Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

13.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50985

⸱

18 lutego 2014

 ,  ,  , 
1Fondazione Filarete, 2Department of Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan, 3Neuroscience Institute, National Research Council (CNR), 4Department of Health Science, "Magna Graecia" University of Catanzaro

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Streszczenie

Lipidy i białka w komórkach eukariotycznych są stale wymieniane między przedziałami komórkowymi, chociaż zachowują one swój charakterystyczny skład i funkcje pomimo intensywnego ruchu molekularnego między organellami. Techniki opisane w tym artykule są skutecznymi metodami badania ruchliwości i transportu białek i lipidów in vivo oraz w ich środowisku fizjologicznym. Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) i utrata fluorescencji w fotowybielaniu (FLIP) są szeroko stosowanymi technikami obrazowania żywych komórek do badania transportu wewnątrzkomórkowego przez szlak egzoendocytarny, ciągłości między organellami lub podprzedziałami, tworzenia kompleksów białkowych i lokalizacji białek w mikrodomenach lipidowych, z których wszystkie można zaobserwować w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Ograniczenia tych podejść wynikają głównie z zastosowania fluorescencyjnych białek fuzyjnych, a ich potencjalne wady obejmują sztuczną nadekspresję w komórkach oraz możliwość różnic w fałdowaniu i lokalizacji białek znakowanych i natywnych. Wreszcie, ponieważ granica rozdzielczości mikroskopii optycznej (około 200 nm) nie pozwala na badanie drobnej struktury ER lub specyficznych podprzedziałów, które mogą powstawać w komórkach pod wpływem stresu (tj. niedotlenienie, podawanie leków, nadekspresja transbłonowych białek rezydujących w ER) lub w warunkach patologicznych, łączymy obrazowanie żywych komórek hodowanych transfekowanych z analizami ultrastrukturalnymi opartymi na transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Wprowadzenie

Odkrycie białka zielonej fluorescencji (GFP) i jego wariantów spektralnych, a także równoległy rozwój mikroskopii fluorescencyjnej, otworzyły zupełnie nowe możliwości badania zachowania białek w komórkach. Techniki takie jak odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) i utrata fluorescencji w fotowybielaniu (FLIP), które są możliwe dzięki wewnętrznej zdolności fluoroforów do gaszenia ich fluorescencji pod intensywnym oświetleniem, opierają się na konfokalnym obrazowaniu żywych komórek i zastosowaniu transfekowanych fluorescencyjnych białek fuzyjnych1-3. Są one szeroko stosowane do oceny nie tylko lokalizacji białek, ale także ich ruchliwości i transportu pęcherzykowego, co może ujawnić ważne wskazówki dotyczące ich funkcji4.

Unikalną cechą komórek eukariotycznych jest obecność wewnątrzkomórkowych kompartmentów, które mają specyficzny skład lipidów i białek. Chociaż organelle są fizycznie izolowane, muszą komunikować się ze sobą i dzielić składniki molekularne, aby utrzymać homeostazę komórkową. Szlak wydzielniczy gwarantuje, że białka i lipidy zsyntetyzowane w ER docierają do właściwego miejsca docelowego, w którym pełnią swoją funkcję. Organelle wewnątrzkomórkowe mogą być również połączone dynamicznymi miejscami kontaktu, które umożliwiają bezpośrednią wymianę cząsteczek (lipidów) między przedziałami. Co więcej, wiele białek musi składać się w duże kompleksy heteromeryczne lub wiązać się z określonymi gatunkami lipidów (tratwy lipidowe/mikrodomeny), aby stać się funkcjonalnie aktywnymi lub zostać przetransportowanymi do miejsca docelowego. Wszystkie te aspekty biologiczne mają ogromny wpływ na właściwości kinetyczne białek i dlatego mogą być odpowiednio badane za pomocą technik opisanych poniżej.

Nasza grupa szeroko korzystała z FRAP i FLIP w połączeniu z mikroskopią elektronową w celu zbadania architektury ER i jego różnych poddomen. Ostry dyżur jest pierwszą stacją szlaku wydzielniczego i odgrywa kluczową rolę w sortowaniu białek i lipidów5. Jest to wysoce dynamiczna organella, której odrębne subdomeny odzwierciedlają jej wiele różnych funkcji (tj. biosyntezę i transport białek i lipidów, fałdowanie białek, magazynowanie i uwalnianie Ca2+ oraz metabolizm ksenobiotyków). Jednakże, chociaż są one morfologicznie, przestrzennie i funkcjonalnie różne, domeny te są ze sobą ciągłe, a ich względna obfitość może być modyfikowana w komórkach w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Najbardziej znanymi i zwykle przestrzennie oddzielonymi domenami ER są otoczka jądrowa oraz gładka i szorstka ER; jednak my i inni wykazaliśmy, że w różnych typach komórek i tkankach w warunkach fizjologicznych istnieją struktury ER o bardziej skomplikowanej architekturze i trójwymiarowej organizacji, które mogą być również indukowane za pomocą stresujących bodźców, takich jak niedotlenienie, podawanie leków lub nadmierna ekspresja białek transbłonowychrezydujących w ER 2,6 (i odniesienia w nich).

