Ulepszona metoda przygotowania kolagenu typu I ze skóry

Podsumowanie

Tradycyjne procedury izolacji rozpuszczalnego kolagenu typu 1 (COL1) wymagają około 10 dni od początku do końca ze względu na długie inkubacje buforowe i pracochłonne zawieszanie włókienek. Tutaj opisujemy sposób oczyszczania COL1 z małych biopsji skóry w mniej niż 3 godziny.

Streszczenie

Rozpuszczalny kolagen typu 1 (COL1) jest szeroko stosowany jako substrat adhezyjny dla kultur komórkowych oraz jako rusztowanie komórkowe do zastosowań regeneracyjnych. Klinicznie białko to jest szeroko stosowane w chirurgii plastycznej, iniekcjach skórnych, przeszczepach kostnych i chirurgii rekonstrukcyjnej. Źródła COL1 w tych procedurach są zwykle nieludzkie, co zwiększa ryzyko zapalenia i odrzucenia, a także przenoszenia chorób ksenobiotycznych. W związku z tym metoda skutecznego i szybkiego oczyszczania COL1 z ograniczonych ilości tkanek pochodzących autologicznie pozwoliłaby obejść wiele z tych problemów; Jednak standardowe protokoły izolacji są długotrwałe i często wymagają dużych ilości tkanek kolagenowych. Tutaj demonstrujemy skuteczną metodę ekstrakcji COL1, która skraca czas potrzebny do wyizolowania i oczyszczenia tego białka z około 10 dni do mniej niż 3 godzin. Wybraliśmy skórę właściwą jako źródło tkanek ze względu na jej dostępność podczas wielu zabiegów chirurgicznych. Metoda ta wykorzystuje tradycyjne ekstrakcyjne w połączeniu z wymuszonym mieszaniem i filtracją odśrodkową w celu uzyskania wysoce czystego, rozpuszczalnego COL1 z niewielkich ilości korium. Krótko mówiąc, biopsje skóry są dokładnie myte w lodowatym dH₂O po usunięciu tłuszczu, tkanki łącznej i włosów. Próbki skóry są pozbawiane niekolagenowych białek i polisacharydów za pomocą 0,5 M octanu sodu i wysokoobrotowego homogenizatora laboratoryjnego. Kolagen z pozostałości ciał stałych jest następnie ekstrahowany za pomocą 0,075 M buforu cytrynianu sodu za pomocą homogenizatora. Ekstrakty te są oczyszczane przy użyciu filtrów odśrodkowych o mocy 100 000 MW, które dają preparaty COL1 o jakości porównywalnej lub wyższej do produktów komercyjnych lub otrzymywanych przy użyciu tradycyjnych procedur. Przewidujemy, że ta metoda ułatwi wykorzystanie autologicznie pochodzącego COL1 do wielu zastosowań badawczych i klinicznych.

Wprowadzenie

Przez dziesięciolecia, badacze i komercyjni sprzedawcy izolowali rozpuszczony COL1 z różnych źródeł tkanek, w tym skóry i ścięgien, używając pewnej odmiany prostego protokołu ekstrakcji kwasem, po którym następuje neutralizacja, co skutkuje ponownym zawieszeniem matrycy zorganizowanych włókienek COL1, które mogą być używane do wielu zastosowań biomedycznych ^1-4Chociaż istnieje wiele przykładów klinicznych zastosowań COL1, niewiele z nich wykorzystuje autologicznie uzyskany COL1, ponieważ przygotowanie tego białka wymaga długich ekstrakcji trwających dni lub tygodnie, aby przeprowadzić^5-7. W rezultacie, badacze i lekarze na ogół używają drogich, komercyjnych preparatów COL1, które są przygotowywane przy użyciu tkanek innych niż ludzkie, takich jak korium szczura, bydła lub świni lub przy użyciu skóry usuniętej ze zwłok lub po obrzezaniu mężczyzn. W przypadku zastosowań regeneracyjnych wiele z tych produktów wykazuje zmienność pod względem zdolności do tworzenia stałych matryc lub konstruktów tkankowych zdolnych do wspierania przyłączania i wzrostu komórek. W związku z tym istnieje wyraźne zapotrzebowanie na nową, znormalizowaną metodę zaprojektowaną w celu szybkiej ekstrakcji COL1 z dostępnych i licznych źródeł tkanek autologicznych.

Taka metoda pozwoliłaby zaoszczędzić zarówno czas, jak i pieniądze w warunkach badawczych, gdzie COL1 mógłby zostać wyekstrahowany z interesującego nas modelu zwierzęcego i wykorzystany do przedklinicznych testów zmodyfikowanych tkanek złożonych na rusztowaniach opartych na kolagenie. Jednocześnie możliwość stosowania w klinice szybko izolowanego, autologicznie pochodzącego COL1 zwiększyłaby ogólne bezpieczeństwo dla pacjentów, którzy w przeciwnym razie otrzymywaliby preparaty allogeniczne lub ksenogeniczne. W przypadku pacjentów otrzymujących preparat autogeniczny ta uproszczona metoda znacznie skróciłaby odstęp między pobraniem biopsji a aplikacją kolagenu. Z tych powodów staraliśmy się ulepszyć sprawdzoną od dawna metodę izolacji i oczyszczania COL1 poprzez zastosowanie szybkiego mieszania i wirowania z wykluczeniem wielkości. Ta metoda jest prosta do wykonania przy użyciu standardowych i sprzętu znajdującego się w wielu laboratoriach. Dzięki zastosowaniu szybkiego mieszania, nasz protokół skraca czas niezbędny do wyizolowania rozpuszczalnego, skórnego COL1 z około 10 dni do mniej niż 3 godzin⁸. Co ważne, metoda ta może być łatwo wykonana w warunkach klinicznych w celu przygotowania autologicznego COL1 do stosowania u pacjentów podczas jednego zestawu zabiegów.

