Artykuł metodologiczny

Identyfikacja subpopulacji mysich erytroblastów wzbogaconej w zdarzenia wyłuszczenia za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania

DOI:

10.3791/50990

⸱

6 czerwca 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer and Blood Diseases Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, 2IBM

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje nowatorską metodę identyfikacji populacji enukleujących się ortochromatycznych erytroblastów za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej, zapewniając wizualizację procesu enukleacji erytroblastów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erytropoeza u ssaków kończy się dramatycznym procesem enukleacji, który prowadzi do powstania retikulocytów. Mechanizm enukleacji nie został jeszcze w pełni wyjaśniony. Częstym problemem napotykanym podczas badania lokalizacji kluczowych białek i struktur w obrębie wyłuszczających erytroblastów za pomocą mikroskopii jest trudność w zaobserwowaniu wystarczającej liczby komórek ulegających enukleacji. Opracowaliśmy nowatorski protokół analizy wykorzystujący wieloparametrowe szybkie obrazowanie komórek w przepływie (Multi-Spectral Imaging Flow Cytometry), metodę łączącą mikroskopię immunofluorescencyjną z cytometrią przepływową, W celu skutecznej identyfikacji znacznej liczby zdarzeń enukleacyjnych, pozwala to na uzyskanie pomiarów i przeprowadzenie analizy statystycznej.

Najpierw opisujemy tutaj dwie metody hodowli erytropoezy in vitro używane w celu synchronizacji mysich erytroblastów i zwiększenia prawdopodobieństwa wychwytywania enukleacji w czasie oceny. Następnie szczegółowo opisujemy barwienie erytroblastów po utrwaleniu i przepuszczalności, aby zbadać lokalizację białek wewnątrzkomórkowych lub tratw lipidowych podczas enukleacji za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania. Wraz z rozmiarem i Barwienie DNA / Ter119, które służy do identyfikacji erytroblastów ortochromatycznych, wykorzystujemy parametry "proporcji" komórki w kanale jasnego pola, który pomaga w rozpoznawaniu wydłużonych komórek i "centroid delta XY Ter119 / Draq5", który umożliwia identyfikację zdarzeń komórkowych, w których centrum barwienia Ter119 (powstający retikulocyt) jest daleko od centrum barwienia Draq5 (jądro poddawane ekstruzji), wskazując w ten sposób na komórkę, która ma się wyłuszczyć. Podzbiór ortochromatycznej populacji erytroblastów o wysokim środku ciężkości delta i niskim współczynniku kształtu jest wysoce wzbogacony w komórkach wyłuszczających.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Końcowe różnicowanie w linii erytroidalnej u ssaków kończy się dramatycznym procesem enukleacji, przez który ortochromatyczny erytroblast wydala swoje otoczone błoną jądro (pyrenocyt)1, tworząc retikulocyt2. Dokładny mechanizm tego procesu, który jest również etapem ograniczającym szybkość udanej produkcji czerwonych krwinek in vitro na dużą skalę, nie jest jeszcze w pełni wyjaśniony. Lokalizacja kluczowych białek i struktur w wyłuszczeniu erytroblastów opiera się na zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej3-5. Ten żmudny proces zazwyczaj prowadzi do identyfikacji ograniczonej liczby zdarzeń enukleacji i nie zawsze pozwala na miarodajną analizę statystyczną. Rozwijając metodę identyfikacji erytroblastów opisaną wcześniej przez McGratha i wsp.6, opracowaliśmy nowatorskie podejście do identyfikacji i badania zdarzeń enukleacji za pomocą obrazowania wielospektralnego Cytometria przepływowa (wieloparametrowe obrazowanie komórek o dużej prędkości w przepływie, metoda łącząca mikroskopię fluorescencyjną z cytometrią przepływową)7, która może zapewnić wystarczającą liczbę obserwacji do uzyskania pomiarów i przeprowadzenia analizy statystycznej.

