Artykuł metodologiczny

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

DOI:

10.3791/51044

⸱

3 października 2014

 ,  , 
1School of Engineering, University of California, Merced

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt. Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele tkanek, takich jak serca dorosłych ludzi, nie jest w stanie odpowiednio zregenerować się po uszkodzeniu. 2,3 Strategie w inżynierii tkankowej proponują innowacje wspomagające organizm w regeneracji i naprawie. Na przykład, metody TE mogą być w stanie osłabić przebudowę serca po zawale mięśnia sercowego (MI) i prawdopodobnie zwiększyć całkowitą czynność serca do prawie normalnego poziomu sprzed zawału mięśnia sercowego. Podobnie jak w przypadku każdej tkanki funkcjonalnej, skuteczna regeneracja tkanki serca polega na prawidłowym dostarczeniu wielu typów komórek z sygnałami środowiskowymi sprzyjającymi integracji i przeżyciu wszczepionej komórki / przeszczepu tkankowego. Zmodyfikowane tkanki powinny uwzględniać wiele parametrów, w tym: sygnały rozpuszczalne, interakcje między komórkami i materiały matrycowe oceniane jako nośniki dostarczania, ich wpływ na przeżycie komórek, wytrzymałość materiału i ułatwienie organizacji komórka-tkanka. Badania wykorzystujące bezpośrednią iniekcję przeszczepów tylko ignorują te podstawowe elementy. 2,5,6 Projekt tkanki łączącej te składniki nie został jeszcze opracowany. W tym miejscu przedstawiamy przykład zintegrowanych projektów wykorzystujących nakładanie warstw wzorzystych arkuszy komórek z dwoma różnymi typami materiałów pochodzenia biologicznego, zawierających typ komórek narządu docelowego i komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń w "tkance". Chociaż badania te koncentrują się na generowaniu tkanki podobnej do serca, ta konstrukcja tkanki może być stosowana do wielu narządów innych niż serce przy minimalnych zmianach konstrukcyjnych i materiałowych i ma być gotowym produktem do terapii regeneracyjnych. Protokół zawiera pięć szczegółowych kroków. Wrażliwy na temperaturę poli(N-izopropyloakrylaamid) (pNIPAAM) jest używany do powlekania naczyń do kultur tkankowych. Następnie komórki specyficzne dla tkanki są hodowane na powierzchni powlekanych płytek/powierzchni mikrowzorów w celu utworzenia arkuszy komórkowych o silnych zrostach bocznych. Po trzecie, macierz podstawowa jest tworzona dla tkanki poprzez połączenie porowatej macierzy z neowaskularnymi przepuszczalnymi hydrożelami i komórkami śródbłonka. Na koniec arkusze komórek są wyjmowane z naczyń pokrytych pNIPAAM i przenoszone na element podstawowy, tworząc kompletną konstrukcję.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wstrzykiwanie komórek i/lub pojedynczych materiałów samo w sobie wykazało zmienny sukces w innych układach narządów i ograniczony sukces w regeneracji serca. 5,7-12 Obecnie komórki pochodzące z komórek macierzystych są dostarczane do uszkodzonej tkanki przy użyciu różnych metod dostarczania, w tym: bezpośredniego wstrzyknięcia komórek do tkanki i perfuzji do krwiobiegu. 13-17 Inni mają wszczepione same komórki, materiały same i/lub w połączeniu z nośnikami materialnymi, aby pomóc w regeneracji uszkodzonych narządów. 18-21 Ten projekt łączy w sobie wiele strategii, które zapewniają wytrzymałość materiału, wzór w wielu materiałach i wielu typach komórek.

W szczególności, podstawowa akomórkowa matryca włóknista zapewnia podstawową siłę fizyczną konstrukcji, dzięki czemu nadaje się do wszycia w pacjenta, jeśli to konieczne. Puste przestrzenie w macierzy podstawowej są wypełnione komórkami śródbłonka w neowaskularnym permisywnym hydrożelu22 w celu szybkiego unaczynienia wszczepionego konstruktu. Kompozyt ten jest następnie integrowany ze wstępnie wzorzystymi arkuszami komórek, które umożliwiają lepszą komunikację między komórkami, bardziej naśladując tkankę natywną. 1,23-25 Ogólny proces produkcji warstwowego plastra komórkowego przedstawiono na schemacie blokowym na rysunku 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tworzenie płyt pokrytych pNIPAAM

  1. Rozpuścić 2,6 g pNIPAAM w 2 ml 60% roztworu toluenu/40% heksanu.
  2. Podgrzać mieszaninę do temperatury 60 °C przez 10 minut, mieszając, aż do rozpuszczenia pNIPAAM.
  3. Pokrój bibułę filtracyjną w okrąg o średnicy 60 mm i umieść papier w lejku Buchnera.
  4. Przefiltruj roztwór przez lejek Buchnera do wstępnie zważonej szklanej zlewki (nie używaj tworzyw sztucznych, ponieważ heksan stopi tworzywa sztuczne).
  5. Umieścić zlewkę i zawartość w odkurzaczu dzwonowym (24 psi) O/N (16 godzin). Uwaga: Dopóki pozostałość nie zareaguje z izopropylem, ulegnie utlenieniu, więc upewnij się, że nie ma kontaktu z tlenem.
  6. Zważyć zlewkę, aby ustalić masę pNIPAAM.
  7. Dodać alkohol izopropylowy do pNIPAAM, tworząc roztwór 50/50 w/w.
  8. Umieścić 2 ml roztworu na powierzchni płytki do hodowli tkankowej i pokryć przez 5 minut w świetle UV.
  9. Umyj płytkę 2 ml ciepłego PBS dwukrotnie przed użyciem do hodowli komórkowej.

2. Tworzenie arkuszy komórkowych

Uwaga: Arkusze komórek pierwotnych dla narządu docelowego mogą być tworzone przy użyciu wielu różnych metod, lub poprzez powlekanie powierzchni kultur tkankowych polimerem reagującym na termo, jak opisano tutaj. Wstępnie powlekane płyty termoczułe są również oferowane przez wielu dostawców.

Uwaga: Ten protokół dotyczy hodowli przy użyciu szalki 35 mm. Krótko mówiąc, komórki są najpierw inkubowane w temperaturze 37 °C przez co najmniej 24 godziny przy zbiegu, aby ustanowić boczne połączenia między sąsiednimi komórkami. Aby uwolnić arkusze komórek, płytki poddaje się działaniu temperatur poniżej 32 °C. Arkusz komórek jest następnie przenoszony do mocnej podstawowej macierzy włóknistej zawierającej neonaskularny permisywny hydrożel z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych.

  1. Odizoluj populację komórek. Uwaga: Ta metoda jest zależna od indywidualnych procedur wyprowadzania i typu komórek. W tym przykładzie użyto komórek mięśni gładkich aorty szczura (RASMC). Są to pierwotne komórki mięśni gładkich wyizolowane z aorty brzusznej szczura.
  2. Umyj komórki 2 ml ciepłego PBS.
  3. Dodaj 3 ml trypsyny (lub innego roztworu rozszczepiającego/oddzielającego) do komórek przez 5 minut.
  4. Zahamować działanie trypsyny przez dodanie 3 ml pożywki hodowlanej lub roztworu buforu fosforanowego (PBS) zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
  5. Zebrać komórki w stożkowej probówce i odliczyć podwielokrotność.
  6. Wiruj komórki z prędkością 1 000 obr./min (228 x g) przez 5 minut.
  7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w ich pożywce wzrostowej (do RASMC stosuje się pożywkę hodowlaną SmGM2 plus bullet kit).
  8. Umieść pożywkę zawierającą komórki na termoczułej płytce o średnicy 35 mm – płytce pokrytej pNIPAAM w stężeniu, które pozwoli osiągnąć 100% zbieżność. Uwaga: W przypadku RASMC liczba ta została określona na 100 000 komórek/cm2. Jednak ze względu na utratę komórek podczas przechodzenia, 120% tej wartości jest wykorzystywane.
  9. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C O/N. Uwaga: Ważne jest, aby utrzymać komórki w temperaturze 37 °C, aby utrzymać przyleganie komórek do płytki.

