Ultra-wysokiej częstotliwości ultrasonografia to potężne narzędzie do obrazowania na żywo do badania nieprawidłowości w pracy serca u małych zwierząt. Jego nieinwazyjność pozwala na utrzymanie stanu fizjologicznego zarodków. W tym artykule pokazujemy zastosowanie ultrasonografii w trybie M do pomiaru częstości akcji serca zarodków przy E18,5 w macicy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
W macicy Pomiar tętna u myszy za pomocą nieinwazyjnej echokardiografii w trybie m
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wrodzona wada serca (CHD) jest najczęstszą niezakaźną przyczyną śmierci przy urodzeniu. Częstość występowania choroby niedokrwiennej serca waha się od 4 do 50/1000 urodzeń (Regionalne szacunki chorób i urazów, Światowa Organizacja Zdrowia, 2004). Operacje, które często pogarszają jakość życia, są wymagane w celu skorygowania wad serca, przypominając nam o tym, jak ważne jest znalezienie przyczyn choroby niedokrwiennej serca. Zmutowane modele myszy i technologia obrazowania na żywo stały się niezbędnymi narzędziami do badania etiologii tej choroby. Chociaż zaawansowane metody pozwalają na obrazowanie na żywo nieprawidłowych serc w zarodkach, stany fizjologiczne i hemodynamiczne tych ostatnich są często zaburzone z powodu zabiegów chirurgicznych i/lub długotrwałych zabiegów. Nieinwazyjne obrazowanie ultrasonograficzne może być jednak stosowane bez chirurgicznego odsłaniania zarodków, zachowując w ten sposób ich fizjologię. W tym przypadku używamy prostego ultrasonografu w trybie M do oceny częstości akcji serca zarodków przy E18,5 w macicy. Wykrycie nieprawidłowego tętna jest rzeczywiście dobrym wskaźnikiem dysfunkcji serca, a tym samym stanowi pierwszy krok w identyfikacji wad rozwojowych, które mogą prowadzić do niewydolności serca.
Wprowadzenie
CHD jest najczęstszą niezakaźną przyczyną śmierci przy urodzeniu1. Często konieczne są liczne operacje w celu skorygowania wad strukturalnych u osób, których jakość życia może pozostać zagrożona1. U dzieci z chorobą niedokrwienną serca często rozwijają się zaburzenia neurologiczne, nawet jeśli nie przeszły operacji, co wskazuje na ważne konsekwencje dla rozwoju w życiu płodowym 2,3. Zarówno czynniki genetyczne, jak i środowiskowe, takie jak narażenie na wirusy lub chemikalia (alkohol) w czasie ciąży, powodują chorobę niedokrwienną serca. Badania nad czynnikami genetycznymi są wciąż we wczesnej fazie, ale szybko się rozwijają. Aby zidentyfikować te czynniki i zrozumieć ich rolę w rozwoju serca, fenotypowanie zmutowanych myszy za pomocą prostego i potężnego narzędzia będzie bardzo korzystne.
Mysz jest rzeczywiście modelem zwierzęcym wybieranym do badania CHD, a większość przypadków u ludzi można odtworzyć u myszy4,5. W związku z tym fenotypowanie serca u płodu myszy staje się coraz ważniejsze dla zbadania etiologii ludzkiej choroby niedokrwiennej serca i wymaga odpowiednich narzędzi. Chociaż badania histologiczne na utrwalonych próbkach są nieocenione, obrazowanie żywych zwierząt w czasie rzeczywistym ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia fizjologii serca. Mikroskopia wideo oferuje obrazowanie na żywo. Wymaga jednak laparotomii w celu odsłonięcia zarodków, pogarszając w ten sposób ich stan fizjologiczny i hemodynamiczny. Ostatnio echokardiografia stała się standardową techniką obrazowania w ocenie serca w klinice, a także u myszy.