Tutaj opisujemy pierwsze dwie metody hodowli erytropoezy in vitro używane w celu synchronizacji erytroblastów i zwiększenia prawdopodobieństwa wychwytywania enukleacji w momencie oceny. Następnie szczegółowo opisujemy barwienie erytroblastów po utrwaleniu i przepuszczalności w celu zbadania lokalizacji białek wewnątrzkomórkowych lub tratw lipidowych podczas enukleacji za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania.

Próbki są badane na obrazowym cytometrze przepływowym, a zebrane komórki są odpowiednio bramkowane, aby zidentyfikować erytroblasty ortochromatyczne6. Ortochromatyczne erytroblasty są następnie analizowane na podstawie ich współczynnika kształtu, mierzonego w obrazowaniu w jasnym polu, w porównaniu z ich wartością parametru centroidu delta XY Ter119-DNA, który definiuje się jako odległość między środkami obszarów barwionych odpowiednio dla Ter119 i DNA. Populacja komórek o niskim współczynniku kształtu i centroidzie XY Ter119 / DNA o wysokim współczynniku delta jest wysoce wzbogacona w komórki wyłuszczające. Wykorzystanie erytroblastów typu dzikiego (WT) w porównaniu z erytroblastami z warunkową delecją Rac1 za pośrednictwem Mx-Cre na Rac2-/- lub połączonym Rac2-/-; Rac3-/- tło genetyczne i ten nowatorski protokół analizy wielospektralnej obrazowania cytometrii przepływowej, niedawno wykazaliśmy, że enukleacja przypomina cytokinezę asymetryczną i że tworzenie pierścienia aktomiozyny regulowanego częściowo przez GTPazy Rac jest ważne dla progresji enukleacji7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Długoterminowa hodowla erytropoezy in vitro (Ex vivo Erythroid Differentiation Culture Protocol by Giarratana et al.8, zmodyfikowane i przystosowane do komórek myszy)

To jest 3-etapowy długoterminowy protokół erytropoezy in vitro. W pierwszym etapie (dni 0-4) 2 x 105 komórek/ml umieszcza się w pożywce wzrostowej erytroblastów uzupełnionej czynnikiem komórek macierzystych (SCF), interleukiną-3 (IL-3) i erytropoetyną (Epo). W drugim etapie (5-6 dni) komórki są ponownie zawieszane w stężeniu 2 x 105 komórek/ml i hodowane na przylegających komórkach zrębu (MS5) w świeżej pożywce wzrostowej erytroblastów uzupełnionej tylko Epo. W trzecim etapie (dni 7-9) komórki są hodowane na warstwie komórek MS-5 w świeżej pożywce wzrostowej erytroblastów bez cytokin aż do enukleacji (Figura 1A).

Wszystkie protokoły dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Centrum Medycznego Szpitala Dziecięcego w Cincinnati.

  1. Pobieranie kości i izolacja komórek szpiku kostnego o niskiej gęstości
    1. Dodać 2 ml sterylnego IMDM zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przechowywać na lodzie.
    2. Poddaj eutanazji 2-6-miesięczną mysz C57/BL6 typu dzikiego (wraz z myszą genetycznie ukierunkowaną lub bez niej) zgodnie z zatwierdzonym przez instytucję protokołem (np. wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy).
    3. Odizoluj kości miednicy, kości udowe i piszczelowe obu nóg za pomocą kleszczy i skalpela, dodaj je do probówki zawierającej IMDM+2% FBS i trzymaj na lodzie.
    4. Dodaj 1 ml IMDM + 2% FBS do sterylnej probówki do cytometrii przepływowej i przepłucz kości za pomocą kleszczy i strzykawki tuberkulinowej z igłą 25 G x 5/8 ". Kilkakrotnie delikatnie przepłukać IMDM+2% FBS przez kości (odsysając ~500 μl z zawiesiny komórkowej i ponownie przepłukując ją przez kość) i zebrać komórki szpiku kostnego do probówki cytometrii przepływowej. Zaczerwienienie jest zakończone, gdy kości wydają się białe.
    5. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 μm umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Przemyj sitko komórkowe IMDM+2% FBS i za pomocą tego samego podłoża dostosuj końcową objętość zawiesiny komórek do 5 ml.
    6. Przygotować komórki szpiku kostnego o niskiej gęstości (LDBM) przez wirowanie w gradionym gradieniu gęstości: ostrożnie ułożyć 5 ml zawiesiny komórek na 5 ml pożywki do separacji komórek o gradiacji gęstości 1,083 g/ml w probówce o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 750 x g przez 25 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez hamowania/przy niskim przyspieszeniu.
    7. Przenieść supernatant (wszystko do około 2 ml oznaczenia 15 ml probówki w celu uzyskania kożlichowej sierści) do nowej 15-mililitrowej probówki i wykonać jeszcze jedno płukanie za pomocą IMDM+2% FBS przy 525 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Odessać supernatant i poddać lizie pozostałe krwinki czerwone (RBC), zawieszając osad w 3 ml buforu do lizy RBC na 5 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli na ostatnim etapie wymagana jest większa czystość erytroblastów (np. do badań biochemicznych), na tym etapie należy oczyścić komórki LDBM do komórek Linneg przez separację magnetyczną.
  2. Protokół hodowli różnicowania erytroidalnego ex vivo, rozpoczynający się od komórek LDBM lub Linneg (Figura 1A)
    1. Dodać 7 ml IMDM+2% FBS, wirować w 525 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić granulowane komórki w 2 ml pożywki wzrostowej erytroblastów (EGM), składającej się z:
      a. StemPro-34 pożywka, zawierająca
      b. 2,6% średni suplement StemPro-34,
      c. 20% BIT-9500,
      d. 900 ng / ml siarczanu żelazawego,
      E. 90 ng / ml azotanu żelaza,
      f. 100 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny, 2 mM L-glutaminy
      g. 10-6 M hydrokortyzon
      h. i świeżo dodane cytokiny:
      i) 100 ng/ml SCF,
      ii) 5 ng/ml IL-3 i
      iii) 3 j.m./ml Epo.
    2. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub ręcznie pod mikroskopem za pomocą hemocytometru.
    3. Płytkę umieścić na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej o stężeniu 5 x 105 komórek/basenik do końcowej objętości 2,5 ml w EGM (2 x 105 komórek LDBM/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C (uważa się, że jest to dzień #0 hodowli).
    4. Zmienić pożywkę, zasysając 1,5 ml supernatantu, wirując z prędkością 525 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, ponownie zawieszając w 1,5 ml świeżej pożywki zawierającej wszystkie 3 cytokiny i dodając z powrotem do studzienek codziennie w dniach #2, 3, 4, w celu optymalizacji fazy proliferacyjnej. W dniu 3 usuń wszystkie komórki, policz i podziel na odpowiednią liczbę dołków, aby utrzymać stężenie komórek studzienki ~2 x 105 komórek/ml. Utrzymuj kulturę w temperaturze 37 °C/5% CO2 .
    5. W dniu 4 umieść komórki MS5 (mysia linia komórek zrębowych) w studzienkach nowej 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Pożywka do hodowli komórkowych MS5 to α-MEM zawierająca 20% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy.
    6. W 5 dniu policz liczbę komórek (teraz znacznie wzbogaconych w erytroblasty) w każdym dołku oryginalnej płytki hodowlanej za pomocą automatycznego licznika komórek lub ręcznie pod mikroskopem za pomocą hemocytometru.
    7. Wyjąć wszystkie komórki z każdej studzienki i przenieść do stożkowych probówek o pojemności 15 ml, odwirować przy 525 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i rozpuścić granulki ze świeżym EGM zawierającym tylko Epo (3 j.m./ml) do stężenia 2 x 105 komórek/ml.
    8. Odessać supernatant z dołków, w których komórki MS-5 zostały posiane poprzedniego dnia (ukierunkowane na 70-80% konfluencji w czasie kohodowli) i dodać komórki erytroidalne w tych studzienkach do EGM zawierających tylko Epo (chociaż nie jest to ich pożywka z wyboru, komórki MS-5 dobrze przeżywają w EGM przez kilka dni).
    9. Zmień podłoże, dodając świeże EPO w dniu #6.
    10. Zmień pożywkę w dniu #7, używając EGM bez dodatku cytokin. W dniach od 7 do 9 codziennie badaj próbki do enukleacji za pomocą cytometrii przepływowej po barwieniu anty-Ter119 i Syto-16 i przystąp do barwienia próbek do obrazowania wielospektralnego cytometrii przepływowej (jak opisano w sekcji 3).
      nuta: Przed posiewem oraz w 2., 4., 6. i 7. dniu hodowli należy monitorować hodowane komórki pod kątem wzbogacenia i różnicowania erytroblastów za pomocą cytometrii przepływowej, oceniając markery powierzchniowe CD44 i Ter119 w zależności od wielkości (FSC). 9 Alternatywnie można również użyć CD71, Ter119 i FSC10,11.