3. Przygotowanie Matrycy Podstawowej

Uwaga: Różne matryce włókniste 3D mogą być używane do nakładania mocnych matryc włóknistych między delikatne arkusze komórek. Oto kilka przykładów: pianka żelowa, bioszkło, naturalne materiały akomórkowe26 lub materiały nanoprzędzone27,28 Macierz pęcherza moczowego świń (UBM) wykorzystana w tych badaniach została hojnie dostarczona przez naszego współpracownika, dr Badylaka. 29

  1. Przed użyciem określ charakterystykę macierzy, w tym brak zawartości komórkowej, jeśli używana jest matryca bezkomórkowa, 27,28 specyficzną żywotność komórki i pustą przestrzeń. 22 Rozdział 22
  2. Wytnij wstępnie wysterylizowaną matrycę do pożądanego rozmiaru i kształtu. Uwaga: W tym przypadku dziurkacz służy do wycinania koła o średnicy 4 mm.

4. Umieszczanie komórek śródbłonka w neowaskularnym permisywnym hydrożelu

Uwaga: Komórki śródbłonka mogą być pozyskiwane z różnych źródeł, w tym z różnicowania z komórek macierzystych lub progenitorowych. W tym przypadku stosowane są HuVEC.

  1. Używaj dowolnego dopuszczalnego hydrożelu (fibryny, żeli kolagenowych), o ile czas sieciowania jest wystarczająco krótki, aby komórki pozostały żywotne. Uwaga: W tym przypadku stosuje się żel na bazie hialuronianu (HA) usieciowany mostkiem dwusiarczkowym.
  2. Hydrożel HA należy przygotować zgodnie z protokołem zakładowym.
  3. Zbierz komórki śródbłonka i rozprosz się w roztworze jednokomórkowym za pomocą 1x trypsyny. Uwaga: Accutase lub bufor dysocjacyjny komórek może być również używany do dyspersji pojedynczych komórek.
  4. Dezaktywować enzym trypsyny za pomocą równej ilości inhibitora trypsyny sojowej (jeśli ważne jest, aby komórki nie miały kontaktu z surowicą) lub 10% FBS w PBS, zbierając roztwór/komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  5. Policz komórki i oblicz objętość potrzebną do wymiarów łaty (wcześniej określonych ilościowo). Uwaga: W przypadku plastra o średnicy 4 mm stosuje się tutaj 2 miliony komórek śródbłonka.
  6. Wyekstrahuj 2 miliony komórek i umieść w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  7. Wirować z prędkością (228 x g) przez 5 min.
  8. Odessać supernatant, pozostawiając komórki w postaci osadu w stożkowej probówce.
  9. Wymieszaj płynne materiały HA i żelatynę w proporcji 1:1. Następnie dodaj 80% całkowitej objętości do stożkowej rurki zawierającej osad.
  10. Zawiesić komórki śródbłonka w mieszaninie 1:1 HA / żelatyna
  11. Umieść zawieszone komórki w mieszaninie HA / żelatyny w podstawowej matrycy włóknistej z kroku 2.
  12. Dodaj 1/5 (20 procent) całkowitej objętości pożądanej przez urządzenie sieciujące
  13. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.

