Symulacja neuroplastyczności trzustki: test plastyczności podwójnych neuronów in vitro

Podsumowanie

Plastyczność neuronalna jest coraz bardziej rozpoznawaną, ale niedostatecznie poznaną cechą przewodu pokarmowego (GI). Tutaj, na przykładzie zaburzeń trzustki u człowieka, przedstawiamy test neuroplastyczności in vitro do badania plastyczności neuronalnej w przewodzie pokarmowym zarówno na poziomie morfologicznym, jak i funkcjonalnym.

Streszczenie

Neuroplastyczność jest nieodłączną cechą jelitowego układu nerwowego i unerwienia przewodu pokarmowego (GI) w warunkach patologicznych. Jednak patofizjologiczna rola neuroplastyczności w zaburzeniach przewodu pokarmowego pozostaje nieznana. Nowatorskie modele eksperymentalne, które umożliwiają symulację i modulację neuroplastyczności przewodu pokarmowego, mogą umożliwić lepsze zrozumienie wpływu neuroplastyczności w szczególności choroby przewodu pokarmowego, takie jak rak trzustki (PCa) i przewlekłe zapalenie trzustki (CP). W tym artykule przedstawiono protokół symulacji neuroplastyczności trzustki w warunkach in vitro z wykorzystaniem neuronów zwojów korzenia grzbietowego (DRG) i splotu mięśniowo-jelitowego (MP) nowonarodzonych szczurów. To podejście oparte na dwóch neuronach nie tylko pozwala na monitorowanie neuroplastyczności zarówno wewnętrznej, jak i zewnętrznej, ale także stanowi cenne narzędzie do oceny morfologii neuronów i gleju oraz elektrofizjologii. Ponadto umożliwia funkcjonalną modulację dostarczanych treści mikrośrodowiskowych w celu badania ich wpływu na neuroplastyczność. Po ustaleniu, obecny test neuroplastyczności ma potencjał, aby można go było zastosować do badania neuroplastyczności w dowolnym narządzie żołądkowo-jelitowym.

Wprowadzenie

Zmiany w morfologii i gęstości nerwów przewodu pokarmowego (GI) od dawna przyciągają uwagę gastroenterologów i patologów, ale ich znaczenie dla patofizjologii chorób przewodu pokarmowego pozostaje nieznane^1-3. Rzeczywiście, kilka bardzo powszechnych zaburzeń przewodu pokarmowego, takich jak zapalenie żołądka, refluksowe zapalenie przełyku, zapalenie jelita grubego, zapalenie uchyłków i zapalenie wyrostka robaczkowego, wiąże się ze zwiększoną gęstością unerwienia w obszarach tkanek objętych stanem zapalnym¹. Jednak do tej pory nie poświęcono prawdziwej uwagi mechanizmom i znaczeniu neuroplastyczności w przewodzie pokarmowym. Czy zmienione morfologicznie nerwy przewodu pokarmowego różnią się od prawidłowych nerwów przewodu pokarmowego, czyli prawidłowego stanu jelitowego układu nerwowego, pod względem ich funkcji? Jakie są implikacje zmienionej zawartości neuropeptydu/neuroprzekaźnika w plastikowych nerwach jelitowych? Czy neuroplastyczność obwodowa zawsze pociąga za sobą zmienioną sygnalizację do ośrodkowego układu nerwowego? A gdzie są centralne projekcje plastycznych zewnętrznych ścieżek neuronowych przewodu pokarmowego? Długa seria takich kluczowych pytań może być łatwo wygenerowana, gdy spojrzymy na niedostatek naszej wiedzy na temat funkcjonalnych aspektów neuroplastyczności przewodu pokarmowego.