Echokardiografia płodu u myszy jest przeprowadzana przy użyciu standardowych klinicznych systemów ultrasonograficznych, jak również ultrasonograficznych systemów ultra-wysokiej częstotliwości. Te ostatnie zapewniają przetworniki o częstotliwości 30 MHz lub wyższej, które generują dwuwymiarowe obrazy i umożliwiają ocenę wczesnych stadiów embrionalnych. Przetworniki te mają stosunkowo słabą głębokość penetracji (~13 mm), która jest jednak wystarczająca do uzyskania odpowiednich płaszczyzn obrazowania i wyznaczenia podstawowych parametrów serca, takich jak częstość akcji serca, średnica wewnętrzna lewej i prawej komory przy rozkurczu i skurczu oraz grubość przegrody i ściany, bez wykonywania laparotomii.
W naszym badaniu użyliśmy systemu ultra-wysokiej częstotliwości ultrasonograficznej do oceny częstości akcji serca embrionów myszy w dniu embrionalnym E18.5. Wybraliśmy przetwornik 30 MHz, który zapewnia pole widzenia o wymiarach 20 mm x 20 mm, co jest idealne, biorąc pod uwagę rozmiar płodów, przy ogniskowej 12,7 mm. Można jednak wybrać przetwornik o wyższej częstotliwości do analizy wcześniejszych etapów rozwoju. Wybrany tryb M pozwala na wizualizację tkanek w ruchu dzięki wysokiej rozdzielczości czasowej wynoszącej 1 000 klatek/sek. Cała procedura jest prosta i powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć jakichkolwiek zaburzeń stanu fizjologicznego i hemodynamicznego płodu. Analiza około 8 zarodków trwa około 1 godziny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury przedstawione w tym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami IRCM.
1. Przygotowanie systemu i stacji ultrasonograficznej
- Uruchom system obrazowania ultrasonograficznego i podłącz głowicę skanującą oraz jednostkę kontrolera fizjologii zgodnie z instrukcją producenta (rysunek 1). Wybierz program pomiaru pracy serca i głowicę skanującą odpowiadającą przetwornikowi 30 MHz.
- Napełnij końcówkę głowicy skanującej wodą dejonizowaną. Należy unikać pęcherzyków powietrza, ponieważ zakłócają one rozdzielczość obrazowania. Umieść głowicę skanera uchwytem skierowanym do góry na uchwycie w pobliżu platformy obrazowania (Rysunek 1A).
- Zdezynfekuj platformę obrazowania i obszar roboczy.
- Całkowicie napełnij butelkę żelem ultradźwiękowym, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków i umieść ją do góry nogami w pojemniku do podgrzewania ustawionym na 37 °C (rysunek 1B).
- Sprawdź poziom tlenu i izofluranu oraz system przewodów do znieczulenia. W jednym eksperymencie z ~8 zarodkami zużyto by około 15-20 litrów tlenu.
- Umieść butelki z balsamem okulistycznym, kremem do depilacji i żelem do elektrod w pobliżu platformy obrazowania (Rysunek 1B).
- Sprawdź, czy promiennik podczerwieni lamp działa. Podczas treningu ustaw poziom ciepła, położenie lampy oraz odległość lampy od myszy, aby utrzymać stałą temperaturę ciała i tętno.
Uwaga: Właściwe przygotowanie systemu i materiału ma kluczowe znaczenie. Długotrwałe zabiegi mogą wpływać na fizjologiczne i hemodynamiczne cechy płodów, ponieważ długie znieczulenie obniża czynność serca poprzez obniżenie częstości akcji serca, ciśnienia krwi i poziomu natlenienia krwi. Czas przygotowania dla ~8 płodów (średnia wielkość miotu w C57BL/6) powinien wynosić około 1 godziny. Inne szczepy myszy mogą zapewniać większą liczbę płodów, prawdopodobnie o większych rozmiarach żeńskich. Szkolenie jest niezbędne, aby zoptymalizować czas przetwarzania.
