Ulepszona metoda przygotowania kolagenu typu I ze skóry

Podsumowanie

Tradycyjne procedury izolacji rozpuszczalnego kolagenu typu 1 (COL1) wymagają około 10 dni od początku do końca ze względu na długie inkubacje buforowe i pracochłonne zawieszanie włókienek. Tutaj opisujemy sposób oczyszczania COL1 z małych biopsji skóry w mniej niż 3 godziny.

Streszczenie

Rozpuszczalny kolagen typu 1 (COL1) jest szeroko stosowany jako substrat adhezyjny dla kultur komórkowych oraz jako rusztowanie komórkowe do zastosowań regeneracyjnych. Klinicznie białko to jest szeroko stosowane w chirurgii plastycznej, iniekcjach skórnych, przeszczepach kostnych i chirurgii rekonstrukcyjnej. Źródła COL1 w tych procedurach są zwykle nieludzkie, co zwiększa ryzyko zapalenia i odrzucenia, a także przenoszenia chorób ksenobiotycznych. W związku z tym metoda skutecznego i szybkiego oczyszczania COL1 z ograniczonych ilości tkanek pochodzących autologicznie pozwoliłaby obejść wiele z tych problemów; Jednak standardowe protokoły izolacji są długotrwałe i często wymagają dużych ilości tkanek kolagenowych. Tutaj demonstrujemy skuteczną metodę ekstrakcji COL1, która skraca czas potrzebny do wyizolowania i oczyszczenia tego białka z około 10 dni do mniej niż 3 godzin. Wybraliśmy skórę właściwą jako źródło tkanek ze względu na jej dostępność podczas wielu zabiegów chirurgicznych. Metoda ta wykorzystuje tradycyjne ekstrakcyjne w połączeniu z wymuszonym mieszaniem i filtracją odśrodkową w celu uzyskania wysoce czystego, rozpuszczalnego COL1 z niewielkich ilości korium. Krótko mówiąc, biopsje skóry są dokładnie myte w lodowatym dH₂O po usunięciu tłuszczu, tkanki łącznej i włosów. Próbki skóry są pozbawiane niekolagenowych białek i polisacharydów za pomocą 0,5 M octanu sodu i wysokoobrotowego homogenizatora laboratoryjnego. Kolagen z pozostałości ciał stałych jest następnie ekstrahowany za pomocą 0,075 M buforu cytrynianu sodu za pomocą homogenizatora. Ekstrakty te są oczyszczane przy użyciu filtrów odśrodkowych o mocy 100 000 MW, które dają preparaty COL1 o jakości porównywalnej lub wyższej do produktów komercyjnych lub otrzymywanych przy użyciu tradycyjnych procedur. Przewidujemy, że ta metoda ułatwi wykorzystanie autologicznie pochodzącego COL1 do wielu zastosowań badawczych i klinicznych.

Wprowadzenie

Przez dziesięciolecia, badacze i komercyjni sprzedawcy izolowali rozpuszczony COL1 z różnych źródeł tkanek, w tym skóry i ścięgien, używając pewnej odmiany prostego protokołu ekstrakcji kwasem, po którym następuje neutralizacja, co skutkuje ponownym zawieszeniem matrycy zorganizowanych włókienek COL1, które mogą być używane do wielu zastosowań biomedycznych ^1-4Chociaż istnieje wiele przykładów klinicznych zastosowań COL1, niewiele z nich wykorzystuje autologicznie uzyskany COL1, ponieważ przygotowanie tego białka wymaga długich ekstrakcji trwających dni lub tygodnie, aby przeprowadzić^5-7. W rezultacie, badacze i lekarze na ogół używają drogich, k....

Protokół

Tutaj pokażemy izolację COL1 ze skóry jagnięcej. Jak napisano, ten protokół może być również wykorzystany do skutecznego izolowania COL1 ze skóry królika i człowieka.

1. Przygotuj próbkę skórną

1. Przed użyciem zrównoważyć wszystkie odczynniki do 4 °C.
2. Spłucz próbkę skórną (25-50 g) w lodowatym dH₂O i usuń wełnę, sierść lub włosy kremem do depilacji.
3. Użyj jednoostrzowej żyletki, aby zeskrobać próbkę z tkanki łącznej i tłuszczu.
4. Przepłukać próbkę w lodowatym dH₂O.
5. Pokrój próbkę skóry na kawałki o wymiarach 1 cm x 1 cm za pomocą jednoostrzowej żyletki.

Wyniki

Niniejszy protokół izolacji COL1 wymaga około 2 hr i 15 min do ukończenia. Rysunek 1 przedstawia schemat obrazujący główne etapy tej procedury. Przygotowanie próbki oraz przeprowadzenie 7 cykli szybkich wytrząsów i płukania octanem sodu zajmuje około 35 min (Rysunki 1A-C). Przeprowadzenie jednego cyklu wytrząsania i płukania dH₂O zajmuje około 5 min (Rysunki 1D i 1E). Dodanie cytrynianu sodu i poddanie próbki jednemu cyklowi wytrząsania i płukania, a następnie.......

Dyskusja

Kluczowym elementem tej metody jest wielokrotne skuteczne ściskanie próbki skórnej w celu usunięcia nadmiaru płynu. Bardzo ważne jest, aby usunąć jak najwięcej octanu sodu w kroku 2.5 poprzez ściskanie próbki. Używamy szpatułki, aby zagęścić skórę przy boku tubki; Można jednak również użyć gazy, chociaż wymagałoby to usunięcia próbki z probówki i wydłużyłoby czas potrzebny na wykonanie tych czynności. Podobnie ważne jest, aby skompresować próbkę w kroku 3.1, tak aby objętość cytrynianu sodu była dokładna w kolejnych etap.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
FastPrep-24 System	MP Biomedicals	116004500
Wirówka	Beckman	J6-MI	Obrotowy wirnik kubełkowy do przechowywania stożkowych probówek o pojemności 50 ml o pojemności 3,200 x g.