Węzły chłonne to tkanki immunologiczne, które koordynują odpowiedź immunologiczną i są kluczowym celem dla szczepionek. Biomateriały zostały wykorzystane do lepszego celowania w węzły chłonne i kontrolowania dostarczania antygenów lub adiuwantów. W artykule opisano technikę łączącą te idee w celu wstrzykiwania biokompatybilnych cząstek polimeru do węzłów chłonnych.
Artykuł metodologiczny
Iniekcja do węzłów chłonnych biodegradowalnych cząstek polimeru
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Generowanie adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej polega na efektywnym drenażu lub transporcie antygenu do węzłów chłonnych w celu przetworzenia i prezentacji tych obcych cząsteczek do limfocytów T i B. Węzły chłonne stały się zatem krytycznymi celami dla nowych szczepionek i immunoterapii. Niedawną strategią celowania w te tkanki jest bezpośrednie wstrzykiwanie rozpuszczalnych składników szczepionki do węzłów chłonnych, a badania kliniczne z udziałem tej techniki są obiecujące. Zbadano również kilka strategii dotyczących biomateriałów w celu poprawy celowania w węzły chłonne, na przykład dostrajając wielkość cząstek w celu optymalnego drenażu cząstek szczepionki biomateriałowej. W artykule przedstawiono nową metodę, która łączy bezpośrednią iniekcję węzłów chłonnych z biodegradowalnymi cząstkami polimeru, które mogą być obciążone antygenem, adiuwantem lub innymi składnikami szczepionki. W tej metodzie mikrocząstki polimerowe lub nanocząstki są syntetyzowane za pomocą zmodyfikowanego protokołu podwójnej emulsji zawierającego stabilizatory lipidowe. Właściwości cząstek (np. wielkość, obciążenie ładunku) potwierdza się odpowiednio za pomocą dyfrakcji laserowej i mikroskopii fluorescencyjnej. Mysie węzły chłonne są następnie identyfikowane przez obwodowe wstrzyknięcie nietoksycznego barwnika znacznikowego, który umożliwia wizualizację docelowego miejsca wstrzyknięcia, a następnie osadzanie cząstek polimeru w węzłach chłonnych. Technika ta umożliwia bezpośrednią kontrolę nad dawkami i kombinacjami biomateriałów i składników szczepionek dostarczanych do węzłów chłonnych i może zostać wykorzystana do opracowania nowych szczepionek opartych na biomateriale.
Wprowadzenie
Węzły chłonne (LN) są centrami dowodzenia układu odpornościowego. W tym miejscu immunologicznym komórki prezentujące antygen przygotowują naiwne limfocyty przeciwko specyficznym obcym antygenom, aby aktywować komórkową i humoralną odpowiedź immunologiczną. W związku z tym LN stały się atrakcyjnym celem dla dostaw szczepionek i immunoterapii. Niestety, większość strategii szczepień skutkuje nieefektywnym, przejściowym dostarczaniem antygenu i adiuwantów do tkanki limfatycznej1. Podejścia, które poprawiają celowanie i zatrzymywanie składników szczepionki w LN mogą zatem mieć znaczący wpływ na siłę i skuteczność nowych szczepionek.
Jedną ze strategii obejścia wyzwania związanego z celowaniem w LN, która wykazała duże zainteresowanie nowymi badaniami klinicznymi, jest bezpośrednie wstrzyknięcie do LN (i.LN.)2-4. W tych badaniach stosowano wskazówki ultradźwiękowe, aby dostarczyć szczepionki do LN jako prostą procedurę ambulatoryjną. W porównaniu z tradycyjnymi obwodowymi drogami iniekcji, podejście to zaowocowało znacznym oszczędzeniem dawki i poprawą skuteczności w kontekstach terapeutycznych, w tym w przypadku alergii i nowotworów2-4. W badaniach tych stosowano m.in. wstrzykiwanie szczepionek rozpuszczalnych (tj. wolnych od biomateriału), które były szybko usuwane przez drenaż limfatyczny. W związku z tym, aby osiągnąć te imponujące efekty terapeutyczne, podawano wielokrotne zastrzyki lub cykle wielokrotnych wstrzyknięć. Lepsza retencja w LN może zwiększyć interakcję między antygenem i/lub adiuwantem a komórkami odpornościowymi, co jeszcze bardziej poprawi siłę działania pobudzania komórek odpornościowych. Potencjał ten jest wspierany przez ostatnie badania, które pokazują, że kinetyka dostarczania antygenu i adiuwantów odgrywa kluczową rolę w określaniu specyficznej odpowiedzi immunologicznejgenerowanej 5-7. Co więcej, lokalizacja i minimalizacja dawek leków i szczepionek może zmniejszyć lub wyeliminować skutki ogólnoustrojowe, takie jak przewlekły stan zapalny.