2. Przygotowanie myszy
- Znieczulić ciężarną samicę w komorze z ciągłym dopływem 2% izofluranu w tlen (200 ml/min) do momentu, gdy przestanie reagować.
- Umieść mysz na platformie obrazowania w pozycji leżącej, wyreguluj rurkę do ciągłego wdychania 1,5% izofluranu w tlenie (200 ml/min) i przymocuj rurkę inhalacyjną taśmą (Rysunek 2A). Wystarczające znieczulenie powinno być potwierdzone podczas zabiegu przez zrelaksowaną postawę myszy i brak jakiejkolwiek reakcji na szczypanie ogona i palców .
- Żel elektrodowy należy umieszczać tylko na lewej górnej i prawej dolnej elektrodzie (prawa przednia noga i lewa tylna noga, zwana również pozycją odprowadzenia II) do elektrokardiografii. Pozycja odprowadzenia II zapewnia lepiej zdefiniowany, pionowy, dodatni załamek P i zespół QRS w celu określenia częstości akcji serca. Przymocuj cztery łapy do każdej podkładki za pomocą taśmy (Rysunek 2A). Aby zapobiec wysuszeniu oczu, nałóż 1 kroplę balsamu okulistycznego do każdego oka.
- Ogol brzuch od klatki piersiowej do pęcherza za pomocą maszynki do strzyżenia włosów. Następnie nałóż krem do depilacji na 2 minuty i zetrzyj go gazą i/lub wacikiem, aby ostrożnie usunąć pozostałe włosy. Uważaj, aby nie przeciąć sutków.
- Włóż termometr wstępnie nasmarowany żelem elektrodowym do odbytnicy kobiety, aby monitorować temperaturę ciała (powinna być utrzymywana na poziomie 37±0.5 °C, regulując lampę grzewczą na podczerwień umieszczoną nad platformą). Tętno powinno wynosić 450±50 uderzeń/min (bpm). Zarówno temperatura, jak i tętno są wyświetlane na sterowniku fizjologii (rysunek 1B).
Uwaga: Długie znieczulenie, wypadanie włosów i żel ultradźwiękowy (choć wstępnie podgrzany) mogą prowadzić do hipotermii, która może wpływać na tętno kobiety. Jeśli temperatura ciała spadnie poniżej 36.5 °C, przerwij procedurę i zmodyfikuj położenie ogrzewania lamp aby dostosować temperaturę i tętno. Odczekaj kilka minut, zanim przejdziesz ponownie.
3. Identyfikacja zarodka
- Delikatnie dociśnij nagi brzuch, aby zlokalizować zarodki. Powoli i lekko rozłóż je, aby większość zarodków znajdowała się w jednej warstwie pod powierzchnią brzucha. W każdym rogu macicy woreczki są ze sobą liniowo połączone. Staraj się przestrzegać tej kolejności podczas rozprzestrzeniania.
- Oznacz każdy zarodek na nagim brzuchu samicy trwałym markerem z ich kierunkiem przednim/tylnym i grzbietowym/brzusznym. Znajomość orientacji ułatwi zlokalizowanie serca za pomocą sondy. Ponumeruj zarodki w prawym i lewym rogu, zaczynając od szyjki macicy (odpowiednio 1, 2, 3... i 1', 2', 3'... ; Rysunek 2B).
Uwaga: (i) Unikać rozprzestrzeniania zarodków z nadmierną siłą. Naszkicuj ich położenie na kartce papieru, aby je śledzić (Rysunek 2C). (ii) Samice C57BL/6 mają ~8 płodów w miocie. Jednak 0-2 zarodki w każdym miocie znajdują się pod innymi, co uniemożliwia ich obrazowanie. Należy wykluczyć te zarodki z analizy i w razie potrzeby ocenić więcej miotów.