Badanie neuroplastyczności przewodu pokarmowego na poziomie funkcjonalnym wymaga wiarygodnych, powtarzalnych i wciąż łatwych do zastosowania modeli eksperymentalnych. W erze rosnącej popularności i akceptacji genetycznie modyfikowanych warunkowych modeli myszy (GECoMM), takie ustawienia in vivo mają potencjał, aby wyjaśnić nieznane wcześniej aspekty neuroplastyczności przewodu pokarmowego w realistyczny sposób¹. Jednak projektowanie i produkcja GECoMM pozostaje kosztowne, pracochłonne, a przede wszystkim czasochłonne. Ponadto wymagają one warunkowej modulacji a priori celu u genetycznie zmienionej myszy (np. transgeniczna nadekspresja czynnika wzrostu nerwów / NGF w komórkach nabłonka jelitowego). W związku z tym, aby zaprojektować udany GECoMM, naukowcy potrzebują pewnych wskaźników (np. wcześniejszych danych eksperymentalnych) wartościowego celu, tj. że można oczekiwać, że cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania (w tym przypadku NGF) będzie przynajmniej wywierać pewien biologicznie istotny wpływ na nerwy przewodu pokarmowego.

Takie wskaźniki można łatwo wyprowadzić z odpowiednich modeli in vitro, w których izolowane podtypy komórek ze złożonego mikrośrodowiska systemu in vivo mogą być selektywnie kohodowane w sposób heterotypowy^4-7. Modulacja celów molekularnych w takich heterotypowych warunkach hodowli jest średnio technicznie mniej kłopotliwa, szybsza, a zatem może pomóc we wstępnym filtrowaniu wartościowych celów do weryfikacji w badaniach in vivo.

Niedawno zaprezentowaliśmy test neuroplastyczności in vitro, który miał na celu symulację zwiększonej gęstości neuronalnej i przerostu nerwów wewnątrztrzustkowych w tkankach ludzkiego raka trzustki (PCa) i przewlekłego zapalenia trzustki (CP). W tym przypadku neurony pochodzące ze zwojów korzenia grzbietowego nowonarodzonego szczura (DRG) lub splotu mięśniowo-jelitowego (MP) wystawiono na działanie ekstraktów tkankowych z chirurgicznie wyciętych próbek tkanek PCa lub CP i porównano z tymi hodowanymi w normalnych ekstraktach tkankowych ludzkiej trzustki (NP)⁵. Zamiast ekstraktów tkankowych można również użyć supernatantów linii komórkowych do badania wpływu wybranych typów komórek na neuroplastyczność. W połączeniu ze standaryzowanym pomiarem morfometrycznym, przedstawiony test neuroplastyczności pozwala na prawidłową i powtarzalną ocenę plastyczności neuronów w odpowiedzi na różne mikrośrodowiska trzustki. W szczególności umożliwia symulację 1) neuroplastyczności morfologicznej, tj. zmian w przeroscie neurytów, wzorze rozgałęzień i wielkości neuronów, oraz 2) neuroplastyczności funkcjonalnej, tj. zmian w pobudliwości neuronów obwodowych. Co więcej, nie tylko neurony obwodowe (tj. jelitowe), ale także centralne (np. DRG lub rdzeniowe drugiego rzędu) mogą być włączone do niniejszego testu w celu oceny ich morfologicznej i funkcjonalnej reakcji na różną zawartość tkanki przewodu pokarmowego. W tym samouczku wideo demonstrujemy protokół techniczny dotyczący wykonywania tego testu oraz omawiamy jego zalety i wady. Ponadto zwracamy uwagę na możliwość zastosowania podstawowego pojęcia tego testu do badania neuroplastyczności w dowolnym narządzie żołądkowo-jelitowym.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach w protokole są zgodne z wytycznymi Technische Universität München, Niemcy.

