaczynając od komórek drożdży i ludzkich łożysk

Summary

Przedstawiono dwie techniki izolowania kropelek lipidów komórkowych z 1) komórek drożdży i 2) ludzkich łożysk. Centralnym elementem obu procedur jest wirowanie w gradionym gradimencie gęstości, w którym powstałą pływającą warstwę zawierającą kropelki można łatwo zwizualizować za pomocą oka, wyekstrahować i określić ilościowo za pomocą analizy Western Blot w celu uzyskania czystości.

Abstract

Kropelki lipidów to dynamiczne organelle, które można znaleźć w większości komórek eukariotycznych i niektórych prokariotycznych. Strukturalnie kropelki składają się z rdzenia z obojętnych lipidów otoczonych monowarstwą fosfolipidową. Jedną z najbardziej użytecznych technik określania ról komórkowych kropelek jest proteomiczna identyfikacja związanych białek, które można wyizolować wraz z kropelkami. W tym miejscu opisano dwie metody izolowania kropelek lipidów i związanych z nimi białek z dwóch szeroko zakrojonych eukariontów: drożdży rozszczepialnych i ludzkich komórek kosmków łożyska. Chociaż obie techniki różnią się między sobą, główna metoda - wirowanie w gradionym przepływie gęstości - jest wspólna dla obu preparatów. Świadczy to o szerokim zastosowaniu prezentowanych technik izolacji kropel.

W pierwszym protokole, komórki drożdży są przekształcane w sferoplasty poprzez enzymatyczne trawienie ich ścian komórkowych. Powstałe sferoplasty są następnie delikatnie lizowane w luźnym homogenizatorze. Ficoll dodaje się do lizatu w celu uzyskania gradientu gęstości, a mieszaninę odwirowuje się trzykrotnie. Po pierwszym wirowaniu kropelki lipidów są zlokalizowane w białej pływającej warstwie probówek wirówkowych wraz z retikulum endoplazmatycznym (ER), błoną plazmatyczną i wakuolami. Dwa kolejne spiny są używane do usunięcia tych pozostałych trzech organelli. Rezultatem jest warstwa, która składa się tylko z kropelek i związanych białek.

W drugim protokole, komórki kosmkowe łożyska są izolowane z ludzkich łożysk donoszonych przez trawienie enzymatyczne z trypsyną i DNazą I. Komórki są homogenizowane w luźno dopasowanym homogenizatorze. Etapy wirowania z niską i średnią prędkością służą do usuwania nieuszkodzonych komórek, szczątków komórkowych, jąder i mitochondriów. Sacharoza jest dodawana do homogenatu w celu uzyskania gradientu gęstości, a mieszaninę odwirowuje się w celu oddzielenia kropelek lipidów od innych frakcji komórkowych.

Czystość kropelek lipidów w obu protokołach jest potwierdzona przez analizę Western Blot. Frakcje kropelkowe z obu preparatów nadają się do późniejszej analizy proteomicznej i lipidomicznej.

Introduction

Komórkowe kropelki lipidowe to dynamiczne organelle, które pełnią wiele funkcji w komórkach. Są one węzłami magazynowania neutralnych lipidów, które mogą być przekształcane w energię lub wykorzystywane do syntezy fosfolipidów. Kropelki odgrywają kluczową rolę w stanach fizjologicznych i patologicznych, w tym miażdżycy, otyłości i powiązanych chorobach metabolicznych, a także w chorobach zakaźnych^1,2. Ponadto są one intrygującym źródłem paliw biodiesel.

