Artykuł metodologiczny

Nukleofekcja neuroblastów gryzoni do badania migracji neuroblastów in vitro

DOI:

10.3791/50989

⸱

12 listopada 2013

 ,  ,  ,  , 
1Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, 2MRC Centre for Developmental Neurobiology, King's College London

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migracja neuroblastów jest kluczowym krokiem w neurogenezie poporodowej. Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do zbadania roli kandydatów na regulatory migracji neuroblastów poprzez zastosowanie nukleofekcji DNA/małego RNA spinki do włosów (shRNA) oraz testu migracji 3D z neuroblastami wyizolowanymi z pourodzeniowego strumienia migracyjnego rostralnego gryzoni

.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strefa podkomorowa (SVZ) znajdująca się w bocznej ścianie komór bocznych odgrywa fundamentalną rolę w neurogenezie dorosłych. W tym ograniczonym obszarze mózgu nerwowe komórki macierzyste namnażają się i stale generują neuroblasty, które migrują stycznie w łańcuchach wzdłuż rostralnego strumienia migracyjnego (RMS), aby dotrzeć do opuszki węchowej (OB). Po dotarciu do OB neuroblasty przełączają się na migrację promieniową, a następnie różnicują się w dojrzałe neurony zdolne do włączenia się do istniejącej wcześniej sieci neuronalnej. Prawidłowa migracja neuroblastów jest podstawowym etapem neurogenezy, zapewniającym prawidłowe dojrzewanie funkcjonalne nowo narodzonych neuronów. Biorąc pod uwagę zdolność neuroblastów pochodzących z SVZ do celowania w uszkodzone obszary mózgu, badanie mechanizmów wewnątrzkomórkowych leżących u podstaw ich ruchliwości nie tylko poprawi zrozumienie neurogenezy, ale może również przyczynić się do rozwoju strategii neuroregeneracyjnych.

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół transfekcji pierwotnych neuroblastów RMS RMS gryzoni oraz analizę ich ruchliwości za pomocą testu migracji 3D in vitro, podsumowującego ich sposób migracji obserwowany in vivo. Zarówno neuroblasty szczurów, jak i myszy mogą być szybko i skutecznie transfekowane poprzez nukleofekcję plazmidowym DNA, małym spinką do włosów (sh)RNA lub krótkimi interferującymi oligonukleotydami (si)RNA ukierunkowanymi na interesujące geny. Aby przeanalizować migrację, komórki nukleofektyczne są ponownie agregowane w "wiszące krople", a następnie osadzane w trójwymiarowej matrycy. Nukleofekcja sama w sobie nie upośledza znacząco migracji neuroblastów. Leczenie farmakologiczne neuroblastów nukleofektycznych i reagregowanych można również przeprowadzić w celu zbadania roli szlaków sygnałowych zaangażowanych w migrację neuroblastów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W mózgu ssaków po urodzeniu generowanie nowych neuronów (neurogeneza) zachodzi przez całe życie i jest ograniczone do dwóch nisz neurogennych: strefy podkomorowej (SVZ) komór bocznych i strefy podziarnistej zakrętu zębatego hipokampa1. Kilka ostatnich badań wykazało ważną rolę neurogenezy dorosłych w ułatwianiu zadań związanych z uczeniem się i pamięcią2,3. Co więcej, dowody na proliferację i rekrutację neuronalnych komórek progenitorowych po uszkodzeniu mózgu4-7 zwiększają możliwość farmakologicznej aktywacji neurogenezy w naprawie neuronów.

Neurogeneza poporodowa jest ściśle regulowana we wszystkich swoich fazach, które obejmują proliferację neuronalnych progenitorów, migrację, różnicowanie, przeżycie i końcową integrację synaptyczną nowo narodzonych neuronów8. Progenitory neuronalne (neuroblasty) pochodzące z komórek macierzystych SVZ migrują na dużą odległość przez rostralny strumień migracyjny (RMS) w kierunku opuszki węchowej (OB), gdzie dojrzewają do funkcjonalnych neuronów9. Neuroblasty wędrowne są przeważnie jednobiegunowe, z wydłużonym ciałem komórkowym przedłużającym pojedynczy proces wiodący. Komórki te poruszają się w łańcuchach w sposób zbiorowy, przesuwając się po sobie10. Migracja jest kluczowym krokiem dla późniejszego dojrzewania progenitorów pochodzących z SVZ do funkcjonalnych neuronów11 i jest kontrolowana przez wiele czynników i cząsteczki prowadzące, w tym: polisjalilowaną cząsteczkę adhezyjną komórek nerwowych (PSA-NCAM)12, Efryny13, integryny14, szczeliny15, czynniki wzrostu16 i neuroprzekaźniki17, jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw tego procesu nie są w pełni poznane. Badanie wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych regulujących migrację neuroblastów nie tylko pozwoli lepiej zrozumieć neurogenezę dorosłych, ale także przyczyni się do opracowania nowych podejść terapeutycznych wspomagających naprawę mózgu.

