Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Podsumowanie

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Streszczenie

Na zawartość kolagenu i organizację w rozwoju tkanek kolagenowych mogą mieć wpływ lokalne szczepy tkanek i ograniczenia tkankowe. Inżynierowie tkankowi dążą do wykorzystania tych zasad do tworzenia tkanek o predefiniowanych architekturach kolagenu. Brakuje jednak pełnego zrozumienia dokładnych procesów leżących u podstaw przebudowy kolagenu w celu kontrolowania końcowej architektury tkanki. W szczególności niewiele wiadomo na temat (re)orientacji włókien kolagenowych w odpowiedzi na zmiany warunków obciążenia mechanicznego tkanek. Opracowaliśmy system modelowy in vitro, składający się z dwuosiowo ograniczonych konstruktów fibrynowych z nasionami miofibroblastów, aby dokładniej wyjaśnić (re)orientację kolagenu w odpowiedzi na i) powrót dwuosiowych do jednoosiowych warunków obciążenia statycznego oraz ii) cykliczne jednoosiowe obciążenie konstrukcji ograniczonych dwuosiowo przed i po zmianie kierunku obciążenia, za pomocą urządzenia ładującego Flexcell FX4000T. Poklatkowe obrazowanie konfokalne służy do wizualizacji (re)orientacji kolagenu w sposób nieniszczący.

Organizacja komórek i kolagenu w konstruktach może być wizualizowana w czasie rzeczywistym, a wewnętrzny system odniesienia pozwala nam na przenoszenie komórek i struktur kolagenowych do analizy poklatkowej. Można dostosować różne aspekty systemu modelowego, takie jak źródło komórek lub wykorzystanie komórek zdrowych i chorych. Dodatki mogą być stosowane do dalszego wyjaśniania mechanizmów leżących u podstaw przebudowy kolagenu, na przykład poprzez dodawanie MMP lub blokowanie integryn. Kształt i rozmiar konstruktu można łatwo dostosować do konkretnych potrzeb, co skutkuje wysoce przestrajalnym systemem modelowym do badania (re)organizacji komórek i kolagenu.

Wprowadzenie

Tkanki sercowo-naczyniowe pełnią znaczącą funkcję nośną. W szczególności zawartość i organizacja włókien kolagenowych w macierzy zewnątrzkomórkowej przyczynia się do właściwości nośnych i dominuje w ogólnej wytrzymałości tkanek¹. W inżynierii tkankowej stosuje się mechaniczne kondycjonowanie konstruktu - zwykle składające się z (cyklicznych) schematów naprężania - w celu poprawy organizacji tkanek i właściwości mechanicznych^2,3. Nie osiągnięto jeszcze pełnego zrozumienia indukowanej przez szczep organizacji kolagenu w złożonych geometriach tkanek w celu stworzenia tkanek o predefiniowanej architekturze kolagenu. Wynika to głównie z naszej ogranic....

Protokół

1. Hodowla komórek ludzkiej żyły sapheny

1. Wyizolować komórki z żyły głębokiej saphena magna, pobrane od dawcy zgodnie z wytycznymi dotyczącymi materiału wtórnego użytku, zgodnie z protokołem Schnella i wsp.⁹ i przechowywać je w ciekłym azocie. Z części żyły saphena magna od jednego dawcy wyciąć kawałki 2 x 2 mm do hodowli na sześciodołkowej płytce. Użyj 2 sztuk na dołek. Ogólnie rzecz biorąc, można uzyskać wystarczającą ilość komórek, aby napełnić około 3 fiolek 0,25 x 10⁶ komórek w ciekłym azocie. HVSC są charakteryzowane jako miofibroblasty, wykazując ekspresję wimentyny, brak ekspresji desminy i subpopulację wyrażającą akty....

Wyniki

Ten system modelowy umożliwia hodowlę żeli fibrynowych zasianych myofibroblastami. Rysunek 1A przedstawia tkankę hodowaną początkowo w warunkach statycznego ograniczenia dwuosiowego. Ograniczenia tkanki są zwalniane poprzez odcięcie żelu fibrynowego od dwóch punktów mocowania, co tworzy statyczne ograniczenie jednowymiarowe, po czym następuje kompakcja i przebudowa tkanki (Rysunek 1A). W przypadku odkształcenia cyklicznego tkanka jest również hodowana w warunkach statycznego ograniczenia.......

Dyskusja

Opisany system modelowy konstruktów fibrynowych wypełnionych komórkami ma ogromny potencjał do badania (re)organizacji komórek i kolagenu (de Jonge i wsp.¹⁵), np. do wykorzystania do celów inżynierii tkankowej. Używając fibryny jako początkowego nośnika komórkowego, po degradacji fibryny powstaje tkanka składająca się tylko z komórek i macierzy endogennej. W ten sposób komórki są stymulowane do reagowania na odkształcenie, o charakterze statycznym lub cyklicznym, poprzez zastosowanie sił kurc.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Plastik hodowlany	Greiner		Zawiera kolby hodowlane i pipety
Zaawansowany DMEM	Gibco	12491
Płodowa surowica bydlęca	Greiner	758075
Penicylina/streptomycyna	Gibco	10378016
GlutaMax	Gibco	35050-079
Elastomer i utwardzacz	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Velcro	Regularny sklep		Możesz to kupić w zwykłym sklepie, używaj tylko miękkiej strony
Płytki hodowlane Bioflex	Flexcell Int	BF-3001U	Nieleczony
kwas L-askorbinowy 2-fosfataza	Sigma	A8960
ε-Kwas aminokapronowy	Sigma-Aldrich	D7754
Trombina bydlęca	Sigma	T4648
Fibrynogen bydlęcy	Sigma	F8630
0,45 filtr strzykawkowy	Whatmann (Schleicher i Scheul)	10462100
Mikrosfery polistyrenowe	Invitrogen	F-8829	Niebieska fluorescencyjna, 10 μ m średnica
Flexcell FX-4000T	Flexcell Int		Zawiera prostokątne słupki załadowcze
Cell Tracker Orange	Invitrogen Sondy molekularne	C2927
CNA35-OG488			Serdecznie dostarczane przez Laboratorium Chemii Makromolekularnej i Organicznej, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Uniwersytet Techniczny w Eindhoven
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy	Laserowy mikroskop skaningowy Carl Zeiss		LSM 510 Meta i tryb Two-Photon-LSM
Amfoterycyna	Gibco	15290-018	Potrzebny do izolacji komórek