Wiele informacji na temat komórkowych ról kropelek lipidowych uzyskano z analizy proteomicznej i lipidomicznej kropelek oczyszczonych z organizmów o szerokim zasięgu³. Organizmy te obejmowały bakterie^4,5, drożdże^6-11, rośliny^12,13, nicienie¹⁴ i muchy^15,16. Biorąc pod uwagę zainteresowanie rolą kropelek lipidów w chorobach metabolicznych ludzi, kropelki wyizolowano również z hodowanych komórek zwierzęcych i tkanek zwierzęcych. Hodowlane linie komórkowe obejmowały adipocyty 3T3-L1¹⁷, komórki K2 jajnika chomika chińskiego (CHO)¹⁸, ludzkie hepatocye^19,20 i linie komórek nabłonkowych²¹. Tkanki zwierzęce, z których wyizolowano kropelki, obejmowały mięśnie szkieletowe myszy²², wątrobę²³ i gruczoły sutkowe²³. Jak wspomniano powyżej, celem większości badań izolacji kropel jest przeprowadzenie analizy proteomicznej czynników związanych i analizy lipidomicznej czynników obojętnych i fosfolipidów.

Ponieważ neutralne lipidy - najliczniejszy składnik kropelek lipidów - są mniej gęste niż większość innych materiałów komórkowych, izolacja kropelek była tradycyjnie przeprowadzana za pomocą wirowania w gradiencie gęstości. Ta technika jest centralnym elementem obu prezentowanych tutaj przygotowań. Poprzednie techniki^6,24 są łączone i modyfikowane w celu wizualnego przedstawienia izolacji kropelek z hodowanych komórek drożdży rozszczepieniowych i niehodowanych komórek ludzkich uzyskanych z tkanki łożyska. Celem jest pokazanie szerokiego zastosowania tej techniki poprzez wybór dwóch bardzo różnych typów komórek jako punktów wyjścia do izolacji kropel. Ta technika powinna być przydatna dla tych, którzy chcą wyizolować kropelki z większości organizmów.

Protokół 1 opisuje izolację kropelek lipidów z drożdży rozszczepialnych, Schizosaccharomyces pombe, które zostały użyte jako model do obserwacji tworzenia się kropel podczas podziału komórek eukariotycznych²⁵. Pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae są szeroko stosowane jako organizm modelowy do badania biologii kropelek lipidów. Protokół 1 ma zastosowanie do obu organizmów i podkreślono różnice w preparatach.

Protokół 2 opisuje izolację kropelek lipidów z komórek kosmków łożyskowych, które z kolei są uzyskiwane z ludzkich łożysk terminowych. Pobranie łożysk terminowych daje niepowtarzalną możliwość bezpiecznego i etycznego pozyskania 200-250 g łatwo dostępnej tkanki ludzkiej²⁶, która zawiera znaczną liczbę kropelek lipidów. Jest to przeciwieństwo większości izolacji kropelek lipidów u wyższych eukariontów, gdzie kropelki pochodzą z hodowanych komórek. W tych badaniach kwasy tłuszczowe są często dodawane do hodowli, aby promować syntezę obojętnych lipidów, a tym samym wzrost kropelek. Jest to przeciwieństwo prac tutaj, w których kropelki lipidów powstają w warunkach natywnych w tkance łożyska.

Czystość frakcji kropelek lipidów jest określana za pomocą analizy Western Blot przy użyciu przeciwciał markerów organelli. Te dwa protokoły pozwolą uzyskać frakcje kropelek lipidów, które są odpowiednie do późniejszej analizy proteomicznej i lipidomicznej.

Protocol

1. Izolowanie kropelek lipidów z komórek drożdży (rozszczepienia)

Izolacja kropelek z popularnego organizmu modelowego, pączkującego drożdży Saccharomyces cerevisiae, jest prawie identyczna z następującym protokołem⁶. Odnotowuje się różnice w przygotowaniach.