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół do badania roli kandydatów na regulatory migracji neuroblastów in vitro za pomocą nukleofekcji i testu migracji 3D. Nukleofekcja to technika transfekcji komórek oparta na ulepszonej metodzie elektroporacji. Specyficzny dla typu komórki prąd elektryczny i roztwór nukleofekcji umożliwiają przenoszenie makrocząsteczek polianionowych, takich jak wektory DNA i shRNA oraz oligonukleotydy siRNA, bezpośrednio do jądra komórkowego i umożliwiają transfekcję wolno dzielących się lub mitotycznie nieaktywnych komórek, takich jak neurony embrionalne i ssacze18. Metoda ta jest szybka, stosunkowo łatwa do wykonania i skutkuje wysoce powtarzalną transfekcją szerokiego zakresu typów komórek, w tym pierwotnych neuroblastów i neuronów19-21.

Dysocjacja tkanki RMS pozwala na izolację migrujących neuroblastów, które mogą być z powodzeniem nukleofektowane za pomocą wektorów DNA/shRNA lub oligonukleotydów siRNA ukierunkowanych na interesujące geny. Po nukleofekcji neuroblasty są ponownie agregowane w wiszące krople, a następnie osadzane w trójwymiarowej matrycy Matrigel. Warunki te umożliwiają neuroblastom migrację z agregatów komórkowych w celu podsumowania trybu migracji obserwowanego in vivo, zapewniając w ten sposób doskonały system modelowy do badania szlaków sygnałowych zaangażowanych w migrację neuroblastów i oceny wpływu leczenia farmakologicznego na ruchliwość tych komórek.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta procedura jest zgodna z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (Animal Scientific Procedures Act, 1986). Naukowcy powinni postępować zgodnie z wytycznymi ustanowionymi i zatwierdzonymi przez ich instytucje i krajowe organizacje regulacyjne zajmujące się zwierzętami.

1. Sekcja i dysocjacja neuroblastów RMS szczura

  1. Przygotuj roztwory wymagane do rozwarstwienia i dysocjacji RMS:

Podłoże do preparacji (100 ml)
Zbilansowany roztwór soli Hank's (HBSS) - 98,5 ml
5 M HEPES pH 7,4 - 0,5 ml
Penicylina-streptomycyna (10 000 jednostek/ml i 10 000 μg/ml) - 1 ml

Medium dysocjacyjne (2 ml)
HBSS - 1.760 ml
10x Trypsyna (2,5%) - 200 μl
DNAse1 (1 mg/ml) - 40 μl

Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) + 10% Płodowa Surowica Cielęca (FCS) (40 ml)
DMEM - 36 ml
FCS - 4 ml

Kompletne medium (12 ml)

Pożywka neuropodstawowa - 11,46 ml
B27 Suplement - 250 μl
L-Glutamina (200 mM) - 125 μl
Glukoza (45%) - 165 μl

2. Przefiltrować-wysterylizować DMEM + 10% FCS i całe podłoże i wstępnie zrównoważyć je w inkubatorze o temperaturze 37 °C / 5% CO2 .

