Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Summary

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Abstract

Na zawartość kolagenu i organizację w rozwoju tkanek kolagenowych mogą mieć wpływ lokalne szczepy tkanek i ograniczenia tkankowe. Inżynierowie tkankowi dążą do wykorzystania tych zasad do tworzenia tkanek o predefiniowanych architekturach kolagenu. Brakuje jednak pełnego zrozumienia dokładnych procesów leżących u podstaw przebudowy kolagenu w celu kontrolowania końcowej architektury tkanki. W szczególności niewiele wiadomo na temat (re)orientacji włókien kolagenowych w odpowiedzi na zmiany warunków obciążenia mechanicznego tkanek. Opracowaliśmy system modelowy in vitro, składający się z dwuosiowo ograniczonych konstruktów fibrynowych z nasionami miofibroblastów, aby dokładniej wyjaśnić (re)orientację kolagenu w odpowiedzi na i) powrót dwuosiowych do jednoosiowych warunków obciążenia statycznego oraz ii) cykliczne jednoosiowe obciążenie konstrukcji ograniczonych dwuosiowo przed i po zmianie kierunku obciążenia, za pomocą urządzenia ładującego Flexcell FX4000T. Poklatkowe obrazowanie konfokalne służy do wizualizacji (re)orientacji kolagenu w sposób nieniszczący.

Organizacja komórek i kolagenu w konstruktach może być wizualizowana w czasie rzeczywistym, a wewnętrzny system odniesienia pozwala nam na przenoszenie komórek i struktur kolagenowych do analizy poklatkowej. Można dostosować różne aspekty systemu modelowego, takie jak źródło komórek lub wykorzystanie komórek zdrowych i chorych. Dodatki mogą być stosowane do dalszego wyjaśniania mechanizmów leżących u podstaw przebudowy kolagenu, na przykład poprzez dodawanie MMP lub blokowanie integryn. Kształt i rozmiar konstruktu można łatwo dostosować do konkretnych potrzeb, co skutkuje wysoce przestrajalnym systemem modelowym do badania (re)organizacji komórek i kolagenu.

Introduction

Tkanki sercowo-naczyniowe pełnią znaczącą funkcję nośną. W szczególności zawartość i organizacja włókien kolagenowych w macierzy zewnątrzkomórkowej przyczynia się do właściwości nośnych i dominuje w ogólnej wytrzymałości tkanek¹. W inżynierii tkankowej stosuje się mechaniczne kondycjonowanie konstruktu - zwykle składające się z (cyklicznych) schematów naprężania - w celu poprawy organizacji tkanek i właściwości mechanicznych^2,3. Nie osiągnięto jeszcze pełnego zrozumienia indukowanej przez szczep organizacji kolagenu w złożonych geometriach tkanek w celu stworzenia tkanek o predefiniowanej architekturze kolagenu. Wynika to głównie z naszej ograniczonej wiedzy na temat przebudowy kolagenu w rozwijających się tkankach. Istniejące modele dostarczają głównie informacji o końcowym wyniku netto przebudowy kolagenu przy użyciu szczepu statycznego^4-6. W tym przypadku dostarczamy wysoce przestrajalny system modelowy, który pozwala na badanie (re)organizacji kolagenu w czasie rzeczywistym, w 3D, pod wpływem naprężeń statycznych lub cyklicznych. Konstrukty tkankowe są oparte na fibrynie, dzięki czemu cały kolagen w konstrukcie jest endogenny. Organizacja komórek i kolagenu w konstruktach jest wizualizowana, a wewnętrzny system odniesienia pozwala nam na przemieszczanie komórek i struktur kolagenowych w celu analizy poklatkowej. W tym protokole opiszemy zastosowanie systemu modelowego dla ludzkich komórek Vena Saphena (HVSC), ponieważ komórki te są znane ze zwiększonej produkcji macierzy zewnątrzkomórkowej i zdolności do przebudowy macierzy oraz naszego ustalonego zastosowania w zmodyfikowanych tkankach sercowo-naczyniowych⁷, w oparciu o pracę de Jonge i wsp.⁸