Ostatnio wykazaliśmy również obecność takich struktur w modelach komórkowych chorób ludzkich1,7. Pochodzące z ułożonych cystern gładkiego ER, otrzymały zbiorczą nazwę zorganizowanej gładkiej retikulum endoplazmatycznego (OSER) w 2003roku 6, chociaż są również znane jako karmellae, blaszki i krystaloidy ER na podstawie ich architektury, która, podobnie jak ich rozmiar, może się różnić. Po transfekcji komórek GFP połączonym z regionem cytozolowym białek rezydujących w ogonie (TA) ER (dEGFP-ER), słabo dimeryzująca tendencja GFP w trans dramatycznie zmienia organizację i strukturę ER. Eksperymenty FRAP i FLIP wykazały, że dEGFP-ER może swobodnie dyfundować w obrębie OSER, a fakt, że przemieszcza się z siatkowatego ER do OSER i odwrotnie wskazuje, że agregaty są ciągłe z otaczającym je siatkowatym ER. Analiza ultrastrukturalna pozwoliła nam skorelować dane fluorescencyjne ze szczegółowym opisem architektury i organizacji OSER na poziomie nanoskali: OSER zawsze składają się ze stosów sparowanych cystern gładkiego ER, ale mogą mieć różne formy organizacji przestrzennej, takie jak regularnie ułożone sinusoidalne układy lub okółki, lub sześciokątne "krystaloidalne" układy rurowe. Te przegrupowania prowadzą do morfologii sześciennej8 , które, ponieważ zostały znalezione w komórkach w warunkach fizjologicznych9 i po stresach, takich jak niedotlenienie10, leczenie farmakologiczne11 i rak9 , mogą mieć znaczny potencjał jako markery ultrastrukturalne.

Po tej pierwszej demonstracji z użyciem białek fuzyjnych GFP, użyliśmy eksperymentów obrazowych do analizy proliferacji domen ER w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne12, oceny tendencji białek fluorescencyjnych do oligomeryzacji w komórkach13 oraz do zbadania roli zmutowanego, połączonego z ALS białka TA w tworzeniu wewnątrzkomórkowych agregatów pochodzenia ER, które mogą być istotne dla jego patogenności1,8. Sugeruje się, że tworzenie agregatów wewnątrzkomórkowych (co występuje w wielu chorobach neurodegeneracyjnych14) może być mechanizmem ochronnym zaprojektowanym w celu zapobiegania interakcjom między toksycznymi zmutowanymi białkami a otaczającymi składnikami komórkowymi15.

Poniżej znajduje się opis kombinacji metod mikroskopii optycznej i elektronowej do badania konstrukcji, których C-końcowe domeny hydrofobowe są wstawiane do błony ER, oraz analiza ich dynamicznego zachowania i wpływu ich nadmiernej ekspresji na architekturę domeny ER w hodowanych komórkach (zobacz Rysunek 1 dla schematu blokowego protokołu eksperymentalnego).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Plazmid, hodowla komórkowa i transfekcja z białkami fluorescencyjnymi ER

  1. Plazmid użyty w tym badaniu składa się ze wzmocnionej wersji GFP połączonej na jego końcu C z regionem ogonowym izoformy ER szczurzego cytochromu b (5) (w skrócie b (5)) za pomocą sekwencji łącznikowej. Obszar ogonowy zawiera całą sekwencję (Pro94-Asp134), która pozostaje związana z błoną po rozszczepieniu trypsyny natywnego b (5), w tym 17-reszta TMD (domena transbłonowa), otoczona sekwencjami polarnymi w górę i w dół (UPS i DPS). Łącznik składa się z epitopu myc, po którym następuje [(Gly)4Ser]3, a całe cDNA jest wprowadzane do miejsc Hind3-Xba1 wektora ekspresji ssaków pCDNA3. Szczegóły budowy tego plazmidu zostały opisane w poprzedniej publikacji, w której określa się go jako GFP-ER16.
  2. Hoduj komórki COS-7 w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 10% CO2 .
  3. Transfekcja. Płytka 3 x 105 komórek na okrągłym szklanym szkiełku nakrywkowym w płytce 6-dołkowej, a następnego dnia transfekcja za pomocą systemu JetPEI zgodnie z opisem producenta. Należy pamiętać, że optymalny stosunek JetPEI/DNA został przetestowany w celu ustalenia maksymalnej wydajności transfekcji w zależności od użytego plazmidu i linii komórkowej: w naszym przypadku stosunek JetPEI:DNA wynoszący 2:1 prowadzi do 70-80% wydajności transfekcji.