  1. Rozwarstwienie
    1. Poświęć miot szczurów P6-P7 (około 12 młodych) przez zwichnięcie szyjki macicy i odetnij głowę nożyczkami.
    2. Wykonaj przednio-tylne nacięcie w skórze wzdłuż szwu środkowego strzałkowego od nosa do móżdżku za pomocą ostrza skalpela. Zdejmij skórę i powtórz to samo nacięcie wzdłuż czaszki.
    3. Delikatnie usuń płaty czaszki za pomocą kleszczy i ostrożnie usuń mózg szpatułką, uważając, aby uwzględnić opuszki węchowe.
    4. Wytnij najbardziej ogonową jedną trzecią mózgu i wyrzuć ją.
    5. Pokrój tkankę mózgową na plastry koronalne o grubości 1,4 mm za pomocą rozdrabniacza do tkanek.
    6. Umieść plastry w naczyniach zawierających zimne podłoże do preparacji i ostrożnie oddziel je za pomocą igły.
    7. RMS pojawia się jako trójkątny, półprzezroczysty obszar w środku sekcji położniczej i jako mały, okrągły obszar w bardziej ogonowych wycinkach mózgu. Wytnij RMS z każdego plasterka nożem mikrochirurgicznym, uważając, aby nie uwzględnić otaczającej tkanki. U szczeniąt szczurów P7 zwykle ~8 najbardziej rostralnych plasterków (w tym OB) zawiera RMS.
    8. Zebrać fragmenty RMS za pomocą plastikowej pipety Pasteura i umieścić je w małym naczyniu zawierającym zimne podłoże preparacyjne na lodzie.
    9. Po zakończeniu sekcji przenieś fragmenty RMS do probówki o pojemności 15 ml za pomocą plastikowej pipety. Pozostaw fragmenty, aby osiadły na dnie tuby.
  2. Dysocjacji
    1. Zastąp pożywkę do rozwarstwiania 2 ml pożywki dysocjującej.
    2. Rozcierać fragmenty RMS, delikatnie pipetując zawiesinę fragmentów w górę i w dół około 10 razy za pomocą pipety P1000.
    3. Pozostaw probówkę z fragmentami tkanek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 2 minuty.
    4. Ponownie odpipetować roztwór 10 razy i upewnić się, że fragmenty uległy dysocjacji (zawiesina powinna stać się mętna).
    5. Dezaktywuj trypsynę, dodając 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM + 10% FCS.
    6. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 433 x g przez 5 minut.
    7. W międzyczasie należy podwielokrotnić wymaganą ilość siRNA/DNA do probówek Eppendorfa (zwykle 3-5 μg DNA/shRNA lub 5-9 μg oligo siRNA na nukleofekcję, jednak ilość DNA/siRNA może wymagać optymalizacji).
    8. Usunąć nadmiar pożywki i ponownie zawiesić osad komórkowy przez delikatne pipetowanie w 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM + 10% FCS.
    9. Wykonaj zliczanie komórek. Spodziewaj się ~1 x 106 komórek na mózg szczeniaka szczura. Do każdej nukleofekcji wymagane jest minimum 2,5 x 106 komórek, podczas gdy optymalne wyniki osiąga się przy użyciu 3-4 x 106 komórek na nukleofekcję.
    10. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 433 x g przez 5 minut. Upewnij się, że usunąłeś jak najwięcej pożywki.

2. Nucleofekcja

  1. Natychmiast ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze jądra neuronu szczura (lub myszy, jeśli używa się komórek myszy) uprzednio inkubowanym w temperaturze pokojowej. Użyj 100 μl na nukleofekcję. Uwaga: zazwyczaj miot szczurów składający się z 12 szczeniąt wystarcza do wykonania 4 zarodków, a miot myszy (12 młodych) wystarcza do wykonania 2 zarodków.
  2. Przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej do każdej probówki Eppendorfa zawierającej siRNA/DNA i delikatnie wymieszać 2-3 razy pipetując pipetą P200.
  3. Dodaj próbkę (zawiesinę komórka-DNA/siRNA) na dno kuwety nukleofekcyjnej, uważając, aby uniknąć pęcherzyków.
  4. Nucleofect za pomocą programu G-013 (dla komórek szczura) lub O-005 (dla komórek myszy). Jedna nukleofekcja trwa około 5 sekund.
  5. Szybko dodać 1 ml wstępnie podgrzanego DMEM + 10% FCS do nukleofektowanej próbki.
  6. Powtórzyć kroki 2.4 i 2.5 dla wszystkich pozostałych próbek. Uwaga: dla uzyskania optymalnych rezultatów cała procedura nukleofekcji nie powinna trwać dłużej niż 5 minut.
  7. Przenieść każdą próbkę do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM + 10% FCS za pomocą plastikowej pipety dostarczonej przez zestaw do nukleofekcji. Unikaj przenoszenia jakichkolwiek zanieczyszczeń komórkowych do tuby.
  8. Odwirować próbki o masie 433 x g przez 5 minut.
  9. Ostrożnie usunąć nadmiar pożywki i ponownie zawiesić osad w 25-30 μl wstępnie podgrzanego DMEM + 10% FCS za pomocą pipety P20. Nie należy używać więcej niż 30 μl podłoża.
  10. Odpipetować zawiesinę w postaci kropli na wewnętrzną stronę pokrywki naczynia p35.
  11. Odwrócić pokrywkę nad szalką p35 zawierającą 2 ml kompletnej pożywki (patrz również rysunek 1).
  12. Pozostawić w inkubatorze (37 °C/5% CO2 ) na co najmniej 5 godzin do 7 godzin. Dłuższy czas inkubacji pozwala na lepszą ponowną agregację klastrów komórek.
  13. Przenieś wiszące krople z pokrywki do kompletnego podłoża w naczyniu za pomocą pipety P1000 z odciętą końcówką.
  14. Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 24 godziny w przypadku nukleofekcji DNA i 48 godzin w przypadku nukleofekcji siRNA/shRNA.