2. Test szybkiej enukleacji, zgodnie z protokołem opisanym przez Yoshida et al.12 z modyfikacjami (Rysunek 1B)

  1. Indukcja erytropoezy stresowej i przygotowanie komórek zrębu do hodowli erytropoezy in vitro
    1. Znieczulić 2-6-miesięczną mysz C57/BL6 typu dzikiego zgodnie z wytycznymi IACUC (np. roztworem izofluranu). Upewnij się, że mysz została odpowiednio znieczulona, sprawdzając, czy nie ma odruchowych reakcji na delikatne uszczypnięcie tylnej łapy i czy podczas zabiegu nie ma regularnych oddechów. Użyj maści okulistycznej weterynarza na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
    2. Wywołać erytropoezę stresową poprzez krwawienie z ogona do końcowej objętości 500 μl. Za pomocą strzykawki z insuliną wstrzyknąć dootrzewnowo równą objętość soli fizjologicznej, aby zapewnić płynną resuscytację zwierzęcia (przed wstrzyknięciem należy przytrzymać zwierzę w pozycji Trendelenburga i wstrzyknąć w dolną część brzucha, aby nie uszkodzić narządów wewnętrznych).
    3. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska kontroli motorycznej, na co wskazuje to, że zwierzę zaczyna poruszać się po klatce i jest w stanie stać i chodzić bez upadku. Mysz poddana flebotomii jest umieszczana w klatce bez innych myszy.
    4. Po 2 dniach płytki MS-5 w dołkach 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Inkubować komórki MS-5 w temperaturze 37 °C/5% CO2 w pożywce komórkowej MS5 (a-MEM zawierającej 20% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy) w celu uzyskania 70-80% zlewu w dołkach płytkowych po 48 godzinach.
  2. Zbiór śledziony i przetwarzanie splenocytów
    1. Cztery dni (96 godzin) po indukcji erytropoezy stresowej należy poddać eutanazji wcześniej wykrwawioną mysz za pomocą protokołu zatwierdzonego przez IACUC (np. wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy).
    2. Zbierz śledzionę i umieść ją w stożkowej tubie o pojemności 15 ml zawierającej IMDM 2% FBS i trzymaj na lodzie.
    3. Po powrocie do laboratorium, w kapturze do hodowli tkankowej w sterylnych warunkach, odwróć probówkę zawierającą śledzionę na sitku do komórek o średnicy 40 μm umieszczonym na probówce o pojemności 50 ml. Rozdrobnić śledzionę za pomocą tłoka plastikowej strzykawki o pojemności 5 ml.
    4. Przemyć sitko komórkowe IMDM+2% FBS i za pomocą tego samego podłoża dostosować końcową objętość zawiesiny komórek do 5 ml.
    5. Ostrożnie ułóż 5 ml zawiesiny splenocytów na 5 ml pożywki do separacji komórek w gradiacji gęstości 1,083 g/ml w probówce o pojemności 15 ml i wiruj z prędkością 750 x g przez 25 minut w temperaturze pokojowej bez hamowania/niskiego przyspieszenia.
    6. Przenieść supernatant (roztwór do około 2 ml kreski w 15-ml probówce w celu uzyskania kożuchowego płaszcza) do nowej 15-mililitrowej probówki i wykonać jeszcze jedno płukanie IMDM+2% FBS przy 525 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Odessać supernatant i poddać lizie krwinki czerwone, zawieszając osad w 3 ml buforu do lizy RBC na 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Dodać 7 ml IMDM + 2% FBS do przemywania komórek oraz do rozcieńczania i neutralizowania buforu do lizy RBC i wirować w temperaturze 525 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Odessać supernatant i zawiesić granulowane komórki w 2 ml pożywki wzrostowej erytroblastów (EGM).
  3. Posiew izolowanych splenocytów o małej gęstości, wzbogaconych w erytroblasty, na tworzywie sztucznym (pierwszy etap szybkiej hodowli erytropoezy in vitro)
    1. Policz komórki na automatycznym liczniku komórek lub ręcznie za pomocą hemocytometru. Zwykle liczba komórek izolowanych na śledzionę na tym etapie wynosi ~15 x 106.
    2. Zawiesić komórki dalej w EGM zawierające cytokiny (w końcowych stężeniach): SCF 50 ng/ml, IL-3 5 ng/ml i Epo 2 U/ml.
    3. Płytka 1-5 x 106 komórek w końcowej objętości 1 ml/basenik (taka sama liczba komórek na basenik w zależności od całkowitej liczby komórek) na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej i inkubować O/N w temperaturze 37 °C/5% CO2 .
  4. Hodowla erytroblastów na komórkach MS5 (drugi etap szybkiej hodowli erytropoezy in vitro
    1. Odessać supernatant z plastikowej studzienki i podnieść komórki (wysoko wzbogacone w erytroblasty) poprzez dodanie 2 ml zimnego 10 mM EDTA w PBS przez 5 minut, na lodzie do każdej studzienki.
    2. Umieść komórki w świeżych probówkach, umyj raz w EGM (bez cytokin) i ponownie zawieś w tymże.
    3. Płytka 5 x 105-1 x 106 komórek w objętości 1-2 ml do każdego dołka pokrytego komórkami MS5 na płytce 24-dołkowej. Jeśli w eksperymencie stosowane są inhibitory farmakologiczne, dodaj je teraz w odpowiednich stężeniach.
    4. Inkubować przez 6 do 8 godzin (czas oparty na obserwacji mikroskopowej około 30%-40% enukleacji w nietraktowanej próbce WT). Wiązanie erytroblastów z komórkami MS-5 przyspiesza ich enukleację.
    5. Wyjmij komórki z każdej studzienki, dodając 2 ml zimnego PBS + 10 mM EDTA przez 5 minut na lodzie. Wraz z erytroblastami zostaną również pobrane komórki MS-5, ale można je później łatwo wykluczyć podczas analizy cytometrii przepływowej jako komórki FSChi Ter119-.
    6. Na tym etapie komórki można utrwalić i wybarwić do analizy za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego.

3. Barwienie erytroblastów w celu lokalizacji białek wewnątrzkomórkowych lub tratw lipidowych podczas enukleacji za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania

  1. Umyć komórki w PBS, wirować 525 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.
  2. Utrwal komórki poprzez ponowne zawieszenie granulek komórkowych w 500 μl 3,7% formaldehydu w PBS na 15 minut (czas utrwalania może się różnić w zależności od badanego antygenu) i delikatne pipetowanie.
  3. Przenieść do plastikowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Wirować na mikrowirówce stołowej 2 000 x g przez 20 sekund, odessać supernatant i wykonać jedno płukanie, dodając 500 μl PBS do każdej probówki i delikatnie pipetując.
  5. Wirować na mikrowirówce stołowej 2 000 x g przez 20 sekund, odsysać supernatant i trzymać probówki na lodzie przez co najmniej 15 minut. Etapy permeablacji 3,6-3,9 powinny być wykonane szybko i skutecznie, a po wirowaniu/aspiracji w temperaturze pokojowej granulki komórek należy natychmiast umieścić z powrotem na lodzie, aby komórki lepiej zachowały swoją integralność.
  6. Wyjmij roztwory acetonu z zamrażarki o temperaturze -20 °C i połóż na lodzie. Przepuszczalność komórek polega na ponownym zawieszeniu granulek komórkowych najpierw w 500 μl lodowatego 50% acetonu (1:1 z dH2O) i delikatnym pipetowaniu.
  7. Wirować na wirówce laboratoryjnej 2 000 x g przez 20 sekund, odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki komórkowe w 500 μl lodowatego 100% acetonu, delikatnie pipetując.
  8. Wirować na wirówce laboratoryjnej o masie 2 000 x g przez 20 sekund, odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki komórkowe w 500 μl lodowatego 50% acetonu, delikatnie pipetując.
  9. Wirować na mikrowirówce stołowej 2 000 x g przez 20 sekund, odessać supernatant i przemyć komórki raz w zimnym buforze FACS (PBS + 0,5% BSA) przez delikatne pipetowanie.
  10. Przygotuj koktajl znakujący z przeciwciałami lub markerami dla interesujących nas cząsteczek: 0,1 U/100 μl AF488-falloidyny do barwienia F-aktyną i 1 μl/100 μl Ter119-PECy7 do barwienia komórek erytroidalnych. Alternatywne lub dodatkowe barwienie można również wykonać przy użyciu przeciwciała AF-488-anty-β-tubuliny (1:50), podjednostki B sprzężonej z toksyną AF-594 do znakowania tratw lipidowych (1:200), przeciwciała pierwszorzędowego anty-pMRLC (Ser19) dla fosforylowanego łańcucha lekkiego regulatora miozyny (1:50), a następnie przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z anty-królikiem AF-488 (1:400) i pierwotnego przeciwciała królika anty-γ-tubuliny (1:100), a następnie przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z anty-królikiem AF-555 (1:300).
  11. Po aspiracji supernatantu ponownie zawiesić osady komórkowe w 100 μl koktajlu markerowego, delikatnie pipetować i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Przygotować bufor FACS zawierający 2,5 μM barwnika jądrowego Draq5.
  13. Umyć komórki w buforze FACS, odwirować na mikrowirówce stołowej 2 000 x g przez 20 sekund, odessać supernatant i ponownie zawiesić w 60 μl buforze FACS zawierającym Draq5.
  14. Uruchom próbki na obrazowym cytometrze przepływowym, aby zebrać co najmniej 10 000 zdarzeń na eksperyment, skompensuj pliki danych surowych zgodnie z poprzednio opublikowanymi13 i przeanalizuj wyniki, jak pokazano na rysunku 2, przy użyciu oprogramowania analitycznego specyficznego dla obrazowego cytometru przepływowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po pierwsze, komórki są analizowane na podstawie ich proporcji jasnego pola (stosunek długości ich osi mniejszej do głównej) oraz ich obszaru jasnego pola (wskazującego na ich rozmiar). Zdarzenia o wartości obszaru jasnego pola mniejszej niż 20 i wyższej niż 200 są w większości odpowiednio szczątkami i agregatami komórkowymi i są wyłączone z analizy (rysunek 2A). Pojedyncze komórki (bramka "R1") są następnie analizowane na podstawie ich wartości dla parametru Gradient RMS, który wskazuje ostrość obrazu. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach badania nad enukleacją erytroblastów nabierają coraz większego rozpędu, ponieważ jest to etap w hodowlach erytropoezy in vitro , który jest najtrudniejszy do efektywnego rozmnażania w celu osiągnięcia udanej produkcji czerwonych krwinek na dużą skalę ex vivo. Do niedawna badania nad enukleacją erytroblastów wykorzystywały głównie metody mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej. Metody mikroskopii fluorescencyjnej, Chociaż są pomocne w identyfikacji uczestniczących cząst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Rdzeniowi Cytometrii Przepływowej w Cincinnati oraz Richardowi Demarco, Sherree Friend i Scottowi Mordecai z Amnis Corporation (część EMD Milllipore) za fachowe wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez granty National Institutes of Health K08HL088126 i R01HL116352 (T.A.K.) oraz P30 DK090971 (Y.Z.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
&alfa; MEM pożywkaCellGro15-012-CV
Pożywka IMDMHyklon (Thermo Scientific)SH30228.01
Stempro-34 SFMGIBCO (Life Tech)10640
Stempro-34 Suplement odżywczyGIBCO (Life Tech)10641-025
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Atlanta Biologicals512450
BIT9500Stemcell Technologie09500
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Fisher ScientificBP-1600-100
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Hyklon (Thermo Scientific)SH30028.02
penicyliny/streptomycyny(Thermo Scientific)SV30010
L-glutaminy(Thermo Scientific)SH30590.01
Isothesia (Isoflurane)Butler-Schein029405
Histopaque 1,083 mg / mlSigma10831
BD Pharmlyse (bufor do lizy RBC)BD Biosciences555899
AcetonSigma-Aldrich534064
FormaldehydFisher ScientificBP 531-500
HydrokortyzonSigmaH4001
Czynnik komórek macierzystych (SCF)Peprotech250-03
Interleukina-3 (IL-3)Peprotech213-13
EPOGEN Epoetyna Alfa (Erytropoetyna, EPO)AMGENdostępne w aptece
Przeciwciało CD44-FITCBD Pharmingen553133
Przeciwciało CD71-FITCBD Pharmingen553266
Przeciwciało Ter119-PECy7BD Pharmingen557853
Phalloidin-AF488Invitrogen (Life Technologies)Przeciwciało A12379
i beta;-tubulina-AF488Cell Signaling#3623
przeciwciało anty-królicze AF488-drugorzędoweInvitrogen (Life Technologies)A11008
przeciwciało anty-królicze AF555-drugorzędoweInvitrogen (Life Technologie)A21428
AF594-podjednostka B toksynyInvitrogen (Life Technologies)C34777
przeciwciało pMRLC (Ser19)Sygnalizacja komórkowa# 3671
γ-tubulinaprzeciwciało SigmaT-3559
Syto16Invitrogen (Life Technologies)S7578
Draq5BiostatusDR50200
Siarczan żelazawySigmaF7002
Azotan żelazaSigmaF3002
EDTAFisher ScientificBP120500
probówki 15 mlBD Falcon352099
50 ml probówkiBD Falcon352098
płytki 6-dołkoweBD Falcon353046
24- płytki studzienkoweBD Falcon351147
Rurki przepływoweBD Falcon352008
Strzykawka tuberkulinowaBD309602
Strzykawka insulinowaBD329461
Igła strzykawkowa 25-G 5/8BD305122
Rurki przepływowe z nakrętkąBD352058
40-μ m Sitko do komórekBD Falcon352340
Skalpel (jednorazowy)Feather2975#21
FACS Canto Cytometr przepływowyBD
ImagestreamX Mark II Obrazowy cytometr przepływowyAMNIS (EMD Millipore)
w wersji 4.0 i nowszych.AMNIS (EMD Millipore)
Hemavet 950 Licznik komórekDrew ScientificCDC-9950-002
Inkubator NAPCO serii 8000WJThermo scientific
Wirówka Allegra X-15R BeckmanCoulter392932
Mini Mouse Wirówka stołowaDenvilleC0801
HyklonHyklon Oprogramowanie do eksploracji i analizy danych obrazowych (IDEAS)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
  2. Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
  3. Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
  4. Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
  5. Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
  6. McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
  7. Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
  8. Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  9. Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
  10. Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
  11. Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
  12. Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
  13. Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Enukleacja erytroblast wanaliza wsp czynnika proporcjipomiar odleg o ci mi dzy centroidamierytroblasty ortochromatycznebarwienie Ter119barwnik DNA Draq5erytropoeza in vitrofiksacja i permeabilizacja kom rek

Powiązane artykuły