1. Hodowla komórek drożdży

1. Przygotuj nośnik. Połączyć 36 g proszku YE5S na litr dH₂O w szklanych butelkach lub kolbach hodowlanych. Potrzebne będzie około 2 L pożywki. Autoklawować pożywkę w temperaturze 121 °C przez 20 min. Poczekaj, aż nośnik ostygnie do temperatury pokojowej. Dla S. cerevisiae zastąp YE5S przez YPD.
2. Umieścić 10-20 ml schłodzonej pożywki YE5S w kolbie hodowlanej o pojemności 250 ml przy użyciu sterylnych technik. Zaszczepić pożywkę niewielką ilością komórek drożdży z płytki agarowej za pomocą sterylnego drewnianego patyczka lub jego odpowiednika. Pozwól komórkom urosnąć do pożądanej gęstości optycznej w temperaturze 30 °C. Zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 595 nm za pomocą spektrofotometru.
3. Umieścić pozostałą pożywkę w kolbach o pojemności 2,8 l. Stosować nie więcej niż 1 l pożywki na kolbę o pojemności 2,8 l, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie podczas wzrostu komórek w inkubatorze z wytrząsaniem. Ostateczna wydajność mokrych komórek powinna wynosić około 10 g, aby móc uzyskać wystarczającą ilość kropelek lipidów do analizy proteomicznej i lipidomicznej.
4. Wprowadzić komórki z kroku 1.2 do kolb o pojemności 2,8 l, z których każda zawiera 1 l pożywki, które zostały przygotowane w kroku 1.1.
5. Wyhodować komórki do pożądanej gęstości w temperaturze 30 °C.
6. Upewnij się, że komórki mają kropelki lipidów. Zachowaj 1 ml komórek. Zmierzyć gęstość optyczną (Øn) próbki. Do próbki dodać 0,1 ml 100 mM zapasu BODIPY 493/503 w etanolu na średnicę zewnętrzną komórek. Umieścić 3 μl próbki między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. Wizualizacja pod mikroskopem fluorescencyjnym z filtrem GFP (rysunek 1A).
7. Osadzać komórki z kroku 1.5 w temperaturze 4 °C przy 3 800 x g przez 10 minut. Pracować partiami w zależności od pojemności probówek wirówkowych.
8. Odlej pożywkę YE5S i umyj ogniwa buforem EMM + 600 mM sorbitolu. Sorbitol zapewnia wsparcie osmotyczne.
9. Przenieść komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i granulować komórki w temperaturze 4 °C przy 2 000 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant. Zważ mokre komórki. Zawiesić komórki w 2 ml (EMM + 600 mM sorbitolu) buforu na gram komórek.

2. Przekształcanie komórek drożdży w sferoplasty i późniejsza liza

1. Dodać po 5 mg 1) enzymu litycznego drożdży i 2) enzymów lizy drożdży z Trichoderma harzianum na gram mokrych komórek, które zważono w kroku 1.9. W przypadku S. cerevisiae należy wzmocnić te enzymy taką samą ilością Zymolyase.
2. Inkubować komórki w temperaturze 30 °C pod delikatnym wstrząsaniem z prędkością 100 obr./min przez 60 minut.
3. Sprawdź, czy sferoplasty mają kropelki lipidów. Powtarzając krok 1.6 (Rysunek 1B).

