Analiza funkcjonalna obwodu żerowania larw u Drosophila

Podsumowanie

Obwód żywieniowy u larw Drosophila melanogaster służy prostemu, ale potężnemu modelowi, który pozwala na skorelowanie zmian w tempie karmienia ze zmianami w obwodach nerwowych stomatogastrycznych. Obwód ten składa się z centralnych neuronów serotoninergicznych, które wysyłają projekcje do haczyków ustnych, a także do jelita przedniego.

Streszczenie

Obwód serotoninergiczny u larw Drosophila melanogaster może być wykorzystany do badania substratów neuronalnych o krytycznym znaczeniu podczas rozwoju obwodu. Korzystając z funkcjonalnego wyjścia obwodu, karmienia, można uwidocznić zmiany w architekturze neuronalnej układu stomatożołądkowego. Zachowania żywieniowe można rejestrować, obserwując szybkość cofania się haczyków ustnych, które otrzymują unerwienie z mózgu. Zachowanie lokomotoryczne jest wykorzystywane jako fizjologiczna kontrola żerowania, ponieważ larwy używają haczyków do ust do przechodzenia przez podłoże agarowe. Zmiany w zachowaniach żywieniowych mogą być skorelowane z architekturą aksonalną neurytów unerwiających jelita. Za pomocą immunohistochemii można uwidocznić i określić ilościowo te zmiany. Niewłaściwe obchodzenie się z larwami podczas paradygmatów zachowania może zmienić dane, ponieważ są one bardzo wrażliwe na manipulacje. Prawidłowe obrazowanie architektury neurytów unerwiających jelita ma kluczowe znaczenie dla precyzyjnego określenia liczby i wielkości żylaków, a także zasięgu węzłów rozgałęzionych. Analiza większości obwodów pozwala jedynie na wizualizację architektury neurytów lub efektów behawioralnych; Jednak model ten pozwala na skorelowanie funkcjonalnego wyjścia obwodu z upośledzeniem architektury neuronalnej.

Wprowadzenie

Drosophila to niezwykle potężny system modelowy do badania rozwoju obwodów nerwowych dzięki szybkiemu czasowi generacji, niskim kosztom eksperymentu oraz możliwości manipulowania i kontrolowania czynników genetycznych i środowiskowych. Neurogeneza, znajdowanie ścieżek neuronalnych i synaptogeneza są zachowane między ludźmi a Drosophila; W związku z tym mechanizmy tworzenia, utrzymywania i modyfikowania obwodów neuronowych są również zachowane.

Klasyczne neuroprzekaźniki, takie jak serotonina (5-hydroksytryptamina lub 5-HT) mogą służyć jako czynniki wzrostu przed przyjęciem ich roli jako molekuły sygnałowe w dojrzałym obwodzie nerwowym^1-3 Poprzednie badania wykazały, że zaburzone poziomy 5-HT podczas embriogenezy zmieniają łączność dojrzałych neuronów⁴. Inni wykazali, że ektopowe zastosowanie 5-HT do hodowanych neuronów Helisoma hamuje wzrost neurytów, a także synaptogenezę^5-7. U Drosophila rozwojowe poziomy 5-HT są odwrotnie proporcjonalne do liczby i wielkości żylaków, a także stopnia aboryzacji, wzdłuż długości neurytów wystających do jelita przedniego z OUN⁸.

Wykazano, że

Szybkość żerowania larw drugiego stadium rozwojowego może być oceniana przez retrakcję sklerytów głowowo-gardłowych (haczyków gębowych) i jest powtarzalna i wysokoprzepustowa. Płytki głowowo-gardłowe są unerwione włóknami z centralnych neuronów 5-HT przez nerw czołowy. Proventriculus, czyli jelito przednie, jest unerwione przez włókna serotoninergiczne (nerw nawrotowy), które fascykulują się w jelicie środkowym i są odpowiedzialne za skurcze jelita przedniego (ryc. 1)^11-12. Zmiany w rozgałęzieniach aksonalnych oraz liczbę i wielkość żylaków na całej długości neurytów można określić ilościowo za pomocą technik immunohistochemicznych. Manipulowanie neuronalnym 5-HT podczas rozwoju, bezpośrednio lub pośrednio, może zmienić funkcjonalną moc wyjściową tego obwodu karmienia, co można ocenić i skorelować ze zmianami w morfologii architektury neurytów.