Protocol

1. Hodowla komórek ludzkiej żyły sapheny

1. Wyizolować komórki z żyły głębokiej saphena magna, pobrane od dawcy zgodnie z wytycznymi dotyczącymi materiału wtórnego użytku, zgodnie z protokołem Schnella i wsp.⁹ i przechowywać je w ciekłym azocie. Z części żyły saphena magna od jednego dawcy wyciąć kawałki 2 x 2 mm do hodowli na sześciodołkowej płytce. Użyj 2 sztuk na dołek. Ogólnie rzecz biorąc, można uzyskać wystarczającą ilość komórek, aby napełnić około 3 fiolek 0,25 x 10⁶ komórek w ciekłym azocie. HVSC są charakteryzowane jako miofibroblasty, wykazując ekspresję wimentyny, brak ekspresji desminy i subpopulację wyrażającą aktynę mięśni gładkich^{α 10}. Następnie uruchom protokół, aby rozmrozić komórki z ciekłego azotu, aby zwiększyć liczbę komórek.
2. Umieścić komórki z jednej fiolki w kolbie do hodowli tkankowej T75 i dodać pożywkę wzrostową (GM), składającą się z Advanced DMEM, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml penicyliny/streptomycyny i 5 ml L-glutamaxu. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.
3. Komórki zlewają się po około 14 dniach. Przechowywać 0,5 x 10⁶ komórek w jednej fiolce w ciekłym azocie, określanym jako pasaż 1.

Uwaga: Zamrażanie komórek nie jest konieczne podczas zbierania HVSC, ale służy wyłącznie do przechowywania.

4. Umieścić HVSC z jednej fiolki w kolbie do hodowli tkankowej T175 i dodać GM. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni. Komórki zlewają się po około 7 dniach. Przechowywać 3 x 10⁶ komórek w jednej fiolce w ciekłym azocie, zwanym pasażem 2.
5. Umieść komórki z jednej fiolki w butelce rolkowej i dodaj GM. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni. Komórki zlewają się ze sobą po około 8 dniach. Jedna butelka rolkowa zawiera około 20-30 x 10⁶ komórek. Hodowla komórek do pasażu 6. Nie należy używać komórek o pasażu wyższym niż pasaż 9, ponieważ fenotyp komórki może ulec zmianie.

2. Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny

1. Przygotuj klej silikonowy, mieszając elastomer z utwardzaczem (10:1). Wytnij 7 x 3 mm prostokątne segmenty na rzepy. Przyklej rzep do 6-dołkowej płytki hodowlanej z elastycznymi membranami, aby utworzyć krzyż i pozostawić kwadratową przestrzeń 3 mm między paskami rzepów.

Uwagi: Używaj tylko miękkiej strony rzepu i skieruj tę stronę do góry. Podczas klejenia rzepu przykryj rzep tylko klejem silikonowym, nie rozprowadzaj kleju po całej studni. Ponieważ płytki hodowlane mają dno z membraną silikonową, użyj czegoś pod płytką studzienki, aby wzmocnić elastyczne membrany, aby zapewnić łatwe przyklejenie do płytki.

2. Klej silikonowy wysuszyć przez noc w piekarniku w temperaturze 60 °C, aby zapewnić utwardzenie kleju. Sterylizować, dodając 70% EtOH do studzienek i inkubować przez 30 minut. Przepłucz 3x PBS i usuń cały PBS z dołków i rzepów. Umieść pod wpływem promieniowania UV na 30 minut i utrzymuj sterylność do momentu użycia.
3. Przygotowanie pożywki do inżynierii tkankowej (TM), składającej się z GMO i 130 mg 2-fosforanu L-askorbinowego.
4. Dodać 1 mg/ml kwasu ε-aminokapronowego (ACA) do TM. ACA stosuje się przez pierwsze 7 dni posiewu, aby zapobiec degradacji fibryny¹¹. Alternatywnie można zastosować aprotyninę.
5. Aby zapobiec tworzeniu się grudek, przed otwarciem pozwól fibrynogenowi osiągnąć temperaturę pokojową. Bez grudek fibrynogen łatwiej się rozpuści. Rozpuść fibrynogen do stężenia 10 mg rzeczywistego białka/ml TM⁷ uzupełnionego ACA. Sterylny filtr roztwór fibrynogenu, może być potrzebnych wiele filtrów. Przechowywać na lodzie do czasu użycia.

Uwaga: Aby delikatnie rozpuścić fibrynogen, aby zapobiec tworzeniu się zbyt dużej ilości piany.