4. Pomiar tętna
- Niewielką ilość podgrzanego żelu ultradźwiękowego nanieść na nagi brzuch i równomiernie rozprowadzić. Unikaj tworzenia się pęcherzyków. Dodaj większą ilość żelu (~ 5 ml) na konkretny obszar do zobrazowania.
- Trzymaj sondę w kontakcie z grubą warstwą żelu (10 mm) i stopniowo przesuwaj sondę w kierunku skóry, szukając bijącego serca. Po wyświetleniu bijącego serca na ekranie wyreguluj kąt sondy tak, aby obie komory miały największy rozmiar w płaszczyźnie obrazowania (ryc. 2D).
- Rozpocznij pozyskiwanie obrazu. Trzymając przedramię oparte na stacji, umieść przetwornik na żelu ultradźwiękowym, aby uzyskać obraz na żywo na viewekran (Rysunek 2D). Utrzymanie grzbietu przetwornika na górze i kliknięcie znacznika orientacji głowicy skanującej (w lewym górnym rogu obrazu) pozwala na koordynację ruchu ręki i obszaru wizualizowanego na ekranie.
- Zaczynając od szyjki macicy, przejdź do najbliższego zaznaczonego zarodka (odpowiednio 1 lub 1' w prawym lub lewym rogu macicy), aby wyświetlić bijące serce na ekranie. Ponieważ głębokość ogniskowej jest stała, delikatnie przesuwaj sondę w górę/w dół i na boki, nie tracąc kontaktu z żelem, aby uzyskać pożądaną płaszczyznę obrazu.
- Umieść bijące serce na środku ekranu w obszarze wskazanym przez żółtą przerywaną linię reprezentującą strefę ogniskową, aby zapewnić lepsze pozyskiwanie danych.
- Zdobądź nagranie na żywo. Uzyskaj obraz zwiadowcy i wznów nagrywanie (Rysunek 3A). Po uzyskaniu co najmniej 10 sekund stabilnego nagrywania zatrzymaj nagrywanie i zapisz.
- Przejdź do następnego zarodka.
- Po przeanalizowaniu wszystkich zarodków naciśnij "Przeglądaj" na klawiaturze, aby wyświetlić listę nagrań. Odtwórz każdy zarejestrowany tryb śledzenia w trybie M i wykonaj wiele pomiarów (co najmniej 5 na śledzenie) odstępów między sąsiednimi szczytami (cykl czasu/przepływu), aby uzyskać średnie tętno (rysunek 3B).
Uwaga: Niektóre protokoły sugerują użycie stacjonarnej podstawki głowicy skanującej, aby uniknąć drgań. Ogranicza jednak kąt analizy, co utrudnia obserwację zarodków bocznych. Spowalnia to również analizę, ponieważ podstawka musi być dostosowana do każdego zarodka. Trzymanie głowicy skanującej przy jednoczesnym umieszczeniu przedramienia na stacji skutecznie minimalizuje drgania. Zaleca się trening z 5-10 ciężarnymi kobietami, aby zoptymalizować wynik.
5. Genotypowanie
- Za pomocą czystych nożyczek chirurgicznych i kleszczy naciąć wzdłużnie skórę i warstwę mięśniową brzucha. Zlokalizuj woreczki w każdym rogu macicy i dopasuj liczby. Rozciąć woreczek żółtkowy, aby odsłonić zarodek w kolejności użytej powyżej. Jeśli nie w układzie liniowym, szkic pozycji zarodka na kartce papieru będzie niezbędny, gdy ślady na skórze nie będą już widoczne.
- Wytnij tylko ~4 mm ogona w celu genotypowania, ponieważ genomowe DNA jest bardzo skutecznie ekstrahowane z ogonów embrionalnych.