Protokół

1. Utrzymanie klatek dla ludności

1. Utrzymuj klatki dla populacji w temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym. Tak długo, jak grupy kontrolne i eksperymentalne są wystawione na te same warunki oświetleniowe, technika ta może być wykonywana w standardowych warunkach laboratoryjnych.
2. Pozwól samicom złożyć jaja przez noc na talerzach z sokiem jabłkowym.
3. Zebrać nowo wyklute larwy, utrzymując płytki z nowo złożonymi jajami w temperaturze 25 °C przez 24 godziny. Umieść małą porcję drożdży na środku płytki, aby przyciągnąć wyklute larwy.
4. Zbierz 1 larwy w stadium rozwojowym, które migrowały do pasty drożdżowej na środku talerza z sokiem jabłkowym. Użyj metalowej szpatułki, aby przenieść go na talerz ze świeżym sokiem jabłkowym. Można dodać dodatkową pastę drożdżową, aby upewnić się, że do czasu wykonania testów jest odpowiednia ilość pokarmu. Talerze z sokiem winogronowym mogą być również używane zamiast talerzy z sokiem jabłkowym.
5. Uzyskać późne 2-wczesne ^3-cie larwy w 3. stadium rozwojowym, pozwalając 1^st. stadium dojrzewać przez 40-48 godzin. W tym zakresie dawki karmienia są stałe¹³. Wiek można potwierdzić poprzez badanie haczyków gębowych, ponieważ z każdym linieniem larwalnym zachodzą wyraźne zmiany w tej strukturze.
6. Larwy późnego 2-wczesnego^3-go stadium rozwojowego są zbierane do testów behawioralnych poprzez delikatne i intensywne mycie talerzy soku jabłkowego wodą i zbieranie larw na filtrze siatkowym. Larwy są następnie przenoszone na płytkę agarową.
7. Wszystkie analizy wykonywane są równolegle na zwierzętach kontrolnych i doświadczalnych.

2. Paradygmat behawioralny – lokomocja

1. Umieść pojedynczą larwę w trzecim stadium rozwojowym na 2% podłożu agarowym w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm i pozwól larwie zaaklimatyzować się przez 30 sekund. Larwy używają swoich sklerytów głowowo-gardłowych (haczyków gębowych) do przesuwania swoich ciał po powierzchni substratu agarowego. Odbywa się to na osobnej płytce, ponieważ trudniej jest uwidocznić skurcze ciała w roztworze drożdży, ponieważ zwierzę ma prawie ten sam kolor co drożdże.
2. Obserwuj i rejestruj każdy ruch od tyłu do przodu nad podłożem przez okres 1 minuty. n = 20 dla każdego genotypu. Nie należy badać więcej niż 10 zwierząt na jednej płytce.

3. Paradygmat zachowania – karmienie

1. Używając pęsety Inox #5, ostrożnie przenieś larwę 3 stopnia rozwojowego z płytki agarowej lokomotywy na środek płytki wypełnionej agarem pokrytej 5 ml 2% aktywowanego roztworu drożdży piekarskich. Upewnij się, że roztwór jest jednorodny, ponieważ drożdże z czasem osiądną. W roztworze drożdży larwy w dużej mierze pozostaną na miejscu i będą żerować, co ułatwi obserwację zachowania. Tempo skurczów haczyków w jamie ustnej jest bezpośrednio skorelowane z ilością spożytego pokarmu¹⁴.
2. Pozwól larwie zaaklimatyzować się przez 30 sekund.
3. Obserwuj i zapisuj liczbę skurczów haczyka w jamie ustnej przez okres 1 minuty. n = 20 dla każdego genotypu.