3. Osadzanie

  1. Przygotować kompletną pożywkę (25 ml) i wstępnie ją zrównoważyć w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez kilka godzin.
  2. Z zamrażarki w temperaturze -80 °C wyjąć zamrożone cząstki matrycy membrany podstawnej i rozmrozić na lodzie w chłodni.
  3. Dla każdego nukleofekcji przygotuj 6-centymetrowe naczynie zawierające do ośmiu sterylnych warg nakrywkowych o średnicy 13 mm.
  4. Umieść naczynia na pojemniku na lód pokrytym folią spożywczą. Ważne jest, aby szkiełka nakrywkowe były chłodne, aby zapobiec zastyganiu matrycy podczas procedury zatapiania.
  5. Aby utrzymać wilgotność, umieść pasek wilgotnej tkanki w 15-centymetrowym naczyniu, które posłuży do przechowywania do trzech 6-centymetrowych naczyń zawierających osadzone neuroblasty.
  6. Dodaj kompletną pożywkę do rozmrożonej matrycy w stosunku 1:3. Na przykład, zmieszać 40 μl kompletnej pożywki ze 120 μl matrycy przez pipetowanie. Taka ilość matrycy jest wystarczająca do zatopienia kruszywa na ośmiu szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm.
  7. Przenieść zgrupowane komórki do probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 433 x g przez 5 minut.
  8. Usunąć nadmiar pożywki i ponownie zawiesić osad w 10 μl kompletnego podłoża.
  9. Umieścić 2 μl zawiesiny agregatu komórkowego na każdym sterylnym szkiełku nakrywkowym i dodać 18 μl mieszaniny matrycy/kompletnego podłoża. Za pomocą końcówki pipety rozprowadź matrycę na całym szkiełku nakrywkowym.
  10. Natychmiast umieścić 6 cm naczynie zawierające szkiełka nakrywkowe w naczyniu o średnicy 15 cm i pozostawić w inkubatorze (37°C / 5% CO2) na 15-20 minut. Gdy matryca stwardnieje, delikatnie dodaj 5 ml kompletnej pożywki do każdego 6-centymetrowego naczynia, uważając, aby docisnąć pływające szkiełko nakrywkowe końcówką pipety.
  11. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C / 5% CO2 , aby umożliwić neuroblastom migrację z agregatów komórkowych.