3. Wirowanie w gradiencie gęstości

1. Sferoplasty osadzać przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przy 2 000 x g przez 5 minut.
2. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą plastikowej pipety transferowej.
3. Delikatnie zawieś granulowane sferoplasty za pomocą lodowatego 10 mM Tris-HCl, 600 mM sorbitolu i 200 μM EDTA. Należy pamiętać, że sferoplasty są bardzo delikatne.
4. Ponownie otocz sferoplasty, używając tych samych ustawień, co w kroku 3.1. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić sferoplasty za pomocą plastikowej pipety transferowej w 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl i 200 μM EDTA w stężeniu 2 ml/g-komórek.
5. Przenieś zawieszone sferoplasty do szklanego homogenizatora i delikatnie homogenizuj na lodzie, 20-30 ruchów, za pomocą luźno dopasowanego tłuczka szklanego homogenizatora.
6. Przenieść zlizowane sferoplasty do probówek wirówkowych i nałożyć na tę samą objętość 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl i 200 μM buforu EDTA. Wybierz liczbę probówek wirówkowych, których chcesz użyć, tak aby każda probówka była wypełniona w około dwóch trzecich.
7. Wirować w temperaturze 4 °C przy 100 000 x g przez 1,5 godziny w wirniku SW28 lub równoważnym. Pozwól, aby wirnik wybiegł do zatrzymania (opóźnienie wirnika = 0).
8. Delikatnie przenieść górną pływającą białą warstwę (rysunek 2A), która zawiera kropelki, do nowej probówki wirówkowej za pomocą pipetora lub wygiętej pipety Pasteura. Dodaj do próbki wystarczającą objętość 12% Ficollu, 10 mM Tris-HCl i 200 μM buforu EDTA, aby wypełniła około jednej trzeciej probówki wirówkowej.
9. Dodać równoważną objętość 8% Ficollu, 10 mM buforu Tris-HCl i 200 μM EDTA do górnej części próbki (próbek) w nowej probówce wirówkowej. Po dodaniu tego buforu probówki powinny być wypełnione w około dwóch trzecich.
10. Wirować w temperaturze 4 °C przy 100 000 x g przez 1 godzinę w wirniku SW28 lub równoważnym. Pozwól, aby wirnik wybiegł do zatrzymania (opóźnienie wirnika = 0).
11. Delikatnie przenieść górną pływającą białą warstwę (Rysunek 2B), która będzie zawierać kropelki, do nowej probówki wirówkowej za pomocą pipetora lub wygiętej pipety Pasteura. Dodać 600 mM sorbitolu, 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCl i 200 μM buforu EDTA do próbki, tak aby wypełniła około jednej trzeciej probówki wirówkowej.
12. Dodać równoważną objętość 250 mM sorbitolu, 10 mM Tris-HCl i 200 μM buforu EDTA do górnej części próbki (próbek) w nowej probówce wirówkowej. Po dodaniu tego buforu probówki powinny być wypełnione w około dwóch trzecich.
13. Wirować w temperaturze 4 °C przy 100 000 x g przez 1 godzinę w wirniku SW28 lub równoważnym. Pozwól, aby wirnik wybiegł do zatrzymania (opóźnienie wirnika = 0).
14. Przenieś górną białą warstwę (ryc. 2C), która powinna zawierać tylko kropelki lipidów i związane białka, do rurki dializacyjnej i dializuj O/N do 10 mM buforu Tris-HCl i 200 μM EDTA w celu wyeliminowania Ficollu.

2. Izolowanie kropelek lipidów z ludzkich komórek kosmków łożyskowych

Łożyska pobrano od zdrowych kobiet z ciążą pojedynczą, które przeszły planowy poród przez cesarskie cięcie przed rozpoczęciem spontanicznego porodu w terminie. Badani wyrazili pisemną, świadomą zgodę na pobranie łożyska. Pobranie, a następnie wykorzystanie łożysk zostało przeprowadzone za zgodą University of Tennessee i University of Tennessee Graduate School of Medicine w Knoxville Institutional Review Board (odpowiednio #8757B i #3338).

1. Izolowanie ludzkich komórek kosmków łożyskowych

Część 1 protokołu jest modyfikacją wcześniej opublikowanego protokołu przez Petroffa i wsp.²⁶

Przygotuj następujące rozwiązania:

• NaCl (1 l): rozpuścić 9 g NaCl (M 58,4 g/mol) w dH₂O, aby otrzymać 1 l roztworu. Sterylizacja filtra (membrana 0,2 μm).
• 10x zbilansowany roztwór soli Hanka (10x HBSS) (1 l): 4 g KCl (M 74,5 g/mol); 0,6 g KH₂PO₄ (M 136,086 g/mol); 80 g NaCl (M 58,44 g/mol); Na₂HPO₄ (M 141,96 g/mol); 10 g D-glukozy (M 180,16 g/mol). Rozpuścić każdy ze składników w dH₂O, aby otrzymać 1 l roztworu. Sterylizacja filtra (membrana 0,2 μm).
• Bufor do wytrawiania enzymatycznego (0,6 ml): połączyć 70 ml 10x HBSS z 3,3 ml 7,5% wodorowęglanu Na, 17,5 ml 1 M HEPES i 266,1 ml dH₂O; sterylizować filtrem (membrana 0,2 μm). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
• DNaza I: tuż przed użyciem dodać 5 ml sterylnego 0,9% NaCl do fiolki z DNazą. Przechowywać na lodzie do czasu użycia lub przechowywać w temperaturze -20 °C.

1. Przygotowanie łożyska do rozwarstwienia
   1. Pozyskaj ludzkie łożysko i przetwórz je jak najbliżej czasu porodu. Do transportu łożyska należy użyć szczelnego naczynia, takiego jak lodówka. Zawsze należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z ludzkimi materiałami biologicznymi.
   2. W kapturze bezpieczeństwa biologicznego przenieś łożysko do sterylnego pojemnika nadającego się do sterylizacji w autoklawie i ostrożnie zmyj krew z łożyska i błon za pomocą sterylnego 0,9% roztworu NaCl (soli fizjologicznej). Wylać krwawą sól fizjologiczną do zlewki o pojemności 1 l jako płynny odpad biologiczny.
   3. Umieść łożysko na sterylnym polu, tak aby gładka powierzchnia pępowiny była skierowana do góry. Ostrymi, cienkimi nożyczkami i kleszczami usuń błony płodowe i pępowinę.
   4. Odwróć łożysko tak, aby powierzchnia matki (szorstka powierzchnia) była skierowana do góry. Usuń leżącą nad nią tkankę płytki podstawnej, około 3 mm od powierzchni.
2. Wypreparowanie łożyska
   1. Wypreparuj jeden lień na raz, unikając płytki kosmówkowej. Zebrać tkankę kosmków do zlewki z solą fizjologiczną o pojemności 250 ml.
   2. Wypłucz tkankę kilka razy w oddzielnej zlewce z 0,9% NaCl, mieszając kleszkami, używając zlewki o pojemności 1 l do odpadów płynnych.
   3. Przenoś po jednym liścieniu na szalkę Petriego o średnicy 150 mm. Przytrzymaj kleszczami i zeskrob żyletką tkankę z naczyń na szalce Petriego. Umieść zeskrobaną tkankę w osobnej zlewce zawierającej 0,9% NaCl. Powtórz tę czynność dla wszystkich kawałków tkanki.
   4. Przenieść niewielką część tkanki na sito dysocjacji komórek i dokładnie przepłukać 0,9% NaCl, aż eluat stanie się klarowny. Powtórz dla całej tkanki.
   5. Po wypłukaniu zeskrobanej tkanki na sicie dysocjacji komórek, odsączyć ją z nadmiaru płynu i wagi.
      W tym momencie tkanka może być przechowywana w stanie O/N w sterylnej kolbie Erlenmeyera w temperaturze 4 °C w DMEM.
3. Trawienie enzymatyczne tkanki łożyska
   1. Przygotować mieszaninę do trawienia tkankowego: 100 ml podgrzanego buforu rozcieńczającego enzymy, 1 ml DNazy I i 20 ml 2,5% 10x trypsyna.
   2. Podzielić tkankę, przenosząc 60 g z całkowitej pobranej tkanki (zwykle około 250-300 g) do 500 ml sterylnej kolby Erlenmeyera.
   3. Dodać mieszaninę do wytrawiania tkanek do kolby Erlenmeyera zawierającej tkankę i inkubować w temperaturze 37 °C w wytrząsarce przez 45 minut przy 150 obr./min.
4. Zbieranie zdysocjowanych komórek
   1. Po pierwszych 45 minutach dysocjacji należy ustawić kolbę wytrawiania pod kątem, aż tkanka się uspokoi.
   2. Zebrać supernatant, uważając, aby nie zebrać niezdysocjowanej tkanki. Dodać równą ilość HBSS do zebranego supernatantu i przenieść do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. W przypadku dodatkowych porcji niezdysocjowanej tkanki powtórzyć procedurę, zaczynając od kroku 3.2 z niezdysocjowaną tkanką.
   3. Odwirować homogenat w temperaturze 4 °C przy 1 000 x g przez 15 minut.
   4. Dla każdej partii, po odwirowaniu, odessać supernatant bez naruszania osadu. Komórki kosmków łożyska znajdują się głównie w białej części osadu, pokrywając czerwone krwinki.
   5. Przenieść komórki kosmkowe (białą część osadu) do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przechowywać na lodzie.
   6. Po zebraniu komórek ze wszystkich trzech etapów trawienia, przefiltrować zawiesinę za pomocą nylonowego sitka o wielkości 100 μm umieszczonego w górnej części sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Jeśli filtracja zawiesiny komórek zwalnia, podnieś filtr do góry, aby wciągnąć podciśnienie do rurki.
   7. Wirować w temperaturze 4 °C przy 1 000 x g przez 10 min. Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie naruszając osadu.

2. Homogenizacja komórek kosmków łożyskowych

1. Przed rozpoczęciem procesu izolacji należy przygotować 50 ml hipotonicznego podłoża do lizy (HLM) zawierającego 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 i 1 mM EDTA. Dodaj inhibitory proteazy do HLM tuż przed użyciem i trzymaj pożywkę na lodzie.
2. W kapturze bezpieczeństwa biologicznego dodaj do komórek 4-krotność objętości osadu komórkowego lodowatego HLM. Delikatnie i dokładnie zawiesić komórki, pipetując je w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
3. Inkubować zawieszone komórki na lodzie przez 10 minut.
4. Przenieś komórki do homogenizatora Dounce, który powinien znajdować się na lodzie. Powoli homogenizuj komórki, wykonując 20-25 delikatnych pociągnięć luźno dopasowanym tłuczkiem homogenizatora.
5. Odwirować lizat komórkowy w temperaturze 4 °C przy 3 000 x g przez 10 minut w celu usunięcia nieuszkodzonych komórek, resztek komórkowych i jąder.
6. Zebrać supernatant i przenieść do probówki SW28 (lub alternatywy, którą można odwirować przy 25 000 x g). Wirować w temperaturze 4 °C przy 25 000 x g przez 20 minut w celu usunięcia mitochondriów.

3. Izolowanie kropelek lipidów za pomocą ultrawirowania

1. Przygotować 50 ml 100 mM buforu węglanu sodu (M 106 g/mol) (pH 11,5) i 50 ml 60% roztworu sacharozy (m/m). Inhibitory proteazy dodać do buforu węglanu sodu tuż przed użyciem i przechowywać na lodzie.
2. Zebrać supernatant z kroku 2.6 do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, dostosować do 20% sacharozy i przenieść na dno probówki ultrawirówki dla wirnika SW28 lub równoważnego. Supernatant o dostosowanej gęstości nałożyć na ~10 ml lodowatego buforu węglanu sodu o pojemności 100 mM (pH 11,5) i 0,5-1 ml lodowatego HLM do napełnienia probówki.
3. Wirować w temperaturze 4 °C przy 130 000 x g przez 45 minut za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego SW28. Pozwól, aby wirnik wybiegł do zatrzymania (opóźnienie wirnika = 0).
4. Zebrać pływającą warstwę, dostosować do 10% sacharozy i przenieść na dno probówki ultrawirówkowej o pojemności 13,2 ml do wirnika SW41Ti lub odpowiednika. Supernatant o dostosowanej gęstości nałożyć na około 5 ml lodowatego buforu węglanu sodu o pojemności 100 mM (pH 11,5) i 0,5 ml lodowatego HLM.
5. Wirować w temperaturze 4 °C przy 274 000 x g przez 60 minut za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego SW41Ti. Pozwól, aby wirnik wybiegł do zatrzymania (opóźnienie wirnika = 0), aby zminimalizować zakłócenie warstwy kropel lipidów.
6. Ostrożnie zebrać górną pływającą warstwę (Rysunek 2D) zawierającą kropelki lipidów za pomocą pipety o pojemności 1 ml i powtórzyć krok 3.4.
7. Wirować w temperaturze 4 °C przy 274 000 x g przez 30 minut za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego SW41Ti. Pozwól, aby wirnik wybiegł do zatrzymania (opóźnienie wirnika = 0).
8. Ostrożnie zebrać wygiętą pipetą Pasteura górną białą warstwę pływającą zawierającą kropelki lipidów do trzech probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 100 μl HLM.