Biomateriały zostały gruntownie przebadane w celu zwiększenia siły działania i skuteczności szczepionek1,8,9. Hermetyzacja lub adsorpcja na nośnikach biomateriałów może fizycznie chronić ładunek przed degradacją i przezwyciężyć ograniczenia rozpuszczalności. Inną godną uwagi cechą nośników biomateriałów, takich jak mikro- lub nanocząstki polimerowe, jest zdolność do załadunku kilku klas ładunków, a następnie uwalniania tych ładunków w kontrolowanych odstępach czasu. Jednak istotnym ograniczeniem, które nadal utrudnia szczepionki biomateriałowe i immunoterapie in vivo, jest nieskuteczne celowanie w komórki odpornościowe i ograniczony transport do węzłów chłonnych. Na przykład obwodowe wstrzykiwanie szczepionek z biomateriału konwencjonalnymi drogami (np. śródskórnymi, domięśniowymi) zwykle wykazuje słabe ukierunkowanie na LN, przy czym do 99% wstrzykniętego materiału pozostaje w miejscu wstrzyknięcia4,10. Ostatnio rozmiar nośników szczepionek z biomateriałów został dostrojony w celu poprawy preferencyjnego transportu lub drenażu tych szczepionek do LN poprzez przepływ śródmiąższowy8,10. Postępy te doprowadziły do wzmocnienia komórkowej i humoralnej odpowiedzi immunologicznej, podkreślając znaczenie ukierunkowania i inżynierii środowiska LN dla nowych szczepionek.
Ten artykuł przedstawia protokół szczepień, który łączy stabilizowane lipidami cząsteczki polimeru i dostarczanie i.LN. w celu wytworzenia magazynów szczepionek o kontrolowanym uwalnianiu5,11. Opierając się na ostatnich badaniach wykorzystujących techniki chirurgiczne dla i.LN. u myszy6,7,12,13, opracowaliśmy szybką, niechirurgiczną strategię wstrzykiwania szczepionek z biomateriałem małym zwierzętom5. Połączenie dostarczania i.LN. z nośnikami szczepionki z biomateriału silnie wzmocniło odpowiedź limfocytów T CD8 w ciągu 7 dni po pojedynczym wstrzyknięciu zapasów szczepionki o kontrolowanym uwalnianiu5. Wygenerowano również silną odpowiedź humoralną (tj. miana przeciwciał); Oba ulepszenia były związane ze zwiększoną retencją składników szczepionki w węzłach chłonnych, w której pośredniczyło kontrolowane uwalnianie z nośników biomateriału. Co ciekawe, wielkość cząstek szczepionki zmieniła los tych materiałów, które kiedyś znalazły się w LN: cząstki w nanoskali wykazywały zwiększony bezpośredni wychwyt przez komórki, podczas gdy większe mikrocząstki pozostawały w zewnątrzkomórkowym środowisku LN i uwalniały ładunek (np. adiuwant), który był pobierany przez komórki prezentujące antygen rezydujący w LN5. Dane te sugerują dwie ścieżki, które można wykorzystać w nowych szczepionkach poprzez kontrolowanie wielkości wstrzykiwanych biomateriałów i.LN.
W tym artykule biodegradowalne cząstki polimeru stabilizowanego lipidami (w skali mikro- i nano) są syntetyzowane przy użyciu zmodyfikowanej strategii podwójnej emulsji5,11. Właściwości cząstek są charakteryzowane przez dyfrakcję laserową i mikroskopię. Cząstki te są następnie wstrzykiwane bezpośrednio do pachwinowych LN zidentyfikowanych niechirurgicznie przy użyciu zwykłego, nietoksycznego barwnika znacznikowego14. Analiza LN po wstrzyknięciu za pomocą histologii lub cytometrii przepływowej może być wykorzystana do weryfikacji rozmieszczenia cząstek w środowisku LN, a także do monitorowania wychwytu komórkowego i zatrzymywania cząstek w czasie. Aby zapoznać się z protokołami szczegółowo opisującymi przetwarzanie histologiczne i cytometrię przepływową, czytelnicy są odsyłani do najnowszych artykułów JoVE i raportów z czasopism15-22. Typowe wyniki wskazują na lokalne ukierunkowanie LN na te magazyny, które można wykorzystać do osiągnięcia silnej, efektywnej odpowiedzi immunologicznej lub dostosowania odporności do docelowych patogenów.
Protokół
Wszystkie badania na zwierzętach w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z federalnymi, stanowymi i lokalnymi wytycznymi, przy użyciu protokołów zweryfikowanych i zatwierdzonych przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Maryland (IACUC).
