Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Summary

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Abstract

Praca z delikatną tkanką może być czynnikiem komplikującym podczas przeprowadzania oceny immunohistochemicznej. W tym miejscu przedstawiamy metodę, która wykorzystuje hydrofilizowaną membranę PTFE opartą na pierścieniu, aby zapewnić wsparcie strukturalne zarówno żywej, jak i utrwalonej tkance podczas przetwarzania immunohistochemicznego, co pozwala na zastosowanie różnych protokołów, które w przeciwnym razie spowodowałyby uszkodzenie tkanki. Po pierwsze, demonstruje się to za pomocą ładowania markerów fluorescencyjnych w bolusie do żywej tkanki siatkówki. Metoda ta pozwala na szybką wizualizację docelowych struktur, natomiast podparcie błonowe utrzymuje integralność tkanek podczas iniekcji i pozwala na łatwe przeniesienie preparatu do dalszego obrazowania lub obróbki.

Po drugie, opisana jest procedura barwienia przeciwciał w tkance utrwalonej karbodimidem. Chociaż wiązanie paraformaldehydu jest bardziej powszechne, wiązanie karbodimidu zapewnia doskonały substrat do wizualizacji białek synaptycznych. Ograniczeniem karbodimidu jest to, że powstała w ten sposób utrwalona tkanka jest stosunkowo delikatna; Jest to jednak przezwyciężane za pomocą membrany nośnej. Do zademonstrowania tych technik wykorzystuje się tkankę siatkówki, ale można je zastosować do dowolnej delikatnej tkanki.

Introduction

Przeprowadzanie immunohistochemii w delikatnych, nienaruszonych tkankach wiąże się z ryzykiem uszkodzenia podczas przenoszenia i przenoszenia. Może to wystąpić zarówno w wycinkach mózgu, jak i innych cienkich tkankach, takich jak zdegenerowana siatkówka. Ponadto istnieją pewne metody utrwalania tkanek, które mogą być korzystne dla barwienia immunologicznego struktur neuronalnych, ale powodują upośledzenie stabilności strukturalnej, co wyklucza ich stosowanie. Szczególnym tego przykładem jest utrwalanie na bazie karbodiamidu, które jest lepsze w barwieniu receptorów i hormonów^1-7, ale zwykle unika się go ze względu na niestabilność utrwalonej tkanki.

Tutaj opisujemy procedurę, która wykorzystuje hydrofilizowaną membranę PTFE do strukturalnego podtrzymywania delikatnej tkanki, zarówno stałej, jak i nieutrwalonej, dla różnych technik barwienia. Membrana nośna pozwala na manipulację delikatną tkanką przed i po utrwaleniu, co pozwala na kilka etapów przetwarzania przy jednoczesnym zminimalizowaniu ryzyka uszkodzenia tkanki. Ogólnie rzecz biorąc, ta prosta metoda zachowania integralności tkanek daje możliwość zastosowania technik, których w przeciwnym razie można by uniknąć. W związku z tym podejście to może być również z powodzeniem stosowane do przygotowywania szerokiej gamy tkanek, takich jak wycinki mózgu, które stają się kruche po procedurach krojenia.

Protocol

We wszystkich procedurach eksperymentalnych, zwierzęta były traktowane zgodnie z przepisami zawartymi w Oświadczeniu ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych oraz zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Weill Cornell Medical College. Zwierzęta zostały poddane eutanazji przez dwutlenek węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.

1. Rozwarstwienie całej siatkówki

1. Po eutanazji myszy należy wyłuszczyć jej oczy i umieścić je w natlenionym, buforowanym przez HEPES roztworze Ringera (Tabela 1).
2. Usuń rogówkę, przecinając okrągłą ścieżkę wzdłuż ora serrata małymi nożyczkami, przytrzymując oko na rąbku kleszczami. Wyciągnij obiektyw za pomocą kleszczy.
3. Usuń jak najwięcej ciała szklistego za pomocą kleszczy o stępionych krawędziach. Ten etap jest ważny w przypadku wstrzyknięć w bolusie i zapisów elektrofizjologicznych; Nie jest to konieczne w przypadku wykonywania samej immunohistochemii.
4. Odłącz siatkówkę od muszli ocznej, umieszczając kleszcze między siatkówką a muszlą oczną, powoli przesuwając kleszcze po obwodzie. Ustabilizuj muszlę oczną, mocno przytrzymując twardówkę drugim zestawem kleszczyków. Przetnij nerw wzrokowy w miejscu między siatkówką a muszlą oczną, aby ułatwić oddzielenie siatkówki od muszli ocznej.
5. Siatkówka może być rozebrana na kawałki (np. ćwiartki) lub używana jako całość. Aby pokroić na kawałki, użyj nożyczek, aby wykonać nacięcia od obwodu siatkówki aż do nerwu wzrokowego. Alternatywnie, aby wykorzystać całą siatkówkę, wykonaj nacięcia od obwodu w połowie drogi do nerwu wzrokowego. Nacięcia pomogą w wykonaniu płaskiego preparatu.