2. Fluorescencyjna skaningowa mikroskopia konfokalna na żywo

  1. Obrazowanie żywych komórek. Umieścić szkiełko nakrywkowe, na którym wysiano transfekowane komórki, do stalowej komory hodowlanej dla szkiełek nakrywkowych o średnicy 24 mm, wypełnionej DMEM bez czerwieni fenolowej, uzupełnionej 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1% pióra/paciorkowca, 25 mM HEPES, 50 μg/ml cykloheksymidu i 1:100 OxyFluor, aby zapobiec fotowybielaniu próbek. Mikroskop konfokalny SP5 wyposażony w inkubator CO2 z kontrolowaną temperaturą (37 °C i 5% CO2 ) jest używany do eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek, przy czym dGFP-ER jest wizualizowany za pomocą lasera 488 nm i filtra emisyjnego pasma 525/50.
  2. Odzysk fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP). Narysuj obszar zainteresowania (ROI), odpowiadający strukturze OSER, i wybiel go za pomocą 20 iteracji i kombinacji laserów 488 nm (100% lasera argonowego o mocy 30 mW, co odpowiada 5,5-6 μW w próbce) i 405 nm (60% lasera diodowego 405 o mocy 30 mW, co odpowiada 11,6 μW w próbce), które: Z naszego doświadczenia wynika, że prowadzi to do skutecznego i szybkiego fotowybielania.
  3. Zapisz odzyskiwanie fluorescencji w wybielonych ROI, wykonując pojedynczą klatkę co 10 sekund przez 10 minut (czas piksela = 1,61 μs/px).
  4. Utrata fluorescencji w fotowybielaniu (FLIP). Narysuj ROI odpowiadający strukturze OSER i wybiel zgodnie z powyższym opisem. Wybielanie jest powtarzane co 30 sekund, a obrazy po wybielaniu są rejestrowane co 10 sekund przez 30 minut (czas piksela = 1,61 μs/px).
  5. Analiza FRAP i FLIP. Wszystkie obrazy są analizowane za pomocą oprogramowania ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html). W eksperymentach FRAP odzysk fluorescencji wybielonego ROI jest mierzony w czasie i normalizowany do całkowitej fluorescencji bielonej komórki, która jest zawsze sprawdzana, czy jest stała w czasie.
  6. W przypadku eksperymentów FLIP narysuj ROI na zewnątrz wybielonego OSER i pokrywając całą komórkę. Zmierz jego intensywność fluorescencji w czasie i znormalizuj do poziomów fluorescencji ROI narysowanego na niebielonej komórce, aby skorygować spadek fluorescencji spowodowany samym obrazowaniem.
  7. We wszystkich eksperymentach odjęto sygnał tła (określony w obszarze poza komórkami) od intensywności fluorescencji ROI. Na koniec wykreśl wyniki za pomocą oprogramowania GraphPad Prism.

3. Analiza ultrastrukturalna za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Biorąc pod uwagę toksyczność wielu odczynników, wszystkie procedury powinny być przeprowadzane w odpowiednim labradorze i rękawiczkach pod wyciągiem.