1. Synteza mikro- i nanocząstek stabilizowanych lipidami
- W szklanej fiolce (fiolkach) o pojemności 7 ml połącz lipidy DOPC, DSPE-PEG i DOTAP w stosunku molowym 60:20:20, aby przygotować główną mieszankę lipidów.
- Aby zsyntetyzować pojedynczą próbkę: Przenieść 242,9 μl, 287,4 μl i 71,9 μl odpowiednio DOPC, DSPE-PEG i DOTAP do fiolki za pomocą szklanych pipet serologicznych o pojemności 2 ml.
- Aby zsyntetyzować wiele próbek: Pomnóż każdą objętość lipidów powyżej przez liczbę próbek i połącz w jedną fiolkę, a następnie przenieś równe porcje tej mieszaniny lipidów do fiolek odpowiadających każdej próbce, która ma być przygotowana.
- Suszyć lipidy pod delikatnym strumieniem azotu gazowego przez 10 minut lub umieścić na noc w piekarniku próżniowym.
- W pojedynczej, pustej szklanej fiolce o pojemności 20 ml rozpuścić 80 mg PLGA w 5 ml dichlorometanu na każdą próbkę cząstek, aby uzyskać roztwór podstawowy polimeru o stężeniu 16 mg/ml.
- Dodać 5 ml roztworu polimeru do fiolki (fiolek) zawierającej osuszone lipidy, kapturek i wir przez 30 sekund.
- Aby zsyntetyzować mikrocząstki:
- Rozpocznij sonikację fazy organicznej zawierającej polimer, lipidy i inne nierozpuszczalne w wodzie ładunki na lodzie przy 12 W za pomocą sonikatora.
- Utworzyć emulsję typu woda w oleju (w/o), używając pipety, aby dodać 500 μl destylowanegoH2OlubH2Ozawierającego 1 mg peptydu, białka lub innego rozpuszczalnego w wodzie ładunku.
- Kontynuuj sonikację przez 30 sekund przy 12 W na lodzie, delikatnie kołysząc fiolką w górę i w dół oraz na boki wokół końcówki sonikatora, aby zapewnić pełną emulgację.
- Utworzyć emulsję typu woda w oleju w wodzie (w/o/w), wlewając emulsję bez wody do 40 mlH2Ow zlewce o pojemności 150 ml.
- Homogenizować przez 3 minuty przy 16 000 obr./min za pomocą homogenizatora cyfrowego.
- Dodać mieszadło magnetyczne, przenieść zlewkę na płytkę mieszającą i pozostawić emulsję bez masy do wymieszania przez noc, aby usunąć nadmiar rozpuszczalnika.
- Aby zsyntetyzować nanocząstki:
- Rozpocznij sonikację fazy organicznej zawierającej polimer, lipidy i inne nierozpuszczalne w wodzie ładunki na lodzie przy 14 W.
- Za pomocą pipety należy utworzyć emulsję bez użycia pipety, aby dodać 500 μl destylowanegoH2OlubH2Ozawierającego 1 mg peptydu, białka lub innego rozpuszczalnego w wodzie ładunku.
- Kontynuuj sonikację przez 30 sekund przy 14 W na lodzie.
- Emulsję w/o/w należy stworzyć, wlewając emulsję w/o do 40 mlH2Ow zlewce o pojemności 150 ml i sonikując przez 5 minut przy 16 W na lodzie. Delikatnie kołysz fiolką w górę i w dół oraz na boki wokół końcówki sonikatora, aby zapewnić pełną emulgację.
- Dodać mieszadło magnetyczne, przenieść kolbę na płytkę mieszającą i pozostawić emulsję bez masy do wymieszania przez noc w celu usunięcia nadmiaru rozpuszczalnika.
- Następnego ranka umyj i zbierz cząstki:
- Przelać emulsję przez sitko z siatki nylonowej o grubości 40 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Odwirować cząstki przez 5 minut przy 5 000 x g w przypadku mikrocząstek lub 5 minut przy 24 000 x g w przypadku nanocząstek.
- Zdekantować supernatant i przepłukać cząstki przez ponowne zawieszenie w 1 mlH2O.
- Przenieść zawieszone cząstki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
- Wirować przez 5 minut przy 5 000 x g dla mikrocząstek lub 5 minut przy 24 500 x g dla nanocząstek.
- Przepłukać cząstki jeszcze dwukrotnie, usuwając sklarowany nad osadem, ponownie zawieszając w 1 mlH2Oi odwirowując, jak w kroku 1.6.5. Po umyciu zawiesić cząstki w 1 mlH2Odo natychmiastowego użycia lub liofilizować w celu przedłużonego przechowywania.
2. Pomiar wydajności syntezy
- Zważ pustą szklaną fiolkę o pojemności 20 ml. Dodać 100 μl zawiesiny cząstek do wstępnie zważonej fiolki po pipetowaniu w górę i w dół za pomocą mikropipety w celu wymieszania.
- Liofilizuj cząstki lub wysusz pod delikatnym strumieniem azotu.
- Zważyć fiolkę zawierającą wysuszony polimer. Określić zawartość cząstek w fiolce, odejmując pierwotną masę fiolki od masy fiolki zawierającej suszone cząstki.
- Oznaczyć całkowitą wydajność cząstek, mnożąc masę cząstek w fiolce przez współczynnik rozcieńczenia. Aby określić procentową wydajność, podziel masę cząstek przez maksymalną teoretyczną masę wejściową i pomnóż przez 100%.
3. Określanie wielkości cząstek
- Wyczyść dostarczoną szklaną kuwetę frakcjonacyjną, napełniając ją wodą dejonizowaną i wycierając wacikiem z bawełnianą końcówką. Przenieść 10 ml destylowanegoH2Odo oczyszczonej komórki frakcyjnej, dodać magnetyczny mikromieszadło i załadować komórkę frakcji do mocowania komory analizatora wielkości cząstek.
- Wyreguluj prędkość mieszania magnetycznego w analizatorze cząstek, aby uzyskać całkowite wymieszanie w celi frakcji i zamknij drzwi komory.
- Wyrównaj lasery z komórką frakcji za pomocą interfejsu oprogramowania przyrządu.
- Użyj interfejsu oprogramowania przyrządu, aby zarejestrować odczyt linii bazowej z komórką frakcjonacyjną zawierającą tylko destylowany H2O.
- Odpipetować oryginalną zawiesinę cząstek w górę iw dół za pomocą mikropipety, aby wymieszać.
- Odpipetować 10 μl zawiesiny cząstek (zwykle około 0,5 mg) do komórki frakcjonowej. Upewnij się, że objętość próbki cząstek dodanych do celi jest wystarczająca do wygenerowania siły sygnału w odpowiednim zakresie, jak wskazano w interfejsie oprogramowania przyrządu. Rzeczywista wymagana masa cząstek zależy od procentowej wydajności i właściwości optycznych próbki cząstek.
- Zamknij drzwiczki komory analizatora wielkości cząstek i zmierz wielkość cząstek, używając współczynnika załamania światła 1,60 dla PLGA.
- Użyj interfejsu oprogramowania, aby obliczyć średnicę cząstek na podstawie liczby.
4. Wizualizacja cząstek
- Zawiesinę cząstek pipety w górę iw dół za pomocą mikropipety do wymieszania. Rozcieńczyć zawiesinę cząstek do 1 mg/ml w wodzie dejonizowanej.
- Przygotować szkiełko mikroskopowe, dodając 3 μl zawiesiny rozcieńczonych cząstek i montując szkiełko nakrywkowe pod kątem 45°, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopowym i obrazu, używając odpowiednich zestawów filtrów dla każdego ładunku fluorescencyjnego.
5. Przygotowanie myszy dla i.LN. Zastrzyk
- Przygotuj roztwór barwnika znacznikowego:
- Przygotować 0,1% (w/v) roztwór barwnika znacznikowego, rozpuszczając 10 mg barwnika w proszku w 10 ml destylowanego H2O.
- Wysterylizować roztwór barwnika do szklanej fiolki za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm.
- Na dzień przed wstrzyknięciem należy znieczulić mysz za pomocą izofluranu zgodnie z protokołem dla zwierząt zatwierdzonym przez IACUC. Aby ocenić głębokość znieczulenia, wykonaj test odruchu szczypania palców u nóg i monitoruj częstość oddechów, aby zapewnić częstość oddechów około 100-140 oddechów na minutę.
- Ogol włosy u nasady ogona i tylnej ćwiartki za pomocą maszynki do strzyżenia, podczas gdy mysz jest znieczulona. Usuń sierść z brzusznej strony zwierzęcia i bocznie dookoła strony grzbietowej tuż nad stawem tylnej nogi (biodra).
- Wstrzyknąć barwnik znacznikowy.
- Do każdego wstrzyknięcia barwnika należy za pomocą mikropipety przenieść 10 μl roztworu barwnika do probówki mikrowirówkowej i odessać całe 10 μl do igły 31G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.
- Wstrzyknąć 10 μl roztworu barwnika podskórnie po każdej stronie podstawy ogona, w miejscu, w którym włosy zostały obcięte, ponownie ładując między wstrzyknięciami.
- Usuń pozostałe włosy, nakładając łagodny krem do depilacji za pomocą bawełnianych wacików. Pamiętaj, aby pokryć obszar między tylnym udem a brzuchem.
- Pozostaw krem do depilacji na skórze przez 3 minuty. Po inkubacji zwilż dłoń w rękawiczce ciepłymH2Oi delikatnie wetrzyj krem do depilacji w skórę.
- Natychmiast usuń krem do depilacji, zwilżając dłoń w rękawiczce ciepłymH2Oi pocierając podstawę ogona i zad. Powtarzaj, aż nadmiar depilacji zostanie usunięty, upewniając się, że ręka jest mokra, aby uniknąć podrażnień.
- Usuń resztki depilacji z myszy, zwilżając miękką szmatkę lub ręcznik papierowy ciepłymH2Oi jednym ruchem wycierając dolną część myszy. Unikaj ruchu pocierania, aby zapobiec otarciu lub uszkodzeniu skóry myszy.
- Pozwól myszy dojść do siebie pod lampą grzewczą i wróć do trzymania.
6. i.LN. Wstrzykiwanie cząstek
stałych- Następnego dnia znieczulij mysz za pomocą izofluranu zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez IACUC.
- Zbadaj mysz, aby potwierdzić drenaż barwnika znacznikowego do każdego pachwinowego węzła chłonnego. Węzeł chłonny powinien być widoczny jako ciemna plama w pobliżu tylnego uda i brzucha.
- Przygotować roztwór do wstrzykiwań cząstek:
- Zawiesić cząstki w destylowanymH2Oo żądanym stężeniu wtrysku. Do każdego wstrzyknięcia należy za pomocą mikropipety przenieść 10 μl roztworu cząstek stałych do probówki do mikrowirówki.
- Odessać całe 10 μl do igły insuliny 31 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.
- Wstrzyknąć dawkę cząstek:
- Po wizualizacji LN napnij skórę wokół LN za pomocą kciuka, palca wskazującego i środkowego palca, aby pociągnąć drwinę skóry i umożliwić kontrolowane umieszczenie objętości wstrzyknięcia.
- Zbliżyć się do LN z igłą pod kątem 90° do skóry i wbić się w skórę nad farbowanym LN na głębokość 1 mm.
- Powoli wstrzyknąć całą objętość. Podczas wstrzykiwania należy obserwować objętość LN przez skórę, aby potwierdzić wstrzyknięcie poprzez widoczne powiększenie LN.
- Pozwól myszy dojść do siebie pod lampą grzewczą i wróć do trzymania lub przeprowadź dodatkowe testy.
Odpowiednie techniki analizy (np. histologia, cytometria przepływowa) patrz JoVE Articles 265, 1743 i 3054 oraz Current Protocols in Immunology, rozdziały 5 i 2115-22.
Wyniki
Oczekiwane wyniki dla protokołów przedstawionych w niniejszym manuskrypcie można podzielić na trzy kategorie: syntezę cząsteczek, przygotowanie zwierząt oraz wstrzykiwanie cząsteczek.
Rysunek 1 przedstawia syntezę i charakterystykę biodegradowalnych cząsteczek polimerowych stabilizowanych lipidami amfifilowymi. Wyniki protokołu syntezy metodą emulsji i odparowania rozpuszczalnika (Rysunek 1A) można ocenić jakościowo poprzez wizualną inspekcję otrzymanych końcowych emulsji; partie cząsteczek powinny stanowić homogeniczne, stabilne emulsje o nieprzezroczystym wyglądzie. Do komplikacji należą emulsje, które ulegają kremowaniu lub flokulacji, co często wynika z niewłaściwego przechowywania stabilizatorów lipidowych. Aby uniknąć tej niestabilności, lipidy należy przechowywać w temperaturze -80 °C w stanie odwodnionym lub w szczelnej fiolce przepłukanej azotem. Ilościową ocenę syntezy cząsteczek można przeprowadzić za pomocą dyfrakcji laserowej lub dynamicznego rozpraszania światła w celu analizy rozkładu wielkości (Rysunek 1B). Oczekiwanymi wynikami są wąsko rozłożone, monomodalne rozmiary cząsteczek, co wskazuje na jednorodną populację cząsteczek. Parametry syntezy opisane w niniejszym opracowaniu generują rozkłady średnie liczbowe wycentrowane odpowiednio wokół 100 nm dla nanocząsteczek i 3 µm dla mikrocząsteczek. Dalszą jakościową ocenę syntezy cząsteczek można przeprowadzić poprzez modyfikację powyższego protokołu w celu włączenia wielu klas fluorescencyjnych ładunków. Na Rysunku 1C obrazy mikroskopowe mikrocząsteczek obciążonych fluorescencyjnym peptydem (FITC, zielony), barwnikiem lipofilowym (DiD, czerwony) oraz obraz nałożony (żółty) potwierdzają utworzenie cząsteczek w pożądanym zakresie wielkości oraz enkapsulację peptydu w objętości cząsteczki.
Dwa pierwsze panele Rysunku 2 podsumowują oczekiwane wyniki przygotowania zwierząt do strategii wstrzykiwania i.LN. opisanej w niniejszej pracy. Metodologia obejmuje znakowanie węzłów chłonnych pachwinowych poprzez obwodowe wstrzyknięcie nietoksycznego znacznika w celu zidentyfikowania miejsca dla późniejszego wstrzyknięcia cząsteczek drogą i.LN. (Rysunek 2A)5. Jak zauważono, drenaż barwnika znacznika po podskórnym wstrzyknięciu u nasady ogona umożliwi wizualizację węzłów chłonnych pachwinowych (Rysunek 2B)5. Spożycie dopuszczonych kremów depilacyjnych może stanowić zagrożenie dla myszy. Należy zatem zadbać o dokładne usunięcie całego nałożonego kremu, zwracając szczególną uwagę na łapy oraz stronę brzuszną myszy. Środek depilujący należy usuwać za pomocą wilgotnej, miękkiej szmatki lub wilgotnego ręcznika papierowego jednym, płynnym ruchem. Należy unikać pocierania w celu usunięcia kremu, ponieważ może to doprowadzić do powstania otarć na odsłoniętej skórze myszy.
Potwierdzenie dostarczenia substancji do węzła chłonnego (LN) pachwinowego można przeprowadzić poprzez obserwację lub badanie histologiczne. Objętość LN można monitorować wizualnie podczas wstrzykiwania jako wskaźnik poprawnego wykonania procedury. Oczekiwane wyniki obejmują efektywny rozkład ładunku w całej strukturze LN, bez istotnego wycieku do sąsiednich tkanek lub komórek. Ponadto, ponieważ wstrzykiwany płyn wypiera/rozcieńcza znacznik w LN, stężenie/intensywność barwnika powinna zmaleć po iniekcji. Obserwacja tkanki powinna wykazać nienaruszony, lecz powiększony LN w wyniku wstrzyknięcia płynu. Potencjalne problemy obejmują zbyt szybkie wstrzykiwanie lub chybienie w LN, co w obu przypadkach może spowodować wypłukanie objętości do otaczającej tkanki podskórnej. Te niepożądane wyniki można potwierdzić podczas nekropsji lub badania histologicznego, gdzie zaobserwowane zostanie rozprzestrzenianie się zawiesiny cząsteczek do komórek i tkanek oddalonych od węzłów będących celem iniekcji. W przeciwieństwie do tego, oczekiwanym wynikiem byłaby identyfikacja powiększonego LN pachwinowego ze względu na zatrzymanie cząsteczek w strukturze LN. Przetwarzanie histologiczne wyciętych LN może jednoznacznie potwierdzić dostarczenie ładunku do tkanki limfatycznej, co pokazano na rysunkach 2C i 2D. Należy zauważyć, że cząsteczki na rysunku 2 zawierają fluorescencyjny ładunek, co umożliwia wizualizację ładunku podczas wstrzykiwania, a także podczas przetwarzania histologicznego i mikroskopii fluorescencyjnej.
Rycina 1. Synteza i charakterystyka cząstek stabilizowanych lipidami. A) Schemat opisujący syntezę cząstek stabilizowanych lipidami przygotowanych metodą emulsji/odparowania rozpuszczalnika. B) Rozkłady wielkości mikrocząstek (linia ciągła, średnica = 2.8 μm) i nanocząstek (linia przerywana, średnica = 113 nm). C) Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej cząstek załadowanych znakowanym fluorescencyjnie peptydem oraz fluorescencyjnym barwnikiem do cząstek. Oznaczenia: peptyd (zielony) i cząstka (czerwony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rycina 2. i.LN. Iniekcja i dystrybucja biodegradowalnych cząstek wewnątrz LN. A) Metodyka iniekcji i.LN.. B) Wizualizacja LN u myszy przez skórę (obraz górny) oraz po sekcji (obraz dolny)5. C) Barwienie histologiczne LN potwierdzające osadzanie i dystrybucję fluorescencyjnie znakowanych mikrocząstek polimerowych (cząstki, zielone; limfocyty T, czerwone; limfocyty B, niebieskie). D) Fluorescencyjnie znakowane nanocząstki (50 nm, obraz lewy) i mikrocząstki (6 µm, obraz prawy) w LN 24 hr po iniekcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Dyskusja
Technika opisana w tym protokole pozwala na kontrolowane dostarczanie szczepionek do LN i do komórek prezentujących antygen rezydujący w LN. Ładunek zamknięty w biomateriale może być zlokalizowany w obrębie LN, co umożliwia manipulowanie dawkami jednego lub więcej rodzajów ładunków dostarczanych do mikrośrodowiska LN. Wykazano, że lokalizacja i kontrolowane uwalnianie z cząstek polimeru generuje silną komórkową i humoralną odpowiedź immunologiczną przy znacznie niższych dawkach niż konwencjonalne podejścia. Ponadto, poprzez manipulację wielkością nośnika biomateriału, podstawowy tryb przetwarzania komórkowego może być modulowany między bezpośrednim wychwytem nanocząstek a zewnątrzkomórkowym uwalnianiem ładunku z większych mikrocząstek5. Wyniki te wskazują na wykonalność dostarczania biomateriału i.LN. jako platformy do dostarczania szczepionek terapeutycznych.
Synteza cząstek PLGA przez odparowanie emulsji/rozpuszczalnika jest szeroko stosowana w zastosowaniach związanych z dostarczaniem leków23,24. W związku z tym potencjalne wyzwania związane z tą techniką dotyczą głównie skutecznej identyfikacji i depozycji szczepionek w miejscu docelowym LN. Chociaż zastosowanie barwnika znacznikowego ułatwia wizualizację docelowych pachwinowych LN, docelowy rozmiar i głębokość pod skórą są niewielkie. Dlatego autorzy zalecają przeznaczenie czasu i myszy na ćwiczenie przygotowania i wstrzykiwań myszom. Podczas przygotowania zwierząt (tj. golenia i stosowania depilatora) należy uważać, aby nie skaleczyć myszy po brzusznej stronie zwierzęcia, gdzie kąt nogi z brzuchem sprawia, że skóra jest bardziej podatna na zranienia maszynkami do strzyżenia. Dodatkowo wszystkie depilatory należy usunąć ciepłą wodą, aby zapobiec połknięciu kremu przez zwierzęta podczas normalnego zachowania pielęgnacyjnego. Aby ćwiczyć wstrzykiwanie LN, można podać wyższe stężenie barwnika znacznikowego, a ćwiczące zwierzęta można poddać eutanazji, a następnie wstrzyknąć im wiele razy. Po wstrzyknięciu myszy mogą być poddawane sekcji zwłok, a wielkość LN od wstrzykniętych zwierząt może być porównana z niewstrzykniętą kontrolną LN. Jednym z ograniczeń tej techniki jest fizyczne ograniczenie objętości iniekcji, którą można załadować do struktury LN. Nasz protokół sugeruje objętość wstrzyknięcia wynoszącą 10 μl u myszy, chociaż inne badania wykazały większe objętości wstrzyknięć, co najmniej tak wysokie, jak 20 μl.13 Jednak bezpośrednie dostarczanie szczepionek za pośrednictwem iniekcji i.LN. pozwala na znaczne oszczędzanie dawki, więc funkcja tych szczepionek generalnie nie powinna być ograniczona przez ograniczenia objętościowe.
Jak już wspomniano, zmiana właściwości fizycznych cząstek (tj. rozmiaru) jest skutecznym mechanizmem zmiany szlaku lub wyników indukowanych przez biomateriały i ładunki zamknięte w tkance LN. Protokół odparowywania emulsji/rozpuszczalnika można łatwo zmodyfikować w celu zmiany właściwości fizycznych lub chemicznych, takich jak ładunek powierzchniowy lub funkcjonalność, oraz szybkość biodegradacji/uwalniania ładunku23,24. Na przykład kinetykę uwalniania można dostroić za pomocą alternatywnych kompozycji polimerowych, a funkcję powierzchni można zmienić za pomocą zmodyfikowanych kompozycji lipidowych lub poli(alkoholu winylowego). Ładunek załadowany cząstkami może być łatwo manipulowany tak, aby zawierał różne antygeny lub adiuwanty dla docelowych patogenów. Zaletą takiego podejścia jest połączenie dostaw i.LN. z lokalnym, kontrolowanym uwalnianiem ładunku z biomateriałów. Ta synergia tworzy platformę, którą można wykorzystać do skutecznego generowania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych przy użyciu minimalnych dawek i przy zmniejszonych niespecyficznych/ogólnoustrojowych skutkach ubocznych.
Oświadczenia
Koszty produkcji i opłaty za dostęp do tych artykułów były częściowo sponsorowane przez HORIBA, Ltd.
Podziękowania
Ta praca została częściowo sfinansowana przez fundację PhRMA oraz nagrodę Research and Scholar Award od University of Maryland, College Park. Dziękujemy prof. Darrellowi Irvine'owi za wsparcie wstępnych prac prowadzonych w ramach realizacji projektu "Inżynieria in situ mikrośrodowiska węzłów chłonnych poprzez dowęzłowe wstrzykiwanie cząstek polimeru uwalniającego adiuwant". 5
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml zapasu w chloroformie |
| 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000] sól amonowa (DSPE-PEG)Avanti | Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml zapas w chloroformie |
| Sól chlorku 1,2-dioleoilo-3-trimetyloamonu-propanu (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml zapas w chloroformie |
| Kwas polimlekowo-koglikolowy (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Laktyd: Glikolid (50:50). MW 30 000-60 000 |
| Dichlorometan (DCM) | VWR | BDH1113 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Nair | Nair | ||
| Evans Niebieski barwnik znacznikowy | VWR | AAA16774-09 | |
| U-100 BD Ultra-Fine Krótkie strzykawki insulinowe, 31 G 5/16 w igle | Igły jednorazowe VWR | BD328418 | |
| BD Medical, 21 g, 1,5 igłowe | BD305167 | ||
| VWR z końcówką BD Luer-Lok, BD Medical, 1 ml | Sitka do komórek VWR | BD309628 | |
| Falcon, sterylne, Corning, 40 i mikro; | m VWR | 21008-949 | |
| Vybrant DiD Roztwór do znakowania komórek | Invitrogen | V-22887 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres 6,00 i mikro; m | Polysciences | 17149 | |
| Fluoresbrite YG Mikrosfery 0,05 i mikro; m | Polysciences | 17156 | |
| Albumina jaja kurzego, oczyszczona | LS003056 | biochemiczna | |
| Worthington Procesor ultradźwiękowy Q125 Qsonica Q125 | Qsonica | Q125 | średnicy 1/8 cala |
| Homogenizator cyfrowy Ultra-Turrax T 25 | IKA | YO-04739-22 | Element dyspergujący 10 G |
| Mikroskop fluorescencyjny | Olympus | IX-83 | |
| Laserowy analizator rozkładu wielkości cząstek dyfrakcyjny | Horiba | LA-950 | W zestawie szklana komórka frakcyjna w stylu kuwety |
| Profesjonalne maszynki do strzyżenia orzechów ziemnych 8685 | Wahl |
Bibliografia
- Swartz, M. A., Hirosue, S., Hubbell, J. A. Engineering Approaches to Immunotherapy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Adamina, M., et al. Intranodal immunization with a vaccinia virus encoding multiple antigenic epitopes and costimulatory molecules in metastatic melanoma. Mol. Ther. 18, 651-659 (2010).
- Ribas, A., et al. Intra-Lymph Node Prime-Boost Vaccination against Melan A and Tyrosinase for the Treatment of Metastatic Melanoma: Results of a Phase 1. Clinical Trial. Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).
- Senti, G., et al. Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).
- Jewell, C. M., Lopez, S. C. B., Irvine, D. J. In situ engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injection of adjuvant-releasing polymer particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15745-15750 (2011).
- Johansen, P., et al. Antigen kinetics determines immune reactivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat. Rev. Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Irvine, D. J., Jewell, C. M. Ch. 132. Comprehensive Biomaterials. Ducheyne, P., et al. , (2011).
- Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering Nano- and Microparticles to Tune Immunity. Adv. Mater. 24, 3724-3746 (2012).
- Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Tissue Eng. Part A. 14, 734-735 (2008).
- Bershteyn, A., et al. Polymer-supported lipid shells, onions, and flowers. Soft Matter. 4, 1787-1791 (2008).
- Johansen, P., et al. Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity. Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).
- Mohanan, D., et al. Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems. J. Controlled Release. 147, 342-349 (2010).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J. Immunol. Methods. 332, 170-174 (2008).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J. Vis. Exp. , 1743(2010).
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice. J. Vis. Exp. e265. , 265(2007).
- Salmon, H., et al. Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes. J. Vis. Exp. , 3054(2011).
- Donaldson, J. G. in Current Protocols in Immunology: Immunofluorescence Staining. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hofman, F. in Current Protocols in Immunology: Immunohistochemistry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. in Current Protocols in Immunology: Preparation of Cells and Reagents for Flow Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Sharrow, S. O. in Current Protocols in Immunology: Overview of Flow Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Sharrow, S. O. in Current Protocols in Immunology: Analysis of Flow Cytometry Data. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Anderson, J. M., Shive, M. S. Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres. Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J. Controlled Release. 161, 505-522 (2012).
Przedruki i uprawnienia