4. 3D Test migracji

  1. Przygotuj roztwory wymagane do barwienia immunologicznego.
    1. Przygotować roztwór blokowy:
      Roztwór blokowy kóz (50 ml)
      Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) - 5 ml
      Kozia surowica - 7,5 ml
      10% Triton X-100 - 1,5 ml
      BSA - 50 mg
      H2O - 36 ml
    2. Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotuj roztwór utrwalający:
      Roztwór utrwalający (100 ml)
      Paraformaldehyd (PFA) - 4 g UWAGA: PFA należy zawsze przechowywać pod kapturem
      Sacharoza - 20 g (opcjonalnie)
      PBS do 100 ml
    4. Na gorącej płycie i przy ciągłym mieszaniu rozpuścić PFA w 80 ml PBS utrzymywanym w temperaturze 65 °C.
    5. Po rozpuszczeniu PFA dodać 20 g sacharozy.
    6. Dostosuj pH do 7,4 (zwykle dodając ~60 μl 1 M NaOH na 100 ml roztworu).
    7. Doprowadzić do całkowitej objętości 100 ml za pomocą PBS.
  2. Barwienie immunologiczne
    1. Umieść szkiełka nakrywkowe w płytce 24-dołkowej.
    2. Spłukać szkiełka nakrywkowe za pomocą PBS 2x.
    3. Utrwalić agregaty neuroblastów RMS roztworem utrwalającym przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Spłucz szkiełka nakrywkowe PBS 3x (5 min/pranie - na bujanej platformie).
    5. Blokuj przez 30-60 minut roztworem bloku kozy.
    6. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze bloku koziego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. (W razie potrzeby do roztworu przeciwciała pierwszorzędowego można również dodać fluorescencyjną falloidynę (1:400) i barwnik Hoechsta (1:10 000) w celu uwidocznienia nitkowatej aktyny i jąder).
    7. Spłucz szkiełka nakrywkowe PBS 3x (5 min/pranie).
    8. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w roztworze bloku koziego i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    9. Spłucz szkiełka nakrywkowe PBS 3x (5 min/pranie)
    10. Szkiełka nakrywkowe zamontować za pomocą fluorescencyjnego podłoża montażowego i pozostawić do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej.
  3. Analiza migracji
    1. Rejestruj obrazy stałych agregatów neuroblastów RMS za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu obiektywu 10X. Dołączanie paska skali do przykładowego obrazu.
    2. Aby skonfigurować skalę do oceny ilościowej, zmierz pasek skali na obrazie, wybierając narzędzie "Linia prosta" na pasku narzędzi ImageJ.
    3. Wybierz opcję "Analizuj" i kliknij "ustaw skalę".
    4. W oknie skali ustaw "znaną odległość" i zaznacz pole "globalne", aby zachować te same ustawienia dla wszystkich pomiarów.
    5. Użyj narzędzia "Linia segmentowana" na pasku narzędzi ImageJ, aby zmierzyć odległość od krawędzi agregatu do najdalej migrującego neuroblastu w 6 różnych sektorach wokół całego agregatu (Rysunek 3B). Do analizy należy brać pod uwagę tylko izolowane agregacje.
    6. Obliczyć średnią odległość migracji na podstawie 6 wartości uzyskanych dla każdego agregatu.
    7. Zmierz 10–20 wartości zagregowanych dla każdego warunku w każdym niezależnym eksperymencie i zbierz wyniki z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Zawsze dołączaj kontrolę nukleofekcji (np. GFP lub kontrolną sh/siRNA).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuroblasty mogą być z powodzeniem wyizolowane z wypreparowanej tkanki RMS (Rysunek 1A) i osadzone w trójwymiarowej matrycy. Komórki wyizolowane z pourodzeniowego RMS szczura lub myszy są immunododatnie dla migrujących markerów neuroblastów, takich jak podwójna kortyna (DCX), tubulina βIII lub PSA-NCAM (ryc. 1B-C).

Zdysocjowane neuroblasty mogą być efektywnie nukleektowane DNA (np. plazmidem kodującym GFP, Rysunek 2) lub plazmidami shRNA (Rysunek 4) w celu osiągnięcia zubożenia białka, co można ocenić za pomocą analizy western blot (Rysunek 4B) lub immunofluorescencji (nie pokazano).

Komórki z plazmidami kodującymi GFP migrują promieniście na zewnątrz zreagregowanych klastrów neuroblastów (Rysunek 3A). Kwantyfikacja względnej odległości migracji 24 godziny po osadzeniu (Figura 3B) nie wykazuje różnicy w migracji między komórkami GFP-dodatnimi a komórkami GFP-ujemnymi, nienukleofektowanymi (Figura 3C), co wskazuje, że nukleofekcja per se nie zakłóca migracji. Nie ma również istotnej różnicy w zakresie migracji między neuroblastami nukleektowymi a neuroblastami migrującymi bezpośrednio z eksplantatów RMS (dane nie pokazane).

figure-results-1
Rysunek 1. Rozwarstwienie neuroblastów RMS. (A) Schematyczne przedstawienie rozwarstwienia neuroblastów RMS. Szczegółowy opis znajduje się w tekście. (B) Izolowane szczurze komórki RMS są immunododatnie dla wędrownych producentów neuroblastów DCX i tubuliny βlll. Bar, 20 μm. (C) Komórki migrujące z eksplantatów RMS myszy wyrażają migrujące markery neuroblastów DCX i PSA-NCAM. Bar, 20 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

figure-results-2
Rysunek 2. Nukleofekcja neuroblastów myszy. Zdysocjowane mysie neuroblasty RMS zostały zanukleofekowane pMAX-GFP, ponownie zagregowane, osadzone w trójwymiarowej matrycy i pozostawione do migracji przez 6 godzin. Neuroblasty migrujące z ponownie zagregowanego klastra komórkowego (góra, obrazy kontrastu fazowego) wykazują wysoką wydajność transfekcji (dolne, obrazy kanału GFP). Panele prawej kolumny pokazują obrazy w większym powiększeniu, odpowiadające wstawkom podświetlonym w panelach lewej kolumny. Pręty, 20 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

figure-results-3
Rysunek 3. 3D Test migracji. (A) Neuroblasty szczurów zostały zanuklekowane pMAX-GFP (GFP) lub pCAG-IRES-EGFP22 (EV), ponownie zagregowane, osadzone w matrycy i pozostawione do migracji na 24 godziny. Komórki zostały następnie utrwalone i wybarwione immunologicznie pod kątem GFP (kolor zielony) i tubuliny βIII (kolor czerwony). Bar, 50 μm. (B) Pomiar odległości migracji za pomocą ImageJ. Ponownie zagregowany klaster komórek jest podzielony na 6 równych sektorów. Odległość między krawędzią klastra (linia przerywana) a najdalszą migrowaną komórką jest mierzona dla każdego sektora. (C) Kwantyfikacja względnej odległości migrowanej przez komórki nukleofektyczne (GFP-dodatnie) i kontrolne, nienukleofektyczne (GFP-ujemne). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

figure-results-4
Rysunek 4. Monitorowanie migracji neuroblastów po nukleofekcji shRNA. (A) Neuroblasty szczurów zostały zanukleekowane kontrolnym wektorem shRNA (pCA-b-EGFPm5 Silencer 3, który również wyraża EGFP23) lub tym samym wektorem zawierającym shRNA ukierunkowanego na faszynę, białko wiązki aktyny24. Komórki zostały ponownie zagregowane w ciągu 48 godzin, osadzone w macierzy i pozostawione do migracji na 24 godziny. Agregaty zostały następnie utrwalone i wybarwione immunologicznie dla GFP (kolor zielony) i tubuliny βIII (kolor czerwony). Bar, 50 μm. (B) Efektywny zubożenie faszyny można wykryć 50 godzin po nukleofekcji shRNA za pomocą analizy western blot. Aktyna jest tutaj pokazana jako kontrola obciążenia. (C) Ilościowa analiza względnej odległości migracji wykazująca, że zubożenie faszyny istotnie upośledza migrację neuroblastów (średnia ± SEM; **p<0,01; n=3 niezależne eksperymenty). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migracja neuroblastów wzdłuż RMS do ostatecznej lokalizacji w OB jest podstawowym krokiem w neurogenezie poporodowej. Jednak mechanizmy molekularne kontrolujące ten złożony proces są dalekie od pełnego zrozumienia.

Opisana tutaj procedura eksperymentalna pozwala na badanie migracji neuroblastów in vitro. Dostosowaliśmy wcześniej opublikowany protokół izolacji neuroblastów RMS od myszy lub szczura we wczesnym okresie poporodowym25. Aby osiągnąć optymalne wyniki, ważne jest, aby opanować etap sekcji, ponieważ ważne jest, aby ograniczyć do minimum odstęp czasu między rozwarstwieniem a nukleofekcją. Po nukleofekcji neuroblasty mogą zostać ponownie zagregowane, osadzone w trójwymiarowej matrycy i pozostawione do migracji w ciągu 24 godzin. Alternatywnie, do celów innych niż migracja (np. immunofluorescencja lub analiza western blot), komórki można natychmiast po nukleofekcji posiać na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poliornityną/lamininą, gdzie przeżywają do 4-5 dni. Neuroblasty myszy i szczurów migrują w Matrigel w podobnym stopniu, jednak komórki myszy wydają się mieć silniejszą tendencję do migracji w łańcuchach niż komórki szczurów.

W zależności od celu badania, neuroblasty mogą być nukleofektowane różnymi plazmidami kodującymi białka fluorescencyjne lub białka typu dzikiego/zmutowanego. W celu uzyskania optymalnej ekspresji białek wysoce zalecane są plazmidy z promotorem CAG (promotor β-aktyny ze wzmacniaczem CMV i ogonem poli-A β-globiny)26 . Co więcej, oligonukleukleotydy siRNA lub plazmidy shRNA mogą być nukleekowane w celu powalenia celów będących przedmiotem zainteresowania. Efektywne zubożenie białek można uwidocznić za pomocą immunofluorescencji lub western blot (zwykle liza osadzonych agregatów od 1 szczeniaka szczura z 50 μl standardowego buforu do lizy).

Nucleofekcja jest stosunkowo prostą metodą transfekcji pierwotnych neuroblastów, stanowi łatwiejszą i szybszą alternatywę dla transfekcji za pośrednictwem wektora wirusowego i może osiągnąć wysoką (~ 70-80%) skuteczność transfekcji. Bardzo ważne jest, aby pracować szybko podczas procedury nukleofekcji, ponieważ pozostawienie neuroblastów w roztworze nukleofekcji przez dłuższy czas drastycznie zmniejsza żywotność komórek.

Średnia wydajność komórek z sekcji RMS jest stosunkowo niska dla myszy P7 (~5 x 105 komórek / mózg) w porównaniu ze szczurami P7 (~ 1 x 106 komórek / mózg) i co najmniej 3 x 106 komórek na jądro są wymagane do osiągnięcia transfekcji z ~ 50% wydajnością. Co więcej, neuroblasty szczurów wydają się być bardziej odporne na nukleofekcję w porównaniu z neuroblastami myszy. W związku z tym młode szczurów we wczesnym okresie pourodzeniowym (P6-P7) mogą stanowić wygodne źródło neuroblastów, biorąc również pod uwagę, że organizacja RMS szczurów i myszy jest niezwykle podobna27 i że zakres migracji neuroblastów szczurów i myszy in vitro jest również porównywalny. Zaleca się, aby nie przechowywać ponownie zagregowanych klastrów neuroblastów nukleofektycznych w zawiesinie dłużej niż 48 godzin, aby uniknąć nieprawidłowego wpływu na morfologię i migrację komórek (nasze niepublikowane obserwacje).

Opisany tutaj test 3D może być wykorzystany do ilościowego określenia migracji neuroblastów w ustalonym punkcie czasowym po osadzeniu w matrycy (np. 24 godziny). W analizie można wykorzystać agregaty o różnych rozmiarach, ponieważ nie ma istotnej korelacji między wielkością agregatów a odległością migracji (nasze niepublikowane obserwacje). Aby zobrazować i dalej badać dynamikę migracji neuroblastów, można zastosować obrazowanie poklatkowe. Zaleca się przeprowadzenie analizy migracji w odstępie 24 godzin po osadzeniu, ponieważ prędkość neuroblastów wydaje się drastycznie zmniejszać w dłuższych punktach czasowych (nasze niepublikowane obserwacje).

Istnieją pewne ograniczenia tego protokołu. Po pierwsze, nukleofekcja może być do tej pory stosowana do wczesnych neuroblastów gryzoni po urodzeniu, podczas gdy zakażenie wektorami wirusowymi pozostaje najbardziej efektywną metodą transfekcji dla dorosłych neuroblastów28. Po drugie, test migracji in vitro nie odtwarza w pełni złożonej architektury RMS obserwowanej in vivo. Rzeczywiście, chociaż neuroblasty zachowują zdolność do migracji w podobny sposób jak ich odpowiedniki in vivo , w opisanej tutaj konfiguracji eksperymentalnej brakuje im interakcji z innymi składnikami RMS, takimi jak astrocyty i naczynia krwionośne, które również przyczyniają się do regulacji ich ruchliwości9,29,30. Problem ten może zostać rozwiązany w przyszłości poprzez optymalizację trójwymiarowych systemów modeli kokultury.

Podsumowując, połączenie nukleofekcji z testem migracji 3D stanowi cenne narzędzie do lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw migracji neuroblastów. Ta eksperymentalna procedura zapewnia wstępną, szybką i stosunkowo prostą metodę oceny roli potencjalnych regulatorów migracji neuroblastów, która może być dalej zwalidowana za pomocą innych podejść, takich jak elektroporacja poporodowa in vivo i obrazowanie poklatkowe kultur wycinków mózgu28,31,32.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta została sfinansowana z grantu Wellcome Trust Project Grant przyznanego P.D. i G.L. (089236/Z/09/Z). S.G. S.G. była wspierana przez stypendium doktoranckie Rady ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych. Dziękujemy Matthieu Vermerenowi za miły dar w postaci wektora shRNA oraz Jennifer Shieh za cenne porady dotyczące nukleofekcji neuroblastów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Invitrogen Life Technologies14175129
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Penicylina-StreptomycynaInvitrogen Life Technologies15140-122
2,5% Trypsyna-EDTA (10x)Gibco15090-046sklep 200 &mikro; l podwielokrotności przy -20 °
C DNAzy I Fiolka (D2)WorthingtonLK003170≥ 1 000 jednostek na fiolkę; Przechowuj 50 i mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
Dulbecco Zmodyfikowane podłoże orła (DMEM)Gibco11960-044
Surowica cielęca płodu (FCS)HyclonSH3007902
Podłoże neurobazalneGibco21103-049
Suplement B27Invitrogen Life Technologies17504044
L-glutamina (200 mM)Invitrogen Life Technologies25030-081
Roztwór D-(+)-glukozy (45%)Sigma-AldrichG8769
Matrigel Matrigel Podstawna membrana membranowa, Zredukowany czynnik wzrostu (GFR), Bez czerwieni fenolowej, 10 ml, bez LDEVBD Biosciences356231przygotować 120 &mikro; l podwielokrotności przy 4 & stopniach; C, a następnie przechowywać w temperaturze -80 & deg; C
PFASigma-Aldrich441242
SacharozaBDH102745C
Surowica koziaSigma-Aldrich69023
Triton X-100VWR International Ltd.306324N
BSAFisher ChemicalBPE9701-100
Fluorescencyjne medium montażowe DakoS3023
Zestaw nukleofekcji neuronów szczurzychLonzaVPG-1003
Zestaw nuklepekcji neuronów myszyLonzaVPG-1001
Nóż mikrochirurgicznyAngiotech7516
McIlwain rozdrabniacz tkanekMickle Laboratory Engineering Company
Nucleofector IILonza