2. Montaż na hydrofilizowanej membranie PTFE

1. Przygotuj membranę zgodnie z poniższym opisem. Podczas wykonywania zapisów fizjologicznych lub eksperymentów z wstrzykiwaniem barwnika należy skrócić uchwyt za pomocą tokarki lub piły ręcznej tak, aby pozostały pierścień miał wysokość 1 mm.
   Uwaga: Wkładki do płytek hodowlanych mogą być niezmodyfikowane lub zmodyfikowane (rysunek 1A). Wybór konfiguracji jest podyktowany celem eksperymentu. Do barwienia immunologicznego odpowiednia jest niezmodyfikowana wkładka.
2. Wypoleruj szorstkie powierzchnie drobnym papierem ściernym (o ziarnistości 300 lub wyższej).
3. (Opcjonalnie) Zdejmij nóżki pod pierścieniem za pomocą nożyczek.
4. Aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia, przepłucz lub poddaj sonikację membrany w wodzie destylowanej przez 2-3 minuty.
5. Zamontuj tkankę na membranie (ryc. 1A). Umieść tkankę z odrobiną roztworu na błonie za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia. W razie potrzeby odciąć wąską końcówkę pipety, aby uniknąć przywierania próbki tkanki do pipety podczas przenoszenia.
6. Przymocuj siatkówkę za pomocą komórek zwojowych (GC) do góry: na membranie stopniowo usuwaj roztwór, jednocześnie rozprowadzając siatkówkę i rozkładając fałdy za pomocą kleszczy.
7. Po przeciwnej stronie membrany umieścić pustą strzykawkę (1 ml) bezpośrednio pod tkanką. Zastosować ssanie, odciągając tłok do objętości 0,2-0,3 ml. Zwiększyć powierzchnię ssania, przecinając końcówkę przytrzymującą strzykawkę przed użyciem. Tkanka nie wymaga dalszego leczenia adhezji, ponieważ jest fizycznie zaplątana w błonę.

3. Wstrzyknięcie bolusa izolektyny Alexa 488

1. Przygotuj pipety do plastrów i roztwór barwiący. Wyciągnij pipety z plastrem z borokrzemianowego szkła kapilarnego za pomocą ściągacza Flaming/Brown, o rezystancji ~1 MΩ. Delikatnie odłam końcówkę pipety.
2. Przygotować roztwór barwiący, dodając 0,3 μl roztworu podstawowego izolektyny Alexa 488 do 10 μl roztworu Ringera buforowanego przez HEPES opisanego w kroku 1.2.
3. Przenieść próbkę do zestawu patch-clamp w celu wstrzyknięcia (rysunek 1C). Umieścić membranę z dołączoną tkanką w komorze rejestracyjnej wypełnionej podgrzanym (37 °C) i natlenionym, buforowanym przez HEPES roztworem Ringera.
4. Umieść pipetę zawierającą barwnik na wewnętrznej membranie ograniczającej (ILM, rysunek 2A). Za pomocą mikromanipulatora dosuń pipetę do ILM, aż dotrze do niej. Wstrzyknąć roztwór barwiący pod ciśnieniem 10-20 psi przez 1 sekundę za pomocą pikospritzera. Jedno lub wiele miejsc może być przeznaczonych do wstrzyknięcia (ryc. 2B). Jeśli pikospritzer nie jest dostępny, można użyć strzykawki o pojemności 10 ml w celu dostarczenia dodatniego ciśnienia powietrza do wstrzykiwań.
5. Inkubować wstrzykniętą tkankę przez 10 minut. Podczas inkubacji wstrzykniętą tkankę można oglądać w świetle epifluorescencyjnym.
6. Po znakowaniu preparat można zabrać do mikroskopu w celu wykonania badań obrazowych. Przenieś wkładkę do naczynia hodowlanego ze szklanym dnem, kładąc siatkówkę stroną do dołu (Rysunek 1C).
7. Dodaj kroplę roztworu HEPES, aby próbka była wilgotna.
8. Umieść 2-3 plamy smaru próżniowego na obwodzie plastikowego pierścienia, aby mocno przymocować wkładkę do dna naczynia hodowlanego.
9. Przenieś naczynie do stolika mikroskopowego.