  1. Po wyjęciu szkiełka nakrywkowego z płytki Petriego, utrwalić pozostałe komórki wyhodowane na dnie szalki jako monowarstwę za pomocą przefiltrowanego 2% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylowym o pH 7,4 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Zeskrobać komórki za pomocą skrobaka teflonowego i przenieść je do probówek Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. Granulować komórki przez odwirowanie przy 9 000 g przez 10 minut. Usunąć sklarowany osad, dodać świeży utrwalacz i pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.
  3. Przemyć granulki buforem, a następnie utrwalić roztworem 1% tetratlenku osmu w buforze kakodylowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Spłucz wodą MilliQ i zaplamij en bloc 1% octanem uranylu w wodzie destylowanej przez 20-60 minut.
  5. Odwodnić próbki w zwiększających się seriach etanolu (70%, 80%, 90%, 100% i 100% przez 10 minut każda) i krótko przemyć dwukrotnie w tlenku propylenu (15 minut każda).
  6. Próbki należy infiltrować w mieszaninie tlenku propylenu + Epon (1:1) (od 2 godzin do nocy).
  7. Zatopić w żywicy epoksydowej Epon utwardzonej w temperaturze 60 °C przez co najmniej 24 godziny.
  8. Ręcznie przycięte bloki żywicy należy podzielić na sekcje za pomocą ultramikrotomu LEICA UC6 wyposażonego w nóż diamentowy 45°, aby uzyskać skrawki o grubości 60-70 nm. Zbierz sekcje na miedzianych siatkach o siatce 300
    9. .
  9. Zabarwić skrawki na siatce nasyconym roztworem octanu uranylu (20 min) i cytrynianu ołowiu (7 min), dokładnie umyć kratki, zanurzając je w przefiltrowanej wodzie podwójnie destylowanej i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
  10. Poplamione siatki są obserwowane za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego TECNAI G2, a obrazy są rejestrowane za pomocą zamontowanej od dołu kamery CCD przy różnych powiększeniach końcowych (zwykle w zakresie od 6 000 do 39 000X).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 2 przedstawia przykład badania FRAP w celu określenia mobilności białek. Mobilność białka dEGFP-ER jest wykazana przez szybki powrót fluorescencji po fotowybielaniu w wybielonych OSERs. Do analizy ilościowej czas połowiczny oraz frakcja mobilna zostały wyznaczone z danych pomiarowych poprzez dopasowanie następującego równania monoeksponencjalnego:

F(t) = Fpost + (Frec-Fpost)(1-e-t/τ)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokoły i podejścia do obrazowania opisane w tym artykule zostały wykorzystane do zbadania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych TA znajdujących się w ER żywych komórek. Przeanalizowaliśmy również wpływ nadekspresji tych białek na architekturę tego przedziału subkomórkowego za pomocą analiz ultrastrukturalnych.

Połączenie obrazowania konfokalnego żywych komórek i mikroskopii elektronowej jest bardzo skutecznym sposobem badania dynamicznych właściwości białek i mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni Fondazione Filarete za pomoc i wsparcie w publikacji tego artykułu. Chcielibyśmy również podziękować Centro Europeo di Nanomedicina za korzystanie z transmisyjnego mikroskopu elektronowego TECNAI G2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM)Invitrogen41966029
Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) bez czerwieni fenolowejInvitrogen31053028
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Invitrogen10270106
Pen/StrepInvitrogen15140-122
L-glutamina 200 mM roztwórInvitrogen25030-024
jetPEIPolyplus TransfekcjaPP10110
OxyFluorOxyrase Inc.OF-0005
Aldehyd glutarowy klasy ISigma AldrichG5882
Kakodylan sodu TrójwodnySigma AldrichC0250
Tetratlenek osmu 4% roztwórMikroskopia elektronowa Science19150
Octan uranylu DihydratSigma Aldrich73943lekko radioaktywny
tlenek propylenuSigma-Aldrich82320
Zestaw pożywki do osadzania EPONSigma-Aldrich45359-1EA-F
Mikroskopia elektronowacytrynianu ołowiu 17800
Wirówka stołowaEppendorf5415 D
Spektralny mikroskop konfokalny Leica MicrosystemsTCS SP5
CO2 System inkubacji klatkowej mikroskopu OkoLab
Ultramicrotome Leica MicrosystemsUC6
Nóż diamentowy DiatomeUltra 45 °
Transmisyjny mikroskop elektronowy FEITecnai G2
Oprogramowanie GraphPad Prism GraphPadSoftware, Inc
Stalowa komora hodowlana do szkiełka nakrywkowego 24 mmNarzędzia biologiczneCSC-25
Siatki mikroskopii elektronowejMikroskopia elektronowa ScienceG300Cu
Science

Bibliografia

  1. Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
  2. Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).
  3. Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).
  4. Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).
  5. Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. Bi-directional protein transport between the ER and. 20, 87-123 (2004).
  6. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).
  7. Papiani, G., et al. Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome. J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).
  8. Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization. J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).
  9. Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. The dynamic ER: experimental approaches and current questions. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).
  10. Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 12, 327-342 (1994).
  11. Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital. Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).
  12. Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells. J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).
  13. Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13, 643-649 (2012).
  14. Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres. J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).
  15. Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
  16. Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases. EMBO J. 27, 336-349 (2008).
  17. Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways. Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).
  18. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).
  19. Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  20. Michida, T., et al. Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats. Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fotobielenie z regeneracją fluorescencjifotobielenie z utratą fluorescencjiobrazowanie żywych komórektransmisyjna mikroskopia elektronowamikroskopia konfokalnabiałka z tagiem GFPtransport białek i lipidówsubkompartymenty organellianaliza ultrastrukturalna
Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.