Charakterystyka frakcji kropelek lipidów (Protokoły 1 i 2)

Odzyskanie i czystość frakcji kropelek lipidowych można zweryfikować za pomocą Western Blot w połączeniu z mikroskopią świetlną lub elektronową. Ponadto podwielokrotności po różnych etapach wirowania mogą być zbierane i przechowywane w celu określenia wydajności oczyszczania. W Western Blot bardziej odpowiednie jest porównanie objętości frakcji kropelek lipidów, która stanowi odpowiednik lizatu komórkowego całego kraju, niż porównywanie kropelek lipidów z innymi frakcjami błonowymi na podstawie całkowitej zawartości białka²⁴.

Results

Jeśli wirowanie w gradiencie gęstości działało zgodnie z oczekiwaniami, pływająca warstwa powinna zawierać kropelki lipidów i być pozbawiona innych organelli w trakcie postępu szybkich obrotów.

Dla Protokołu 1, Western Blot został przeprowadzony z markerami przeciwciał przeciwko kropelkom lipidów (Erg6p) i organellom, które okazały się oddziaływać z kropelkami lipidów w drożdżach, ER (Dpm1p), mitochondriach (Por1p), błonie plazmatycznej (Pma1p) i wakuolach (Vma1p).

...

Discussion

Krytyczne kroki w ramach tego protokołu

Upewnij się, że jesteś spójny z pożywką i gęstością komórek podczas wzrostu hodowanych komórek. Komórkowe kropelki lipidów są wyjątkowe, ponieważ związane z nimi białka są w dużym stopniu zależne od środowiska, w którym hodowane są komórki¹⁷. Dlatego pożywka, w której hodowane są komórki, oraz gęstość komórek powinny być ściśle monitorowane przed lizą.