4. Wiązanie paraformaldehydu i karbodimidu

1. Utrwalić próbkę, przenosząc wkładkę do utrwalacza na 15 minut. Można zastosować dłuższe lub krótsze czasy utrwalania, w zależności od zastosowania. Oba utrwalacze mogą być skutecznie stosowane do utrwalania GFP, izololektyny lub fluorescencyjnych hydrazydów Alexa (np. używanych do wypełniania komórek w nagraniach patch-clamp).
   Uwaga: Do utrwalenia można użyć 4% roztworów karmodiimidu lub 4% roztworów paraformaldehydu. Aby utrzymać przyczepność, utrwalenie należy wykonać po tym, jak tkanka została już przymocowana do membrany. Tkanka może być unieruchomiona natychmiast po zamontowaniu lub po zapisie fizjologicznym i/lub wstrzyknięciu bolusa.
2. Płukać tkankę w buforze fosforanowym (PB) przez 30 minut. Następnie tkanka może być przetworzona jako całość (krok 5) lub pocięta na pionowe sekcje, a następnie przetworzona (kroki 6 i 7).

5. Barwienie immunologiczne całych wierzchowców siatkówki

1. W 24-dołkowym naczyniu (ryc. 1D) zablokuj kawałki siatkówki na membranie na 1 godzinę w roztworze barwiącym.
2. Rozcieńczyć mysie przeciwciała pierwszorzędowe anty-PSD-95 w stosunku 1:300 w roztworze barwiącym i stosować przez 48 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności. Dodaj ~ 100-150 μl roztworu przeciwciał do każdej studzienki z tkanką. Aby zapobiec wysychaniu, napełnij nieużywane studnie wodą destylowaną.
3. Płukać przez 20 min w PB, 3x.
4. Inkubować przez 24 godziny w przeciwciałie wtórnym anty-mysim Alexa 568 rozpuszczonym w stosunku 1:500 w roztworze barwiącym.
5. Płukać przez 20 min w PB, 3x.
6. Umieść wkładkę z zabarwioną chusteczką na standardowej szalce Petriego o średnicy 3 cm wypełnionej roztworem PB. Małymi nożyczkami wytnij z pierścienia część błony zawierającą siatkówkę.
7. Przenieś siatkówkę na membranę na siatkówkę przesuwaną do góry. Usuń PB, dodaj podłoże montażowe. Umieść małe kawałki potłuczonego szkła nakrywkowego między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, aby uniknąć nadmiernego ściskania i uszkodzenia siatkówki. Umieść szkiełko nakrywkowe.
8. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci. Przechowuj slajdy w ciemności, w lodówce.

6. Pionowe cięcie tkanki zamontowanej na błonie

1. Po utrwaleniu zanurz tkankę na membranie w roztworach gradientu sacharozy 10%, 20% i 30% sacharozy odpowiednio na 30 minut, 1 godzinę i noc. Etap nocny wykonuje się w temperaturze 4 °C w lodówce, wszystkie inne etapy w temperaturze pokojowej.
2. Za pomocą nożyczek usuń membranę z tkanką z plastikowego pierścienia wkładającego.
3. Umieść odciętą membranę na Parafilm siatkówką do góry i usuń jak najwięcej roztworu za pomocą Kimwipes.
4. Umieść Parafilm z tkanką w komorze kriostatu i dodaj kroplę pożywki OCT. Użyj urządzenia do szybkiego zamrażania, aby przyspieszyć zamrażanie.
5. Odłącz zamrożoną próbkę i odwróć ją na drugą stronę.
6. Wyciąć nadmiar zamrożonego OCT. Pozostawić około 2 mm wokół próbki z trzech stron i pozostawić 5-6 mm od strony, która będzie przymocowana do uchwytu.
7. Przykryj odsłoniętą stronę siatkówki (stronę błony) kroplą OCT. Pozostaw obszar mocowania wolny.
8. Zamrozić błonę z tkanką siatkówki. Teraz próbka jest gotowa do umieszczenia na uchwycie do cięcia.
9. Umieść kroplę OCT na zimnym pierścieniu utrwalającym. Natychmiast włóż zamrożoną próbkę do kropli.
10. Wyciąć odcinki o grubości 10-20 μm, ustawiając temperaturę kriostatu na -19 °C. Użyć ciepłych (temperatura pokojowa) szkiełek o przyczepności polisynowej (temperatura pokojowa). Pozostaw szkiełka z dołączonymi sekcjami na platformie grzewczej na ~2-3 minuty (41 °C) w ciemności, aby zapewnić mocne przyleganie sekcji.
11. Włóż szkiełka do pudełka do przechowywania i przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