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ming, G. L., Song, H. J. Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Alonso, M., et al. Activation of adult-born neurons facilitates learning and and memory. Nat. Neurosci. 15, 897-U127 (2012).
  3. Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
  4. Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
  5. Jin, K. L., et al. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13198-13202 (2006).
  6. Kim, Y., Szele, F. G. Activation of subventricular zone stem cells after neuronal injury. Cell Tissue Res. 331, 337-345 (2008).
  7. Massouh, M., Saghatelyan, A. De-routing neuronal precursors in the adult brain to sites of injury: Role of the vasculature. Neuropharmacology. 58, 877-883 (2010).
  8. Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
  9. Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-Distance Neuronal Migration in the Adult Mammalian Brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
  10. Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
  11. Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal Neuronal Migration Changes the Fate of Developing Neurons in the Postnatal Olfactory Bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
  12. Battista, D., Rutishauser, U. Removal of Polysialic Acid Triggers Dispersion of Subventricularly Derived Neuroblasts into Surrounding CNS Tissues. J .Neurosci. 30, 3995-4003 (2010).
  13. Conover, J. C., et al. Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone. Nat. Neurosci. 3, 1091-1097 (2000).
  14. Mobley, A. K., McCarty, J. H. beta 8 Integrin is Essential for Neuroblast Migration in the Rostral Migratory Stream. Glia. 59, 1579-1587 (2011).
  15. Nguyen-Ba-Charvet, K. T., et al. Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 24, 1497-1506 (2004).
  16. Garzotto, D., Giacobini, P., Crepaldi, T., Fasolo, A., De Marchis, S. Hepatocyte growth factor regulates migration of olfactory interneuron precursors in the rostral migratory stream through Met-Grb2 coupling. J. Neurosci. 28, 5901-5909 (2008).
  17. Platel, J. C., Stamboulian, S., Nguyen, I., Bordey, A. Neurotransmitter signaling in postnatal neurogenesis: The first leg. Brain Res. Rev. 63, 60-71 (2010).
  18. Dityateva, G., et al. Rapid and efficient electroporation-based gene transfer into primary dissociated neurons. J. Neurosci. Meth. 130, 65-73 (2003).
  19. Shieh, J. C., Schaar, B. T., Srinivasan, K., Brodsky, F. M., McConnell, S. K. Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons. PloS One. 6, (2011).
  20. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. J. Vis. Exp. , e2373(2011).
  21. Gartner, A., Collin, L., Lalli, G. Nucleofection of primary neurons. Method Enzymol. 406 (06), 374-388 (2006).
  22. Causeret, F., et al. The p21-Activated Kinase Is Required for Neuronal Migration in the Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. 19, 861-875 (2009).
  23. Bron, R., Eickholt, B. J., Vermeren, M., Fragale, N., Cohen, J. Functional knockdown of neuropilin-1 in the developing chick nervous system by siRNA hairpins phenocopies genetic ablation in the mouse. Dev. Dynam. 230, 299-308 (2004).
  24. Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
  25. Ward, M., Rao, Y. Investigations of neuronal migration in the central nervous system. Methods Mol. Biol. 294, 137-156 (2005).
  26. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient Selection for High-Expression Transfectants with a Novel Eukaryotic Vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  27. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487, 407-427 (2005).
  28. Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain. J. Vis. Exp. , e4061(2012).
  29. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
  30. Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood Vessels Form a Migratory Scaffold in the Rostral Migratory Stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
  31. Sonego, M., Ya, Z., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain. J. Vis. Exp. , in press (2013).
  32. Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, Neonatal Subventricular Zone Electroporation. J. Vis. Exp. , e50197(2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika nukleofekcjirostralny strumie migracyjnytest 3D in vitrometoda wisz cej kroplianaliza immunofluorescencyjnaobrazowanie time lapsetransfekcja plazmidowego DNAdostarczanie shRNA i siRNAanaliza Western blot

Powiązane artykuły