Protokół

Tutaj pokażemy izolację COL1 ze skóry jagnięcej. Jak napisano, ten protokół może być również wykorzystany do skutecznego izolowania COL1 ze skóry królika i człowieka.

1. Przygotuj próbkę skórną

1. Przed użyciem zrównoważyć wszystkie odczynniki do 4 °C.
2. Spłucz próbkę skórną (25-50 g) w lodowatym dH₂O i usuń wełnę, sierść lub włosy kremem do depilacji.
3. Użyj jednoostrzowej żyletki, aby zeskrobać próbkę z tkanki łącznej i tłuszczu.
4. Przepłukać próbkę w lodowatym dH₂O.
5. Pokrój próbkę skóry na kawałki o wymiarach 1 cm x 1 cm za pomocą jednoostrzowej żyletki.

2. Usuń niekolagenowy materiał rozpuszczony

1. Odważyć 5 g próbki na probówkę stożkową o pojemności 50 ml i dodać 30 ml lodowatego 0,5 M octanu sodu.
2. Mieszaj probówki przez 1 minutę przy ustawieniu 6 m/s za pomocą adaptera probówki o pojemności 50 ml w homogenizatorze stołowym.
3. Odrzucić supernatant i powtórzyć czynność łącznie przez 7 cykli płukania octanem sodu.
4. Przepłukać próbkę w lodowato zimnym_dH2O i jednokrotnie wymieszać w celu usunięcia pozostałości octanu sodu.
5. Za pomocą szpatułki ściśnij próbkę do boku probówki, aby usunąć nadmiar płynu, a następnie przenieś do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.

3. Ekstrakcja kolagenu typu I

1. Przemyć próbkę dwukrotnie w 2 ml/g 0,075 M buforze cytrynianu sodu przez 1 minutę z prędkością 6 m/s w homogenizatorze laboratoryjnym, ściskając próbkę i odrzucając supernatant po każdym przemyciu.
2. Dodać do próbki świeżą porcję 2 ml/g 0,075 M buforu cytrynianu sodu.
3. Wykonaj 6 sekwencyjnych cykli mieszania homogenizatora stołowego z prędkością 1 minuty i 6 m/s bez usuwania buforu między każdym cyklem.
4. Przenieść gęsty, klarowny sklarowany sklarowany sklarent do probówki zbiorczej.
5. Dodać do próbki dodatkowy 1 ml/g 0,075 M buforu cytrynianu sodu i przeprowadzić jeden ostatni cykl mieszania homogenizatora laboratoryjnego.
6. Dodać ten końcowy supernatant do probówki zbiorczej.
7. Odwirować probówkę zbiorczą o stężeniu 3 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
8. Przenieść supernatant do górnej komory odśrodkowego urządzenia filtrującego o masie cząsteczkowej 100 000 mas cząsteczkowych.
9. Wirować przy 3 200 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
10. Przenieść oczyszczony COL1 z górnej komory do czystej stożkowej probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C.

Wyniki

Niniejszy protokół izolacji COL1 wymaga około 2 hr i 15 min do ukończenia. Rysunek 1 przedstawia schemat obrazujący główne etapy tej procedury. Przygotowanie próbki oraz przeprowadzenie 7 cykli szybkich wytrząsów i płukania octanem sodu zajmuje około 35 min (Rysunki 1A-C). Przeprowadzenie jednego cyklu wytrząsania i płukania dH₂O zajmuje około 5 min (Rysunki 1D i 1E). Dodanie cytrynianu sodu i poddanie próbki jednemu cyklowi wytrząsania i płukania, a następnie...

Dyskusja

Kluczowym elementem tej metody jest wielokrotne skuteczne ściskanie próbki skórnej w celu usunięcia nadmiaru płynu. Bardzo ważne jest, aby usunąć jak najwięcej octanu sodu w kroku 2.5 poprzez ściskanie próbki. Używamy szpatułki, aby zagęścić skórę przy boku tubki; Można jednak również użyć gazy, chociaż wymagałoby to usunięcia próbki z probówki i wydłużyłoby czas potrzebny na wykonanie tych czynności. Podobnie ważne jest, aby skompresować próbkę w kroku 3.1, tak aby objętość cytrynianu sodu była dokładna w kolejnych etap...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
FastPrep-24 System	MP Biomedicals	116004500
Wirówka	Beckman	J6-MI	Obrotowy wirnik kubełkowy do przechowywania stożkowych probówek o pojemności 50 ml o pojemności 3,200 x g.