7. Barwienie immunologiczne odcinków siatkówki

1. Wyjmij szkiełka z sekcjami z zamrażarki. Pozostaw je w temperaturze pokojowej przez 1 minutę, aby usunąć kondensat.
2. Otocz sekcje blokerem cieczy, aby stworzyć barierę dla dalszej inkubacji.
3. Umieść szkiełka w pudełku inkubacyjnym. Przykryj dno pudełka wodą, aby zapobiec parowaniu roztworu przeciwciała.
4. Płukać PB przez 5 min.
5. Przygotuj te same roztwory barwiące i postępuj zgodnie z krokami jak w kroku 5. Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym trwa noc, a z przeciwciałem wtórnym 1 godzina. Nie należy używać potłuczonego szkła między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.

Results

Pokazano tutaj dwa reprezentatywne eksperymenty, które korzystają z zastosowania hydrofilizowanej membrany PTFE do podtrzymywania całej siatkówki podczas procedur barwienia. Pierwszy eksperyment ilustruje metodę szybkiej i prostej charakterystyki unaczynienia siatkówki, skomplikowanej sieci naczyń krwionośnych, które rozciągają się na wiele warstw siatkówki (ryc. 2). Podejście to łączy ładowanie izolektyny w bolusie ze znakowaniem zanurzeniowym za pomocą SRH. Jest to skuteczna metoda znakowania żywej tka...

Discussion

Wysoka biokompatybilność i przezroczystość hydrofilizowanej membrany PTFE w roztworach jest korzystna podczas pracy z żywą tkanką. Preparat ten był z powodzeniem stosowany we wcześniejszych pracach do nagrań patch-clamp odpowiedzi świetlnych^8-10. W tym miejscu pokazujemy, w jaki sposób można zastosować to podejście do analizy statyczno-wytrzymałościowej siatkówki całokształtowej.

Technika ładowania bolusem może być skutecznie stosowana do znakowania żywej tkanki. Technika ta jest ws...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wkładka do hodowli komórkowych Millicell, 12 mm, hydrofilowy PTFE (Biopore), 0,4 μ m	Millipore	PICM01250
Strzykawka insulinowa, 1 ml	Beckton Dickinson	309659
Nożyczki	Fine Science Tools	15003-08	preparacyjne
Dumont #55, inox	Fine Science Tools	11255-20	preparacja
Kriostat,	Leica	różne
systemy mikroskopu konfokalnego	Nikon	różne
Szkło kapilarne	World Precision Instruments	1B150F-4
P-97 Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument Co.
Picospritzer III	Parker Hannifin
Naczynia do hodowli ze szklanym dnem	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
Szalka Petriego	Falcon	1008
Jednorazowe pipety z podziałką	VWR	16001-180
Płytki wielodołkowe, 24-dołkowe	Beckton Dickinson	351147
Szkło nakrywkowe, #1	Mikroskopia elektronowa Nauki	72200-30
Szkiełka adhezyjne polisynowe	Mikroskopia elektronowa Sciences	63412-01
Szkiełka mikroskopowe	Globe	1301
Liquid Blocker	Mikroskopia elektronowa Sciences	71312
Podłoże montażowe VECTASHIELD	Vector Laboratories	H-1000
OCT średnia	Sakura	4583
Parafilm film laboratoryjny	Fisher	13-374-10
Dow Corning smar wysokopróżniowy	Sigma-Aldrich	Z273554
Mouse przeciwciało anty-PSD95	Millipore	MABN68
Osioł anty-mysz Alexa 568	Invitrogen	A10037
Izolektyna Alexa 488	Invitrogen	I21411
Chemiblocker	Chemicon	2170S
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Sulforodamina	Sigma-Aldrich 341738
Karbodimid	Thermo Scientific	22980	EDC
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148