5. Izolacja arkuszy komórek

  1. Wyjąć z inkubatora płytki o średnicy 35 mm zawierające komórki poddane działaniu pNIPAAM i umieścić w kapturze do hodowli komórkowych w temperaturze pokojowej.
  2. Szybko odessać pożywkę z komórek i dodać 2 ml 6% normalnej żelatyny, która została podgrzana do temperatury 37 °C.
  3. Gdy żelatyna jest jeszcze ciepła, umieść metalową siatkę w żelatynie, zanurzając ją pod powierzchnią normalnej żelatyny (film 1).
  4. Umieść całą płytkę na lodzie na 5 do 7 minut, pozwalając żelatynie stwardnieć.
  5. Po 7 minutach za pomocą szpatułki ostrożnie oddziel brzegi żelatyny od boku płytki, a następnie za pomocą kleszczy podnieś metalową kratę z płytki Uwaga: 6% żelatyny i arkusz komórek powinny unosić się wraz z siatką.
  6. Przenieś arkusz komórek do naczynia i umieść na wierzchu podstawowej kombinacji włóknistej matrycy i hydrożelu, ostrożnie ustawiając siatkę na wierzchu konstrukcji. Uwaga: Wierzchołkowa strona arkusza komórek będzie nadal znajdować się w górnej pozycji.
  7. Dodać 2 ml ciepłej pożywki (37 °C).
  8. Inkubować O/N, pozwalając arkuszowi komórek przylegać do powierzchni hydrożelu.
  9. Usuń metalową siatkę po ogrzaniu roztworu (około 1 godziny) lub następnego dnia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diagram przepływu (Rysunek 1) pokazuje ogólną metodę tworzenia wielowarstwowej łatki. Arkusze komórek odłącza się od płytki poddanej obróbce pNIPAAM poprzez obniżenie temperatury poniżej 32 °C. Następnie arkusz komórek umieszcza się na usieciowanym hydrożelu zawierającym komórki śródbłonka zasiane w leżącej poniżej macierzy włóknistej (ryc. 1). Wstępnie obrobione płyty termoczułe mogą być również używane do tworzenia arkuszy komórek. Specjalne powierzchnie topologiczne są używane do spec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne kroki w protokole obejmują: powlekanie powierzchni płyt termoczułym polimerem i manipulowanie arkuszami komórek po schłodzeniu płyt. Ponieważ różne ogniwa wykazują różne właściwości fizyczne, takie jak przyczepność, czas podnoszenia powinien być zoptymalizowany dla każdego typu ogniwa. Drugi i najbardziej wymagający element tego protokołu koncentruje się na manipulacji arkuszem komórek, krytycznym aspekcie metod składania tkanek. Pojedyncza warstwa komórek w arkuszu komórek jest dość delikatna i może się łatwo ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez New Faculty Award II od California Institute of Regenerative Medicine (CIRM; RN2-00921-1), finansowana przez NIH National Research Award (F32-HL104924) oraz CIRM Training Grant (TG21163). Materiały dostarczyli: Glycosan Biosystems Inc / BioTime oraz dr Stephen Badylak (University of Pittsburgh)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
Calcein-AMInvitrogenC3099Cell tracker / live dye
Lysotracker RedInvitrogenL7528Cell tracker
Neutral RedSigmaN7005Visible Cell barwnik
pNIPAAMSigma Aldrich412780250Poly(N-izopropylacrylamid)
ToluenSigma Aldrich244511-1L
HexaneSigma Aldrich296090-1L
RAOSMCLonzaR-ASM-580Szczurze komórki mięśni gładkich aorty
SmGM2LonzaCC-4149Media do mięśni gładkich
HUVECInvitrogenC-003-5CLudzkie komórki śródbłonka żylnego
HyStemGlikozan/ Biotime
Alkohol izopropylowyVWR InternationalBDH1133-4LP
TrypsynaCorning Cellgro25-053-C1
PBSGibco14287-072
FBSGibco16140-071
Specjalistyczne wyposażenie
Bibuła filtracyjnaAhlstrom 6310-0900 
Lejek Buchnera Sigma Aldrich Z247308 
Płyty UpCell Nut 2014-11 
Światło UVJelight Company Środek czyszczący UVO Model nr 42

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ohashi, K., Okano, T. Functional tissue engineering of the liver and islets. Anat Rec (Hoboken). 297, 73-82 (2014).
  2. Chen, Q. Z., Harding, S. E., Ali, N. N., Lyon, A. R., Boccaccini, A. R. Biomaterials in cardiac tissue engineering: Ten years of research survey. Mat Sci Eng R. 59, 1-37 (2008).
  3. Jakob, P., Landmesser, U. Current status of cell-based therapy for heart failure. Curr Heart Fail Rep. 10, 165-176 (2013).
  4. Tongers, J., Losordo, D. W., Landmesser, U. Stem and progenitor cell-based therapy in ischaemic heart disease: promise, uncertainties, and challenges. Eur Heart J. 32, 1197-1206 (2011).
  5. Etzion, S., et al. Influence of embryonic cardiomyocyte transplantation on the progression of heart failure in a rat model of extensive myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 33, 1321-1330 (2001).
  6. Masuda, S., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering for heart tissue repair. Adv Drug Deliv Rev. 60, 277-285 (2008).
  7. Koh, G. Y., Soonpaa, M. H., Klug, M. G., Field, L. J. Strategies for myocardial repair. J Interv Cardiol. 8, 387-393 (1995).
  8. Li, R. K., et al. Construction of a bioengineered cardiac graft. J Thorac Cardiovasc Surg. 119, 368-375 (2000).
  9. Muller-Ehmsen, J., et al. Rebuilding a damaged heart: long-term survival of transplanted neonatal rat cardiomyocytes after myocardial infarction and effect on cardiac function. Circulation. , 105-1720 (2002).
  10. Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. , 100-193 (1999).
  11. Roell, W., et al. Cellular cardiomyoplasty improves survival after myocardial injury. Circulation. 105, 2435-2441 (2002).
  12. Soonpaa, M. H., et al. Potential approaches for myocardial regeneration. Ann N Y Acad Sci. 752, 446-454 (1995).
  13. Akins, R. E. Can tissue engineering mend broken hearts. Circ Res. 90, 120-122 (2002).
  14. Goodell, M. A., et al. Stem cell plasticity in muscle and bone marrow. Ann N Y Acad Sci. 938, 208-218 (2001).
  15. Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
  16. Murry, C. E., Wiseman, R. W., Schwartz, S. M., Hauschka, S. D. Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis. J Clin Invest. 98, 2512-2523 (1172).
  17. Orlic, D., et al. Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice. Ann N Y Acad Sci. 938, 221-229 (2001).
  18. Elia, R., et al. Silk-hyaluronan-based composite hydrogels: a novel, securable vehicle for drug delivery. J Biomater Appl. 27, 749-762 (2013).
  19. Kai, D., et al. Stem cell-loaded nanofibrous patch promotes the regeneration of infarcted myocardium with functional improvement in rat model. Acta Biomater. , (2014).
  20. Hong, H. J., et al. Tracheal reconstruction using chondrocytes seeded on a poly(l-lactic-co-glycolic acid)-fibrin/hyaluronan. J Biomed Mater Res A. , (2014).
  21. Serpooshan, V., et al. The effect of bioengineered acellular collagen patch on cardiac remodeling and ventricular function post myocardial infarction. Biomaterials. 34, 9048-9055 (2013).
  22. Turner, W. S., et al. Cardiac tissue development for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial and cardiac cells in natural matrices. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 2060-2072 (2012).
  23. Sato, M., Yamato, M., Hamahashi, K., Okano, T., Mochida, J. Articular cartilage regeneration using cell sheet technology. Anat Rec (Hoboken). 297, 36-43 (2014).
  24. Sawa, Y., Miyagawa, S. Present and future perspectives on cell sheet-based myocardial regeneration therapy. Biomed Res Int. 2013, 583912(2013).
  25. Demirbag, B., Huri, P. Y., Kose, G. T., Buyuksungur, A., Hasirci, V. Advanced cell therapies with and without scaffolds. Biotechnol J. 6, 1437-1453 (2011).
  26. Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol Med. 17, 424-432 (2011).
  27. Badylak, S. F., et al. The use of extracellular matrix as an inductive scaffold for the partial replacement of functional myocardium. Cell Transplant. 15, Suppl 1. S29-S40 (2006).
  28. Wang, Y., et al. Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds. Hepatology. 53, 293-305 (2011).
  29. Gilbert, T. W., et al. Collagen fiber alignment and biaxial mechanical behavior of porcine urinary bladder derived extracellular matrix. Biomaterials. 29, 4775-4782 (2008).
  30. Luna, J. I., et al. Multiscale biomimetic topography for the alignment of neonatal and embryonic stem cell-derived heart cells. Tissue Eng Part C Methods. 17, 579-588 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tissue EngineeringCell SheetspNIPAAM CoatingFibrous Matrix HydrogelEndothelial CellsRat Aortic Smooth Muscle CellsLight MicroscopyCell Sheet TransferHydrogel CrosslinkingThermo Sensitive Polymer

Powiązane artykuły