Skład białkowy kropelek lipidó...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protokół 1
1. Hodowla komórek drożdży i przekształcanie ich w sferoplasty
Edinburgh Minimal Media (EMM)	Sunrise Science Products	2005
Ekstrakt drożdżowy z 5 suplementami (YE5S)	Sunrise Science Products	2011	Pożywka YE5S z 225 mg/ml każdego suplementu: adeninie, histydyna, leucyna, lizyna, uracyl. Odpowiednikiem drożdży pączkujących byłby YPD.
Proszek YPD	Sunrise Science Products	1875	Dla S. cerevisiae
Sorbitol	Fisher Scientific	BP439
Drożdżowy enzym lityczny	MP Biomedicals	215352610
Enzymy lizujące z Trichoderma harzianum	Sigma-Aldrich	L1412
Zymolayse-20T	Sunrise Science Products	N0766391	Do S. cerevisiae
BODIPY 493/503	Invitrogen	D-3922
Szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	12-544-7
Szklana osłona mikroskopu	Fisher Scientific	12-542-B
Plastikowa pipeta transferowa	Fisher Scientific	137115AM
Szklana butelka
1 LKolba
250 ml Kolby
2. Izolacja kropelek lipidów drożdży
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153
EDTA	Fisher Scientific	BP120
Ficoll 400	Fisher Scientific	BP525
12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane	SpectrumLabs	132680
Tabletki koktajlowe inhibitora proteazy bez EDTA	Roche Diagnostics	11873580001	drażniący
homogenizator Dounce	Sigma-Aldrich	D9938
Ultrawirówki 25 mm x 89 mm (do SW28)	Beckman-Coulter	355642
12-14k Spectra/Por	SpectrumLabs	132680
Wytrząsarka z kontrolowaną	temperaturą New Brunswick Scientific	C25KC
Thermo Sorvall Legend XTR Wirówka	Thermo-Scientific	75004521
Wirówka kubełkowa wahliwa	Rotor Thermo-Scientific	75003607
Fiberlite* F15-6x100Y Wirnik o stałym kącie	nachylenia Thermo-Scientific	75003698
Ultrawirówka LB-M	Beckman-Coulter
SW28 Ultrawirówka	Beckman-Coulter	342204
Protokół 2
1. Izolacja komórek kosmków łożyskowych
Jednorazowe podkładki	Fisher Scientific 23666062
Patelnia (pojemnik) do sterylizacji w autoklawie, 3 L	Fisher Scientific	1336110
Cienkie nożyczki, ostre, proste	Narzędzia do nauki	1406011
Londynie	Kleszcze Narzędzia do nauki 1108002
Dumont #7b Kleszcze	Narzędzia do nauki o tematyce precyzyjnej	1127020
Żyletki	Fisher Scientific	S65921
Kubek sitowy do CD-1	Fisher Scientific	S1145
40 siatkowy ekran	Fisher Scientific	S0770
Barwniki komórkowe Fisherbrand 100 μ m	Fisher Scientific	22363549
150 mm Szalki Petriego	Fisher Scientific	NC9054771
NaCl	Fisher Scientific	S642
KCl	Fisher Scientific	P333
KH2PO4	Fisher Scientific	P386
Na2HPO 4	Fisher Scientific	S374
D-Glukoza	Fisher Scientific	D16
HEPES	Fisher Scientific	BP310
2,5% Trypsyna 10x	Invitrogen	15090046
DNaza I stopnia II, z trzustki bydlęcej	Roche Applied Science	10104159001
Roztwór	wodorowęglanu soduSigma-Aldrich	S8761
500 ml Kolby
250 ml Zlewki
15 ml Probówki
10 ml Pipety
50 ml Probówki
DMEM	Invitrogen	11965084
2. Izolacja kropelek lipidów z komórek kosmków łożyska
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153
EDTA	Fisher Scientific	BP120
D-Sacharoza	Fisher Scientific	BP220
Węglan sodu	Fisher Scientific	BP357
Tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy bez EDTA	Roche Diagnostics	11873580001	drażniący
homogenizator Dounce	Sigma-Aldrich	D9938
Probówki do ultrawirówek 25 mm x 89 mm (do SW28)Probówki	Beckman-Coulter	355642
Ultra-Clear 14 mm x 89 mm (do SW41)	Beckman-Coulter	344059
Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego	Fisher Scientific	1367820C
Kaptur bezpieczeństwa biologicznego	Thermo-Scientific
Waterbath	Fisher Scientific
Wytrząsarka z kontrolowaną temperaturą	New Brunswick Scientific	C25KC
Wirówka Thermo Sorvall Legend XTR	Thermo-Scientific	75004521
Wirówka z wiadrem wahadłowym	Rotor Thermo-Scientific	75003607
Ultrawirówka LB-M	Beckman-Coulter
SW28	Redlica Beckman-Coulter	342204
SW41 Ti Ultrawirówka	Rotor Beckman-Coulter	331336
Western blot
IRDye 680 Kozia IgG	LI-COR	926-68071	rozcieńczenie 1:15 000
IRDye 800CW Koza Anty-mysie IgG	LI-COR	926-32210	rozcieńczenie 1:5 000
NuPAGE Novex 12% żele Bis-Tris	Invitrogen	NP0341
Pierwotne przeciwciała dla Protokołu 1
Erg6p	prezent od Dr. G. Daum	Graz University of Technology, Austria	rozcieńczenie 1:5,000
Dpm1p	Abcam	ab113686	4 μ g/ml
Por1p	prezent od Dr. G. Daum	Graz University of Technology, Austria	rozcieńczenie 1:5,000
Pma1p	prezent od Dr. G. Daum	Graz University of Technology, Austria	rozcieńczenie 1:10,000
Vma1p (anty-ATP6V1A)	Abcam	ab113745	0,5 μ g/ml
Pierwszorzędowe przeciwciała dla Protokołu 2
Perilipin 2 (anty-ADFP)	Abcam	ab52355	2 μ g / ml
Calnexin	Cell Signaling Technology	2679	rozcieńczenie 1:1,000
GM130	Biorbyt	orb40533	rozcieńczenie 1:25
COX IV	Technologia sygnalizacji komórkowej	4850	rozcieńczenie 1:1,000
MEK1	Biorbyt	orb38775	rozcieńczenie 1:50