6. Rozpuścić trombinę do stężenia 10 j.m./ml TM⁷ uzupełnioną ACA. Przechowywać na lodzie do czasu użycia.

Uwaga: Przechowywanie na lodzie jest konieczne, aby zapobiec wczesnemu żelowaniu trombiny i fibrynogenu.

7. Trypsynizuj komórki, ponownie zamieszaj w GM i policz.
8. Użyj 15 x 10⁶ komórek/ml do wysiewu konstruktów tkankowych na bazie fibryny (stężenie oparte na metodach inżynierii tkankowej zastawek serca⁷). Pojedynczy żel składa się ze 100 μl żelu, a więc z 1,5 x 10⁶ komórek. Umieść 1,5 x 10⁶ komórek w jednej probówce wirówkowej, co daje tyle probówek wirówkowych, ile żeli zostanie wyprodukowanych.
9. Odwirować komórki przy 350 x g przez 7 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić komórki w 50 μl trombiny. Do tej zawiesiny dodać 4 μl niebieskich fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych. Umieść 50 μl fibrynogenu w fiolce. Za pomocą pipety pobrać 50 μl trombiny wraz z komórkami. Zwiększyć objętość pipety do 100 μl. Odpipetować 50 μl roztworu trombiny z komórkami do fiolki z fibrynogenem w celu wymieszania trombiny i fibrynogenu, a następnie pobrać mieszaninę 100 μl.

Uwaga: Fluorescencyjne mikrosfery polistyrenowe są używane jako wewnętrzne znaczniki referencyjne do analizy obrazu. Podczas mieszania trombiny i fibrynogenu należy zapobiegać tworzeniu się pęcherzyków powietrza, ostrożnie pipetując mieszaninę. Pęcherzyki powietrza spowodują w żelu fibryny.

10. Odpipetować mieszaninę żelu do pasków na rzepy i pomiędzy nimi. Typowy czas żelowania żeli fibrynowych, po wymieszaniu składników, wynosi około 20 sekund.

Uwagi: Zrób to tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec żelowaniu zanim mieszanina zostanie odpipetowana do płytki studzienki. Poćwicz przed użyciem komórek i koralików.

11. Inkubować zawiesiny przez 30 minut w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 95% powietrza/5% CO_{2 ,} aby umożliwić żelowanie przed dodaniem kultury TM z ACA.
12. Wymieniaj TM na ACA co 2-3 dni przez pierwsze 7 dni. Żele są na tyle stabilne po tygodniu, że można je hodować bez ACA. Po pierwszym tygodniu wymieniaj TM co 2-3 dni. Dodać 6 ml TM na studzienkę. W 12 dniu komórki wyprodukowały wystarczającą ilość kolagenu do wizualizacji.

3. Stosowanie szczepu i wywoływanie zmian w obciążeniu i ograniczeniach

1. Odkształcenie statyczne jest wywierane bezpośrednio przez komórki, ze względu na ciągnięcie i zagęszczenie komórek¹². Aby wywołać reorganizację kolagenu, odetnij konstrukcję tkanki luźno z dwóch pasków rzepów w jednym kierunku. Powoduje to powstania wiązań jednokierunkowych (rysunek 1A). Wykonaj to w 12 dniu, ponieważ konstrukt jest wtedy wystarczająco stabilny, a kolagen został zdeponowany.
2. Zastosować cykliczne odkształcanie poprzez zastosowanie próżni na dnie płytek hodowlanych z elastycznymi membranami, za pomocą systemu FX4000T Flexcell. Umieść tabliczki na płycie podstawy, na słupkach załadowczych (które są częścią cyklicznego urządzenia załadowczego). Pompa wywiera podciśnienie na membranę i w ten sposób przeciąga membranę nad prostokątnym słupkiem leżącym pod spodem. Ze względu na krzyżowe mocowania konstruktów tkankowych do membrany (za pomocą rzepu) i prostokątnego słupka, zastosowane cykliczne odkształcenie jest jednoosiowe (ryc. 1B).
3. Początkowo należy stosować hodowlę statyczną przez 5 dni, aby osiągnąć początkową integralność mechaniczną, przed zastosowaniem cyklicznego szczepu rozpoczynającego się w 6 dniu. Zaprogramuj protokół cyklicznego barwienia w sterowniku pompy próżniowej. Na przykład należy użyć wcześniej ustalonego protokołu przerywanego cyklicznego odkształcania z jednoosiowym kierunkiem¹³. Składa się z przerywanego odkształcenia fali sinusoidalnej o częstotliwości 1 Hz, naprężającej się od 0 do 5% odkształcenia, przez okresy 3 godzin, na przemian z 3-godzinnymi okresami spoczynku. Wykonuj ten cykliczny protokół szczepu przez 7 dni, indukując wyrównaną organizację kolagenu.
4. Zazwyczaj po 12 dniach HVSC wytwarzają wyrównaną organizację kolagenu. Po osiągnięciu wyrównanej organizacji kolagenu zmień jednoosiowy kierunek cyklicznego odkształcenia, aby był prostopadły do pierwotnego kierunku odkształcenia. W tym celu należy obrócić prostokątne słupki o 90°.