1. Przygotowanie podłoża/ekstraktu

1. Homogenizacja tkanek
   Jakość homogenizacji tkanek ma kluczowe znaczenie dla późniejszego wykrywania zmian neuroplastycznych w hodowanych neuronach. W tym przypadku zalecany jest homogenizator, który umożliwia dysocjację tkanek bez znacznego wzrostu temperatury tkanek.
   1. Przenieść kostki tkanki trzustki o wymiarach 5 mm x 5 mm bezpośrednio z temperatury -80 °C do ciekłego azotu i umieścić w fazie stałej w homogenatorze tkankowym. Idealny homogenator dysocjowałby tkankę wystarczająco szybko, nie dopuszczając do jej rozmrożenia.
   2. Natychmiast po dysocjacji zawiesić stały, sproszkowany homogenat w 300-500 μl 0,1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). W tym przypadku nie należy używać żadnego buforu do lizy (takiego jak RIPA), ponieważ może to spowodować lizę neuronów.
   3. Odwirowywać homogenaty przez co najmniej 15 minut z maksymalną prędkością wirówki stołowej (np. 21 130 x g). Zebrać klarowny sklarowany sklarowany szwaczek górski, który reprezentuje ekstrakt tkankowy.
2. Supernatanty linii komórkowej
   1. Niech interesujące komórki osiągną co najmniej 70-80% zbiegu w normalnym podłożu wzrostowym.
   2. Zazwyczaj pożywki te zawierają składniki surowicy i mogą wywierać niekontrolowany wpływ na wzrost neuronów. Dlatego po osiągnięciu pożądanej gęstości komórek, umyj komórki co najmniej 3 razy PBS klasy hodowli komórkowej i umieść je w pożywce bez surowicy (SFM) na maksymalnie 48 godzin.
      nuta: Tutaj weź pod uwagę, że niektóre komórki (takie jak komórki gwiaździste trzustki) mogą potrzebować surowicy w pożywce wzrostowej, aby utrzymać swój normalny stan i strukturę. W takich przypadkach należy wykonać seryjne rozcieńczenia surowicy w pożywce komórki będącej przedmiotem zainteresowania, aby znaleźć najniższą możliwą zawartość surowicy niezbędną do nienaruszonego funkcjonowania komórki.
   3. Zmierzyć stężenie białka w homogenacie tkankowym lub supernatantach komórkowych za pomocą testu białkowego Bradforda. Chociaż wartości te różnią się w zależności od typu tkanki i komórki, w przypadku ekstraktów z tkanki trzustki można oczekiwać zakresu stężeń w zakresie 5-12 μg/μl, a w przypadku supernatantów linii komórkowych między 3-8 μg/μl.

2. Ekstrakty z podwielokrotności i supernatanty komórkowe

W zależności od stężenia, które ma być użyte w teście, końcowe stężenie ekstraktu lub supernatantu w pożywce neuronalnej powinno wynosić 100 μg/ml ^5,8.

Uwaga: Do testu z neuronami rosnącymi w podłożu 500 μl w każdym dołku płytki 24-dołkowej, potrzeba 50 μg białka z każdego ekstraktu lub supernatantu na studzienkę. Przy typowym stężeniu ekstraktu wynoszącym około 10 μg/μl, na każdy studzienek potrzeba 5 μl ekstraktu/supernatantu. W każdym ustawieniu wykonanym w trzech próbach odpowiada to 15 μl ekstraktu/supernatantu. Dla różnych typów tkanek lub komórek należy przeprowadzić seryjne rozcieńczenia końcowego stężenia ekstraktu lub supernatantu i porównać zaobserwowane efekty neurotroficzne między różnymi stężeniami ekstraktu/supernatantu.

3. Izolacja neuronów

Gdy pobieranie ekstraktu/supernatantu zostanie zakończone, kontynuuj izolację neuronów.