Uwaga: (i) Zabieg chirurgiczny może wymagać wykonania w innym miejscu niż pomieszczenie do obrazowania. Ważne jest jednak, aby nie ruszać myszą i poddać się zabiegowi chirurgicznemu na platformie obrazowania, aby śledzić ponumerowane zarodki. Skonsultuj się z kierownikiem placówki dla zwierząt, aby zoptymalizować zabieg chirurgiczny. (ii) Ciężarna samica szybko umiera z powodu utraty krwi, ponieważ płód jest usuwany w celu genotypowania po obrazowaniu. Po odcięciu ogona płody są umieszczane na lodzie przez 3 minuty w celu znieczulenia przez hipotermię, a następnie ścinane nożyczkami, zgodnie z zaleceniami naszej Komisji Opieki nad Zwierzętami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Powyższą metodę zastosowano w celu oceny wpływu obecności lub braku serynowej proteazy furyny w komórkach śródbłonka na tętno zarodków myszy w dniu E18,5. wewnątrzmacicznieFuryna należy do rodziny konwertaz probiałek (PCs), które odcinają prekursory białek po resztach zasadowych. Furyna oraz jej substraty są białkami wydzielniczymi, a cięcie może następować w aparacie Golgiego, endosomach lub na powierzchni komórki. Do kluczowych substratów furyny należą TGFb oraz czynniki podobne do TGFb, takie jak białka morfo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Echokardiografia w trybie M jest skuteczną i prostą metodą pomiaru częstości akcji serca w macicy zarodków myszy. Dostępne na rynku przetworniki zapewniają wystarczającą rozdzielczość, aby uwidocznić małe bijące serca. W ten sposób umożliwiają bardzo dokładny pomiar tętna w porównaniu z innymi metodami, takimi jak pomiar pulsu, i mogą zastąpić mikroskopię wideo o wysokiej rozdzielczości. Jednak obecne narzędzia nie pozwalają na jednoczesną analizę wszystkich zarodków, co implikuje żmudną procedurę wizualizacji k...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Manon Laprise za szkolenie z echokardiografii i Ann Chamberland za wykonanie zdjęć pokazanych na rysunkach 1 i 2. Prace te były wspierane przez grant Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem MOP 44363 i Canada Chair 950-216684.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406v2 | Eter 1-chloro-2,2,2-trifluoroetylodifluorometylowy |
| Żel ultradźwiękowy | Parker Laboratories Inc. | Żel do elektrod przezroczystych | |
| Parker Laboratories Inc. | Spectra 360 | ||
| Żel okulistyczny | Novartis | przeciwłzowy | |
| Krem do depilacji | Church Dwight Co., Inc. | Nair | |
| do strzyżenia włosów | |||
| Końcówki | do wymiany gazy/bawełny | ||
| Marker | |||
| obrazowania ultrasonograficznego In vivo | Sonics | Vevo770 | |
| 30 MHz | Visual Sonics | ||
| jednostka kontrolera fizjologii | Visual Sonics | ||
| Anesthetic System | Cyprane North America Inc. | ||
| Lampa |
Bibliografia
- Hoffman, J. I., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. J. Am. Coll. Cardiol. 39, 1890-1900 (2002).
- Miller, S. P., et al. Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease. N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and. 15, 165-176 (2003).
- Yu, Q., et al. ENU induced mutations causing congenital cardiovascular anomalies. Development. 131, 6211-6223 (2004).
- Seidah, N. G., Prat, A. The biology and therapeutic targeting of the proprotein convertases. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 367-383 (2012).
- Roebroek, A. J., et al. Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin. Development. 125, 4863-4876 (1998).
- Roebroek, A. J., et al. Limited redundancy of the proprotein convertase furin in mouse liver. J. Biol. Chem. 279, 53442-53450 (2004).
- Kisanuki, Y. Y., et al. Tie2-Cre transgenic mice: a new model for endothelial cell-lineage analysis in vivo. Dev. Biol. 230, 230-242 (2001).
- Kim, W., et al. Loss of endothelial furin leads to cardiac malformation and early postnatal death. Mol. Cell Biol. 32, 3382-3391 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