4. Wizualizacja komórek i kolagenu

1. Aby zobrazować aktywną przebudowę kolagenu w czasie rzeczywistym, oznacz próbki sondami, które nie zakłócają żywotności komórek ani tworzenia kolagenu. Użyj sond do fluorescencyjnego barwienia cytoplazmy komórki i kolagenu.
2. Alternatywnie można zastosować generowanie drugiej harmonicznej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej do wizualizacji struktur kolagenowych za pomocą autofluorescencji¹⁴, ze wzbudzeniem przy 780 nm i detekcją w zakresie 500-550 nm.
3. Wyjmij płytki hodowlane z zestawu i inkubatora dla cyklicznie napiętych próbek podczas 3-godzinnego okresu odpoczynku i przetransportuj je do konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego w celu wizualizacji komórek i kolagenu.

Results

Ten system modelowy pozwala na hodowlę żeli fibrynowych z nasionami miofibroblastów. Rysunek 1A przedstawia tkankę wyhodowaną najpierw w statycznych ograniczeniach dwuosiowych. Ograniczenia tkankowe są uwalniane przez odcięcie żelu fibrynowego z dwóch wiązań, w celu wytworzenia jednoosiowych ograniczeń statycznych, a następnie zagęszczenia i przebudowy tkanki (ryc. 1A). W przypadku szczepu cyklicznego tkanka jest również hodowana w statycznych ograniczeniach dwuosiowych. Po 5 dniach możn...

Discussion

Opisany system modelowy konstruktów fibrynowych wypełnionych komórkami ma ogromny potencjał do badania (re)organizacji komórek i kolagenu (de Jonge i wsp.¹⁵), np. do wykorzystania do celów inżynierii tkankowej. Używając fibryny jako początkowego nośnika komórkowego, po degradacji fibryny powstaje tkanka składająca się tylko z komórek i macierzy endogennej. W ten sposób komórki są stymulowane do reagowania na odkształcenie, o charakterze statycznym lub cyklicznym, poprzez zastosowanie sił kurc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastik hodowlany	Greiner		Zawiera kolby hodowlane i pipety
Zaawansowany DMEM	Gibco	12491
Płodowa surowica bydlęca	Greiner	758075
Penicylina/streptomycyna	Gibco	10378016
GlutaMax	Gibco	35050-079
Elastomer i utwardzacz	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Velcro	Regularny sklep		Możesz to kupić w zwykłym sklepie, używaj tylko miękkiej strony
Płytki hodowlane Bioflex	Flexcell Int	BF-3001U	Nieleczony
kwas L-askorbinowy 2-fosfataza	Sigma	A8960
ε-Kwas aminokapronowy	Sigma-Aldrich	D7754
Trombina bydlęca	Sigma	T4648
Fibrynogen bydlęcy	Sigma	F8630
0,45 filtr strzykawkowy	Whatmann (Schleicher i Scheul)	10462100
Mikrosfery polistyrenowe	Invitrogen	F-8829	Niebieska fluorescencyjna, 10 μ m średnica
Flexcell FX-4000T	Flexcell Int		Zawiera prostokątne słupki załadowcze
Cell Tracker Orange	Invitrogen Sondy molekularne	C2927
CNA35-OG488			Serdecznie dostarczane przez Laboratorium Chemii Makromolekularnej i Organicznej, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Uniwersytet Techniczny w Eindhoven
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy	Laserowy mikroskop skaningowy Carl Zeiss		LSM 510 Meta i tryb Two-Photon-LSM
Amfoterycyna	Gibco	15290-018	Potrzebny do izolacji komórek