4. Rozbiory jelit larwalnych

1. Przygotować 4% roztwór utrwalający formaldehyd klasy EM w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i umieścić w 3-dołkowym szkle punktowym.
2. Ostrożnie wypreparuj wędrujące wnętrzności larw późnego stadium 3 w 3-dołkowym szklanym naczyniu, używając 1x roztworu PBS, upewniając się za każdym razem, że proventriculus pozostaje nienaruszony. Jednym kleszczem przytrzymaj tylny koniec, a drugim przytrzymaj haczyki do ust. Trzymając tylny koniec nieruchomo, delikatnie pociągnij za haczyki do ust, aby uzyskać dostęp do wnętrzności. Usuń wszelkie powiązane tkanki (gruczoły ślinowe, mózg, ciało tłuszczowe itp.), a następnie przenieś każde jelito do 3-dołkowego naczynia zawierającego formaldehyd. Stosuje się larwy wędrujące w 3. stadium rozwoju, ponieważ na tym etapie rozwoju larwa przestaje żerować w ramach przygotowań do poczwarkowania, a proventriculus jest oczyszczany z drożdży.
3. Inkubować wnętrzności w temperaturze 4 °C przez noc w nieprzezroczystym pudełku do hodowli tkankowych.
4. Przed usunięciem roztworu utrwalającego formaldehyd ze studzienek należy usunąć żołądek i przyciąć jelito środkowe ~150 μm² od przedsionka, aby projekcje można było wyraźnie oglądać bez przeszkód.
5. Usunąć poprawkę formaldehydu ze studzienek i zastąpić 1x PBT (1x PBS, 0,1% albumina surowicy bydlęcej bez proteazy, 0,1% Triton X-100) roztwór buforowy. Dokładnie umyj wnętrzności 6x przez 10 min w 1x PBT. Umieść próbki tkanek na rotatorze mechanicznym podczas wykonywania płukania.
6. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę w ^10-6 M 5-HT w celu wzmocnienia sygnalizacji serotoniny. Dokładnie umyj wnętrzności 6x przez 10 min w 1x PBT. Wcześniejsze badania wykazały, że takie stężenie egzogennego 5-HT nie wpływa na architekturę neuronów ani gęstość żylaków w analizach immunohistochemicznych, a jedynie zwiększa stosunek sygnału do szumu^15-16.
7. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w pierwszorzędowym przeciwciałie antyserotoninowym (monoklonalnym wyhodowanym u myszy lub poliklonalnym wyhodowanym u królika). Dokładnie umyj wnętrzności 6x przez 10 min w 1x PBT. Umieść próbki tkanek na rotatorze mechanicznym podczas wykonywania płukania.
8. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 90 minut w przeciwciałie drugorzędowym (Alexa Fluor 568 kozi anty-mysi lub anty-królicy; rozcieńczenie 1:400). Dokładnie umyj wnętrzności 6x przez 10 min w 1x PBT. Umieść próbki tkanek na rotatorze mechanicznym podczas wykonywania płukania.
9. Inkubować w 4 mM węglanie sodu przez 10 minut na rotatorze mechanicznym, następnie zamontować w 4% galusanu n-propylu/20 mM węglanu sodu i oglądać pod wpływem fluorescencji. Węglan sodu służy do przekształcania próbek w bufor i pH stosowany w pożywce mocującej.
10. Przechwytuj obrazy próbek tkanek barwionych immunologicznie w 400-krotnym powiększeniu do analizy.

5. Analiza obwodów neuronowych

1. Włókna neurytowe określono ilościowo (liczbę i wielkość żylaków oraz stopień rozgałęzienia) za pomocą Neuroleucida i Neuroexplorer. Można to jednak również zrobić ręcznie lub za pomocą Simple Neurite Tracer (bezpłatnej aplikacji, którą można pobrać online).
2. Prześledź poszczególne wypustki włókien od mózgu do przedsionka i określ ilościowo liczbę żylaków, gałęzie i liczbę dużych żylaków na jednostkę długości. Włókna aksonalne wystające z mózgu są zgrupowane w nerwie nawrotowym i nie są dostępne do analizy, dopóki nie dotrą do przedsionka, gdzie oddzielają się i fascykulują.

Wyniki

Serotonergiczny obwód żywieniowy w larwie Drosophila może służyć jako niezwykle skuteczny model do obserwacji wpływu poszczególnych czynników na rozwój układu nerwowego. Poprzez kwantyfikację szybkości żywienia możliwe jest powiązanie architektury aksonalnej obwodu żywieniowego z jego wynikiem funkcjonalnym (Rysunek 1). Test lokomocyjny jest wykorzystywany jako kontrola fizjologiczna dla ruchów cofania haczyków gębowych, ponieważ larwy używają haczyków gębowych do przemieszczania się po powierzc...

Dyskusja

Nieprawidłowy rozwój serotoninergicznego obwodu stomatożołądkowego, który następuje podczas późnej embriogenezy, wpłynie na jego dojrzałą funkcję. Zmiany w architekturze neurytów unerwiających jelita mogą być skorelowane z funkcjonalnym wyjściem obwodu, którym jest szybkość karmienia (mierzona skurczami haczyków w jamie ustnej w roztworze drożdży) (ryc. 1). Zastosowanie dwuczęściowego systemu UAS-Gal4 u Drosophila umożliwia specyficzne ukierunkowanie regulowanej w górę lub w dół ekspresji danego...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop Eclipse E-800	Instrumenty firmy Nikon Neuroleucida
	MBF Biosciences	NL-15	Służy do analizy architektury włókien jelitowych, nie jest konieczne posiadanie
oprogramowania do obrazowania	Northern Eclipse	Empix Inc
G-2E/C TRITC EX 528-553	Nikon Instruments	96312	Filtr do specyficznego przeciwciała
wtórnegobrak danych 0,75; szer. d. 0,72 mm; Pryzmat DIC: 40xI, 40x I-C; Sprężynowy	obiektyw Nikon Instruments	MRH00400	używany do obrazowania
Simple Neurite Tracer	NIH Image J		http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer