Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Migracja jest kluczową właściwością żywych komórek i ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego rozwoju, odpowiedzi immunologicznej i procesów chorobowych, takich jak przerzuty raka i stany zapalne. Metody badania migracji komórek są bardzo przydatne i ważne dla szerokiego zakresu badań biomedycznych, takich jak biologia nowotworów, immunologia, biologia naczyniowa, biologia komórki i biologia rozwoju. Tutaj używamy migracji i inwazji komórek nowotworowych jako przykładu i opisujemy dwa powiązane testy, aby zilustrować powszechnie stosowane, łatwo dostępne metody pomiaru tych procesów. Pierwszą metodą jest test zamykania ran w hodowli komórkowej, w którym na zlewającej się monowarstwie komórki generowana jest rysa. Szybkość zamykania się ran i migracji komórek można określić ilościowo, wykonując zdjęcia migawkowe za pomocą zwykłego mikroskopu odwróconego w kilku odstępach czasu. Bardziej szczegółowe zachowanie migracji komórek można udokumentować za pomocą systemu mikroskopii poklatkowej. Drugą metodą opisaną w tym artykule jest test migracji i inwazji komórek transwell, który mierzy zdolność ruchliwości i inwazyjności komórek w kierunku gradientu chemoatraktantu. Naszym celem jest opisanie tych metod w sposób przystępny, tak aby procedury mogły być z powodzeniem wykonywane w laboratoriach badawczych nawet przy podstawowej konfiguracji biologii komórki.
Wprowadzenie
Ruchliwość jest istotną cechą żywych komórek. Migracja komórek bierze udział w poczęciu życia, rozwoju embrionalnym, odpowiedzi immunologicznej i wielu procesach patologicznych, takich jak przerzuty raka i stan zapalny1-9. Dlatego metody badania zachowań migracyjnych komórek są bardzo przydatnymi narzędziami badawczymi dla szerokiego zakresu dyscyplin nauk biomedycznych, biologii, bioinżynierii i dziedzin pokrewnych.
Badanie migracji komórek w badaniach nad rakiem jest szczególnie interesujące, ponieważ główna przyczyna zgonów u pacjentów z rakiem jest związana z progresją przerzutów. Aby rak mógł się rozprzestrzeniać i rozprzestrzeniać w całym ciele, komórki rakowe muszą migrować i atakować przez macierz zewnątrzkomórkową (ECM), wewnątrznaczynić do krwiobiegu, przyczepiać się do odległego miejsca, a na końcu wynaczynić, tworząc odległe ogniska1,10-12. Do szczegółowego zbadania tych zdarzeń można zastosować różne metody biologiczne. Zamykanie ran w hodowlach komórkowych oraz testy migracji i inwazji transwelli są szeroko stosowane w środowisku naukowym1,10. Testy te mogą dostarczyć niezbędnych danych, które mogą pozwolić zrozumieć, jak dobrze dany typ komórek może spontanicznie migrować lub reagować na chemoatraktant i kierunkowo migrować w jego kierunku. Opisano kilka fenotypów wędrownych. Komórki mogą migrować w formie pojedynczej komórki, takiej jak obserwowana w ruchu mezenchymalnym lub podobnym do ameboidu lub w ruchu wielokomórkowym zwanym migracją zbiorową lub strumieniowaniem komórek13. Metodę ruchu zastosowaną w komórkach ruchliwych można łatwo zaobserwować za pomocą testu zamykania ran w hodowli komórkowej.
Wśród licznych sposobów badania migracji komórek, test zamykania ran komórkowych jest jednym z najprostszych. Ta metoda jest przydatna do określenia zdolności migracyjnej całych mas komórek. Idąc o krok dalej, można go wykorzystać do obserwacji cech morfologicznych poszczególnych komórek podczas migracji14. Po analizie zamknięcia rany może ujawnić się wiele fenotypów. Pomiar zamkniętej odległości w czasie w porównaniu z grupą kontrolną może ujawnić specyficzne zmiany migracyjne lub upośledzony fenotyp migracyjny, który był wcześniej nieznany. Co więcej, tworzenie się blaszek jednokomórkowych, cofanie ogona i ruch kierunkowy mogą dać wskazówki na temat tego, co może być upośledzone lub wzmocnione w komórkach będących przedmiotem zainteresowania14.
Testy migracji i inwazji transwell mogą być używane do analizy zdolności pojedynczych komórek do kierunkowego reagowania na różne chemo-atraktanty, niezależnie od tego, czy są to chemokiny, czynniki wzrostu, lipidy czy nukleotydy4,5,8,15,16. Może również oceniać zróżnicowaną zdolność migracyjną spowodowaną nadmierną ekspresją receptora1,14. Testy te mogą być również wykorzystane do identyfikacji i scharakteryzowania kluczowych regulatorów migracji komórek, takich jak rodzina Rho małych GTPaz2. Po tych krótkich i łatwo dostępnych testach można również określić sposób migracji komórek i zdolność komórki do inwazji na matrycę 3D.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Test zamykania ran w hodowli komórkowej
- Odłącz komórki od płytki do hodowli tkankowej za pomocą 0,25% roztworu trypsyny-EDTA. Osad komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przez odwirowanie, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej. Umieść odpowiednią liczbę komórek na 6-dołkowej płytce, aby uzyskać 100% konfluencję w ciągu 24 godzin.
Uwaga: Mogą być konieczne testy w celu określenia czasu i liczby komórek, aby osiągnąć 100% zbieżność ze względu na typ komórki i wielkość używanej studzienki (na przykład 1 x 106 komórek czerniaka B16F10 wysiewa się w studzience 6-dołkowej płytki 24 godziny przed generacją rany). Alternatywnie można użyć płytek 12-dołkowych lub 24-dołkowych.
Uwaga: Jeśli jest to możliwe, komórki można wysiać do wkładki hodowlanej (firmy ibidi LLC) na poddanej działaniu metody hodowli tkankowej, dzięki czemu rana jest wstępnie odlewana. Wkładka hodowlana może chronić powierzchnię płytki do hodowli tkankowej przed uszkodzeniem przez końcówkę pipety. Jeśli używana jest wkładka kulturowa, należy pominąć krok 1.2. - W sterylnym środowisku (zazwyczaj kaptur bezpieczeństwa biologicznego) użyj końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby mocno docisnąć do górnej części płytki do hodowli tkankowej i szybko wykonaj pionowe nawinięcie w dół przez monowarstwę komórki. Można użyć końcówki do pipety o innym rozmiarze, aby uzyskać pożądany rozmiar rany. Nie należy używać nadmiernej siły doczepianej końcówki pipety do hodowli tkankowej, ponieważ może to uszkodzić powierzchnię. Jeśli rana jest wstępnie zagipsowana, ten krok można pominąć.
- Ostrożnie zassać pożywkę i resztki komórek. Powoli dodaj wystarczającą ilość pożywki hodowlanej do ściany studzienki, aby przykryć dno studzienki i uniknąć odłączania dodatkowych komórek. Po wytworzeniu i oględzinach rany należy wykonać wstępne zdjęcie. Umieścić płytkę do hodowli tkankowej w inkubatorze ustawionym na odpowiednią temperaturę i stężenie CO2 (zwykle 37 °C i 5% CO2 ).
- W kilku momentach, np. co 3 godziny, wyjmuj płytkę z inkubatora i umieszczaj ją pod mikroskopem odwróconym, aby wykonać migawkę i sprawdzić, czy rana się zamknęła. Jeśli dostępna jest mikroskopia poklatkowa, rób zdjęcie co X minut (zwykle zaczynając od co 5 minut) przez dowolny czas w komorze o kontrolowanej temperaturze i CO2 . W zależności od typu ogniwa czas zamykania rany może się różnić.
- Aby przeanalizować wyniki zdjęć migawkowych, zmierz odległość jednej strony rany od drugiej za pomocą podziałki liniowej. Przeanalizuj i przejrzyście przedstaw zamykanie się ran w czasie za pomocą wykresu punktowego lub wykresu słupkowego, np. Rysunek 1.
- Aby przeanalizować zdjęcia poklatkowe, zaimportuj je do oprogramowania ImageJ (dostępnego bezpłatnie pod adresem http://rsb.info.nih.gov/ij/), aby nagrać wideo. Aby to zrobić, otwórz ImageJ, kliknij Plik, Importuj i Sekwencja obrazów. Znajdź plik ze zdjęciami; Kliknij pierwsze zdjęcie w pliku. Zapisz wideo, wybierając Plik, Zapisz jako i AVI. Można zaobserwować pojedyncze migrujące komórki, aby scharakteryzować ruch kierunkowy. Ponadto można również badać cechy morfologiczne, takie jak tworzenie się blaszek i cofanie się krawędzi spływu (ryc. 2 i film uzupełniający).
2. Test migracji i inwazji komórek Transwell
- W sterylnym środowisku (zazwyczaj kaptur bezpieczeństwa biologicznego) odłącz komórki od płytki do hodowli tkankowej za pomocą nieenzymatycznego bufora dysocjacyjnego komórek lub 0,25% roztworu trypsyny-EDTA, osadź komórki przez odwirowanie i odessaj istniejące podłoże opuszczające granulowane komórki. Ponownie zawiesić komórki w pożywce do hodowli komórek wolnych od surowicy zawierającej 0,1% BSA (albumina surowicy bydlęcej).
Uwaga: W zależności od badanej linii komórkowej 0,25% trypsyny-EDTA może wpływać na migrację i inwazję komórek z powodu rozszczepienia różnych receptorów na powierzchni komórki17,
Uwaga: Liczba komórek na ml zależy od wielkości komórek. Mogą być potrzebne dalsze testy, aby znaleźć gęstość wysiewu, która zapewnia najlepsze wyniki. Zazwyczaj 1 x 106 komórek/ml jest dobrym punktem wyjścia dla większości typów komórek podczas korzystania z 24-dołkowej wkładki transwell. Istnieje szereg rozmiarów wkładek transwell, a liczba dodawanych komórek powinna być odpowiednio dostosowana. - Umieścić 100 μl roztworu komórkowego na membranie filtracyjnej we wkładce transwell i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby umożliwić komórkom ustabilizowanie się.
Uwaga: Konkretna wielkość porów zastosowanej membrany transwell zależy od indywidualnej wielkości komórek w próbce. Na przykład, jeśli komórki są zbyt małe, mogą przejść przez pory bez konieczności ułatwiania migracji lub jeśli są zbyt duże, mogą nie zmieścić się w porach. Istnieje kilka wkładek transwell o rozmiarach porów w zakresie od 3 μm, 5 μm i 8 μm do testów migracji komórek. Wkładki transwell są dostępne w handlu w firmach takich jak Corning.
Uwaga: Test migracji transwell można łatwo zmodyfikować w celu przeprowadzenia testu inwazji komórek. Aby to zrobić, dodaj materiały macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na wierzchu membrany transwell, a następnie dodaj komórki na wierzchu ECM. Na przykład Matrigel rozmraża się i upłynnia na lodzie, a następnie 30-50 μl Matrigelu dodaje się do 24-dołkowej wkładki transwell i zestala w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 15-30 minut, tworząc cienką warstwę żelu. Roztwór komórkowy dodaje się na wierzch powłoki Matrigel, aby symulować inwazję przez macierz zewnątrzkomórkową.
Uwaga: Istnieją wyraźne różnice między testami migracji komórek transwell a testami inwazji komórek transwell. Test migracji komórek transwell mierzy zdolność chemotaktyczną komórek w stosunku do chemoatraktantu. Test inwazji komórek transwell mierzy jednak zarówno chemotaksję komórek, jak i inwazję komórek przez macierz zewnątrzkomórkową, proces, który jest powszechnie spotykany w przerzutach raka lub rozwoju embrionalnym. - Za pomocą pipety bardzo ostrożnie dodaj 600 μl pożądanego chemoatraktantu na dno dolnej komory na 24-dołkowej płytce. Dodaj chemo-atraktant bez przesuwania wkładki transwell i unikaj generowania pęcherzyków. Upewnij się, że ciecz chemoatraktantyczna w dolnej studzience styka się z membraną w górnej studzience, tworząc gradient chemotaktologiczny. Czas inkubacji zależy od typu komórki i stosowanego chemoatraktantu.
Uwaga: W celu określenia okresu inkubacji mogą być konieczne dalsze badania.
Uwaga: W przypadku komórek przylegających, migrowane komórki przyczepią się do drugiej strony błony1,8. Oznaczanie ilościowe migrowanych komórek można przeprowadzić zgodnie z krokami od 2.4 do 2.8 (kroki 2.4-2.8 nie muszą być wykonywane w sterylnym środowisku). W przypadku komórek nieprzylegających migrowane komórki wpadną do pożywki w dolnej komorze. Liczbę migrowanych komórek można policzyć za pomocą hemocytometru lub cytometru przepływowego5. - Wyjmij wkładkę transwell z płyty. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką tyle razy, ile to konieczne, aby ostrożnie usunąć podłoże i pozostałe komórki, które nie migrowały z górnej części membrany, nie uszkadzając jej.
- Dodaj 600-1,000 μl 70% etanolu do dołka na 24-dołkowej płytce. Umieść wkładkę transwell w 70% etanolu na 10 minut, aby umożliwić utrwalenie komórek. Wyjmij wkładkę transwell z płytki 24-dołkowej i użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby usunąć pozostały etanol z górnej części membrany. Pozostaw membranę transwell do wyschnięcia (zwykle 10-15 minut).
- Dodaj 600-1,000 μl 0,2% fioletu krystalicznego do dołka 24-dołkowej płytki i umieść w niej membranę w celu barwienia. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut.
- Delikatnie usuń fiolet krystaliczny z górnej części membrany za pomocą końcówki pipety lub aplikatora z bawełnianą końcówką. Bardzo ostrożnie, aby uniknąć zmycia utrwalonych komórek, zanurz membranę w wodzie destylowanej tyle razy, ile potrzeba, aby usunąć nadmiar fioletu krystalicznego. Pozostaw membranę transwell do wyschnięcia.
- Spójrz pod odwrócony mikroskop i policz liczbę komórek w różnych polach widzenia, aby uzyskać średnią sumę komórek, które migrowały przez błonę w kierunku chemoatraktantu i przyczepiły się na spodniej stronie błony (ryc. 3).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawione tutaj badanie zamykania rany (wound closure assay) oraz badanie migracji komórek w systemie transwell zostały przeprowadzone z wykorzystaniem komórek czerniaka mysiego B16F10 jako modelu badawczego. W badaniu zamykania rany komórki B16F10 wysiano na 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej i inkubowano do osiągnięcia 100% konfluencji w ciągu 24 godzin. Za pomocą końcówki pipety wykonano ranę o szerokości około 700 µm, a proces zamykania rany (migrację komórek) rejestrowano przy użyciu mikroskopii time-lapse. A...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Migracja komórek jest ważnym aspektem do zbadania w badaniach nad rakiem i może być również zastosowana w badaniach rozwojowych, immunologicznych i gojenia ran. Test zamykania ran w hodowli komórkowej oraz testy migracji i inwazji komórek transwell ujawniają szczegółowe informacje na temat zachowań migracyjnych komórek i mogą być wykorzystane do zbadania molekularnych mechanizmów migracji komórek1,2,10,14. W naszym badaniu wykorzystaliśmy te testy ruchliwości komórek do określenia prędkości migracji i zdolnośc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy dziękują Mike'owi Mylesowi, Samowi Saundersowi i C.W. Eltonowi z ECU Multimedia & Technology Services za pomoc w produkcji wideo. Dziękujemy za wsparcie grantowe ze strony North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association oraz ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. i M.J.R.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsyna EDTA 0,25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Krystaliczny fiolet | Sigma | C0775-100G | Rozpuszczony w wodzie w stężeniu 0,2% |
| Bufor dysocjacyjny komórek | Gibco | 13151-014 | |
| Inkubator kultur komórkowych | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| Kaptur bezpieczeństwa biologicznego SterilGARD | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| Mikroskop odwrócony EVOS Fl | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Płytka do hodowli tkankowej | Becton Dickinson | 353046 | Numer katalogowy różni się w zależności od rodzaju płytki hodowlanej |
| Wkładka Corning Transwell | Fisher | 07-200-150 | Numer katalogowy różni się w zależności od wielkości porów membrany |
Bibliografia
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Peter, C., et al. Migration to apoptotic "find-me" signals is mediated via the phagocyte receptor G2A. J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).
- Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).
- Buul, J. D., Hordijk, P. L. Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).
- Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis. 228 (4), 606-616 (2003).
- Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A. Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).
- Albini, A. Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms. Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).
- Fidler, I. J. Critical determinants of metastasis. Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).
- Zhang, Y., et al. Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells. Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).
- Junger, W. G. Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis. Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).
- Lazennec, G., Richmond, A. Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation. Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (2010).
- Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).
- Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