1. W przypadku neuronów DRG należy pobrać DRG od szyjki macicy do odcinka lędźwiowego nowonarodzonych szczurów między dniem pourodzeniowym (P) 2-12 po dekapitacji i stereomikroskopowym rozwarstwieniu DRG (ryc. 1A). Aby mieć wystarczającą ilość neuronów DRG dla 24-dołkowej płytki, należy zebrać wszystkie DRG od szyjki macicy do odcinka lędźwiowego jednego nowonarodzonego szczura (co odpowiada 52 DRG) na płytkę.
   1. Odetnij peryferyjne (nerwowe) i centralne wypustki (korzenie) DRG za pomocą mikronożyczek.
      Pozostawienie wypustek na miejscu utrudnia rozcieranie i zwiększa ryzyko zanieczyszczenia hodowli przez fibroblasty.
2. W przypadku neuronów MP należy odciąć krezkę od jelita cienkiego i ręcznie i ostrożnie usunąć warstwę surowiczo-mięśniową jelita cienkiego (szczegółowy protokół izolacji MP znajduje się w Schäfer i wsp.⁹, Rysunek 1B). W przypadku MP należy pobrać splot od dwóch szczurów na płytkę 24-dołkową.
   nuta: Staraj się być tak delikatny, jak to możliwe, aby uniknąć rozdarć w warstwie surowiczo-mięśniowej, ponieważ utrudniają one jej pomyślne oddzielenie od jelita cienkiego.
3. Zebrać DRG i warstwę surowiczo-mięśniową w lodowatej pożywce MEM (minimal essential substance) dostarczanej z gentamycyną (20 mg w 500 ml pożywki) i metronidazolem (2,5 mg w 500 ml pożywki).
4. Po zebraniu DRG inkubuj je w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) dostarczonym z kolagenazą typu II przez 20-30 minut. W celu izolacji MP inkubować w rodzaju kolagenazy od 1 do 3 godzin, w zależności od wieku zwierzęcia (ryc. 1C).
5. W przypadku MP zbierz przypominające siatkę kawałki MP pod mikroskopem stereoskopowym i przenieś do lodowatego MEM.
6. Następnie rozprowadzić DRG i MP przez strzykawki o zmniejszającej się średnicy.
   nuta: Nadmierne roztarcie może zniszczyć neurony, ale mniej komórki glejowe.
7. Gdy pożywka zawierająca DRG lub MP stanie się mętna, odwirować zawiesinę o stężeniu 93,9 x g przez 5 minut, wyrzucić pożywkę i ponownie zawiesić w pożywce Neurobaseal (uzupełnionej 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,5 mM L-glutaminy i 2% B-27).
8. Policz całkowitą liczbę komórek (tj. neuronów ORAZ gleju) za pomocą hemocytometru.
   nuta: Liczba potrzebnych komórek zależy od parametru pomiaru. Do ilościowego określenia gęstości neurytów potrzebne są gęstsze hodowle, a tym samym większa liczba komórek niż do pomiaru wzrostu neurytów, wielkości okołokarionalnej i wzoru rozgałęzień poszczególnych neuronów. Do pomiarów gęstości neurytów użyj np. 10 000 komórek (neuron + glej) / studzienka lub 1 500 neuronów / studnia. W przypadku morfometrii pojedynczych neuronów zaleca się krótką (1-minutową) próbę komórek i wysiew 2500 komórek/studnię lub 400 neuronów/studnię. Typowa wydajność komórek uzyskanych od jednego szczura wynosi około 300 000-500 000 komórek.
9. Wysiewaj komórki na 13-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych, które zostały pokryte poprzedniej nocy i przykryj dołki pożywką Neurobaseal (uzupełnioną 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,5 mM L-glutaminy i 2% B-27) (Figura 1D).
   nuta: Stosować szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną (40 mg/^m2) LUB ornityną i lamininą (1 mg/ml każdy). Komórki przyłączają się do poli-D-lizyny niezwykle szybko, dzięki czemu nadaje się ona do eksperymentów, w których potrzebnych jest wiele komórek (np. pomiary gęstości neurytów). Przywiązanie do lamininy jest na ogół nieco słabsze, ale laminina jest silnym promotorem wzrostu neurytów. Dlatego do pomiarów rozgałęzień neuronalnych i długości neurytów preferowane jest powlekanie ornityną/lamininą.
10. Pozwól komórkom przyczepić się do studzienek na noc. Następnego dnia przygotować pożywkę uzupełnioną ekstraktem (przy końcowym stężeniu ekstraktu/supernatantu 100 μg/ml).
11. Zassać podłoże wysiewające i wykonać opcjonalne, bardzo delikatne płukanie PBS, a następnie powoli pipetować pożywkę z ekstraktem/supernatantem (rysunek 1E).
12. Pozwól komórkom rosnąć przez 48 godzin. Odessać pożywkę i utrwalić w 4% paraformaldehydzie w celu barwienia immunologicznego (ryc. 1F).
13. Wykonaj podwójne barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu markerów specyficznych dla neuronów (np. tubulina beta III) i glejowych (np. kwaśne białko fibryallaryczne gleju / GFAP) (Figura 1G).
14. Do morfometrii należy użyć mikroskopu światła odwróconego wyposażonego w kamerę CCD w połączeniu ze zautomatyzowanym oprogramowaniem, które umożliwia pomiar gęstości neurytów (patrz tabela).
15. Gęstość neurytów w kulturach neuronalnych mierzy się na 4-5 reprezentatywnych mikrofotografiach w 200-krotnym powiększeniu z 4 różnych regionów o najgęstszym wzroście na każdym szkiełku nakrywkowym, nakładając siatkę 50 μm x 50 μm i zliczając gęstość włókien na kwadrat mierzoną w przecinających się włóknach. Przerost neurytowy, średnia liczba gałęzi na neuron, średnia długość gałęzi i rozmiar okołokarionalny można zmierzyć z losowo wybranych 30 pojedynczych neuronów z każdego szkiełka nakrywkowego, oznaczając neuryty i perikarya (ryc. 1H).

Wyniki

Morfologiczna neuroplastyczność

W wskazanym przedziale wiekowym noworodków szczurzych (P2-12) oraz przy zastosowanych gęstościach wysiewu, neurony MP i DRG tworzą już gęste sieci neuronalne po 48 h (Rysunek 2A). Porównanie gęstości neurytów między neuronami hodowanymi w ekstraktach PCa, CP i NP wykazuje większą gęstość neurytów neuronów DRG w ekstraktach PCa lub CP niż w ekstraktach NP (Rysunek 2A)⁵. Do pomiarów na pojedynczych neuronach pr...

Dyskusja

Niniejszy protokół ma na celu zilustrowanie metodologii testu neuroplastyczności trzustki in vitro , który został niedawno opracowany przez naszą grupę w celu zbadania mechanizmów neuroplastyczności w PCa i CP⁵. Protokół obejmuje trzydniową procedurę, którą można łatwo zastosować, gdy wykonawca zdobędzie wystarczające doświadczenie w izolacji i hodowli neuronów DRG i MP. Ponadto stanowi cenne narzędzie do badania jednoczesnej reakcji gleju jelitowego i związanego z DRG na składniki mikrośrodowiskowe t...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bromowodorek poli-D-lizyny	Sigma-Aldrich	P1149
Ornityna/laminina	Sigma-Aldrich	P2533/L4544
13 mm Szkiełka nakrywkowe	Merck		Do stosowania w płytkach 24-dołkowych
Dysmembranator S	Sartorius
Przeciwciało anty-beta-III-tubulinowe	Milipore	MAB1637	stężenie 1:200
Przeciwciało anty-GFAP	DAKO	M0761	o stężeniu 1:400
Bufor RIPA + inhibitor			Dowolny dostawca
Podłoże neurobazalne	Gibco/Nauki Przyrodnicze	21103-049
B-27 Suplement	Gibco/Nauki Przyrodnicze	17504044	Wiadomo, że jakość witaminy B-27 zależy od numeru partii
Gentamycyna/Metronidazol			Dowolny dostawca
Minimalne niezbędne medium	Gibco/Nauki Przyrodnicze	31095-029
Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)	Gibco/Nauki przyrodnicze	24020133	Poprawia aktywność kolagenazy, gdy zawiera Ca / Mg
Kolagenaza typu II	Worthington Biochemical	CLS-2	Uzyskaj partie o aktywności co najmniej 200 U/mg
Trypsyna-EDTA 0,25%	Gibco/Nauki Przyrodnicze	25200056
4% Paraformaldehyd			Dowolny dostawca
analizaSIS docu oprogramowanie	Olympus

proteazy