Analiza funkcjonalna obwodu żerowania larw u Drosophila

Drosophila to niezwykle potężny system modelowy do badania rozwoju obwodów nerwowych dzięki szybkiemu czasowi generacji, niskim kosztom eksperymentu oraz możliwości manipulowania i kontrolowania czynników genetycznych i środowiskowych. Neurogeneza, znajdowanie ścieżek neuronalnych i synaptogeneza są zachowane między ludźmi a Drosophila; W związku z tym mechanizmy tworzenia, utrzymywania i modyfikowania obwodów neuronowych są również zachowane.

Klasyczne neuroprzekaźniki, takie jak serotonina (5-hydroksytryptamina lub 5-HT) mogą służyć jako czynniki wzrostu przed przyjęciem ich roli jako molekuły sygnałowe w dojrzałym obwodzie nerwowym^1-3 Poprzednie badania wykazały, że zaburzone poziomy 5-HT podczas embriogenezy zmieniają łączność dojrzałych neuronów⁴. Inni wykazali, że ektopowe zastosowanie 5-HT do hodowanych neuronów Helisoma hamuje wzrost neurytów, a także synaptogenezę^5-7. U Drosophila rozwojowe poziomy 5-HT są odwrotnie proporcjonalne do liczby i wielkości żylaków, a także stopnia aboryzacji, wzdłuż długości neurytów wystających do jelita przedniego z OUN⁸.

Szybkość żerowania larw drugiego stadium rozwojowego może być oceniana przez retrakcję sklerytów głowowo-gardłowych (haczyków gębowych) i jest powtarzalna i wysokoprzepustowa. Płytki głowowo-gardłowe są unerwione włóknami z centralnych neuronów 5-HT przez nerw czołowy. Proventriculus, czyli jelito przednie, jest unerwione przez włókna serotoninergiczne (nerw nawrotowy), które fascykulują się w jelicie środkowym i są odpowiedzialne za skurcze jelita przedniego (ryc. 1)^11-12. Zmiany w rozgałęzieniach aksonalnych oraz liczbę i wielkość żylaków na całej długości neurytów można określić ilościowo za pomocą technik immunohistochemicznych. Manipulowanie neuronalnym 5-HT podczas rozwoju, bezpośrednio lub pośrednio, może zmienić funkcjonalną moc wyjściową tego obwodu karmienia, co można ocenić i skorelować ze zmianami w morfologii architektury neurytów.

1. Utrzymanie klatek dla ludności

1. Utrzymuj klatki dla populacji w temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym. Tak długo, jak grupy kontrolne i eksperymentalne są wystawione na te same warunki oświetleniowe, technika ta może być wykonywana w standardowych warunkach laboratoryjnych.
2. Pozwól samicom złożyć jaja przez noc na talerzach z sokiem jabłkowym.
3. Zebrać nowo wyklute larwy, utrzymując płytki z nowo złożonymi jajami w temperaturze 25 °C przez 24 godziny. Umieść małą porcję drożdży na środku płytki, aby przyciągnąć wyklute larwy.
4. Zbierz 1 larwy w stadium rozwojowym, które migrowały do pasty drożdżowej na środku talerza z sokiem jabłkowym. Użyj metalowej szpatułki, aby przenieść go na talerz ze świeżym sokiem jabłkowym. Można dodać dodatkową pastę drożdżową, aby upewnić się, że do czasu wykonania testów jest odpowiednia ilość pokarmu. Talerze z sokiem winogronowym mogą być również używane zamiast talerzy z sokiem jabłkowym.
5. Uzyskać późne 2-wczesne ^3-cie larwy w 3. stadium rozwojowym, pozwalając 1^st. stadium dojrzewać przez 40-48 godzin. W tym zakresie dawki karmienia są stałe¹³. Wiek można potwierdzić poprzez badanie haczyków gębowych, ponieważ z każdym linieniem larwalnym zachodzą wyraźne zmiany w tej strukturze.
6. Larwy późnego 2-wczesnego^3-go stadium rozwojowego są zbierane do testów behawioralnych poprzez delikatne i intensywne mycie talerzy soku jabłkowego wodą i zbieranie larw na filtrze siatkowym. Larwy są następnie przenoszone na płytkę agarową.
7. Wszystkie analizy wykonywane są równolegle na zwierzętach kontrolnych i doświadczalnych.

2. Paradygmat behawioralny – lokomocja

1. Umieść pojedynczą larwę w trzecim stadium rozwojowym na 2% podłożu agarowym w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm i pozwól larwie zaaklimatyzować się przez 30 sekund. Larwy używają swoich sklerytów głowowo-gardłowych (haczyków gębowych) do przesuwania swoich ciał po powierzchni substratu agarowego. Odbywa się to na osobnej płytce, ponieważ trudniej jest uwidocznić skurcze ciała w roztworze drożdży, ponieważ zwierzę ma prawie ten sam kolor co drożdże.
2. Obserwuj i rejestruj każdy ruch od tyłu do przodu nad podłożem przez okres 1 minuty. n = 20 dla każdego genotypu. Nie należy badać więcej niż 10 zwierząt na jednej płytce.

3. Paradygmat zachowania – karmienie

1. Używając pęsety Inox #5, ostrożnie przenieś larwę 3 stopnia rozwojowego z płytki agarowej lokomotywy na środek płytki wypełnionej agarem pokrytej 5 ml 2% aktywowanego roztworu drożdży piekarskich. Upewnij się, że roztwór jest jednorodny, ponieważ drożdże z czasem osiądną. W roztworze drożdży larwy w dużej mierze pozostaną na miejscu i będą żerować, co ułatwi obserwację zachowania. Tempo skurczów haczyków w jamie ustnej jest bezpośrednio skorelowane z ilością spożytego pokarmu¹⁴.
2. Pozwól larwie zaaklimatyzować się przez 30 sekund.
3. Obserwuj i zapisuj liczbę skurczów haczyka w jamie ustnej przez okres 1 minuty. n = 20 dla każdego genotypu.

4. Rozbiory jelit larwalnych

1. Przygotować 4% roztwór utrwalający formaldehyd klasy EM w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i umieścić w 3-dołkowym szkle punktowym.
2. Ostrożnie wypreparuj wędrujące wnętrzności larw późnego stadium 3 w 3-dołkowym szklanym naczyniu, używając 1x roztworu PBS, upewniając się za każdym razem, że proventriculus pozostaje nienaruszony. Jednym kleszczem przytrzymaj tylny koniec, a drugim przytrzymaj haczyki do ust. Trzymając tylny koniec nieruchomo, delikatnie pociągnij za haczyki do ust, aby uzyskać dostęp do wnętrzności. Usuń wszelkie powiązane tkanki (gruczoły ślinowe, mózg, ciało tłuszczowe itp.), a następnie przenieś każde jelito do 3-dołkowego naczynia zawierającego formaldehyd. Stosuje się larwy wędrujące w 3. stadium rozwoju, ponieważ na tym etapie rozwoju larwa przestaje żerować w ramach przygotowań do poczwarkowania, a proventriculus jest oczyszczany z drożdży.
3. Inkubować wnętrzności w temperaturze 4 °C przez noc w nieprzezroczystym pudełku do hodowli tkankowych.
4. Przed usunięciem roztworu utrwalającego formaldehyd ze studzienek należy usunąć żołądek i przyciąć jelito środkowe ~150 μm² od przedsionka, aby projekcje można było wyraźnie oglądać bez przeszkód.
5. Usunąć poprawkę formaldehydu ze studzienek i zastąpić 1x PBT (1x PBS, 0,1% albumina surowicy bydlęcej bez proteazy, 0,1% Triton X-100) roztwór buforowy. Dokładnie umyj wnętrzności 6x przez 10 min w 1x PBT. Umieść próbki tkanek na rotatorze mechanicznym podczas wykonywania płukania.
6. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę w ^10-6 M 5-HT w celu wzmocnienia sygnalizacji serotoniny. Dokładnie umyj wnętrzności 6x przez 10 min w 1x PBT. Wcześniejsze badania wykazały, że takie stężenie egzogennego 5-HT nie wpływa na architekturę neuronów ani gęstość żylaków w analizach immunohistochemicznych, a jedynie zwiększa stosunek sygnału do szumu^15-16.
7. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w pierwszorzędowym przeciwciałie antyserotoninowym (monoklonalnym wyhodowanym u myszy lub poliklonalnym wyhodowanym u królika). Dokładnie umyj wnętrzności 6x przez 10 min w 1x PBT. Umieść próbki tkanek na rotatorze mechanicznym podczas wykonywania płukania.
8. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 90 minut w przeciwciałie drugorzędowym (Alexa Fluor 568 kozi anty-mysi lub anty-królicy; rozcieńczenie 1:400). Dokładnie umyj wnętrzności 6x przez 10 min w 1x PBT. Umieść próbki tkanek na rotatorze mechanicznym podczas wykonywania płukania.
9. Inkubować w 4 mM węglanie sodu przez 10 minut na rotatorze mechanicznym, następnie zamontować w 4% galusanu n-propylu/20 mM węglanu sodu i oglądać pod wpływem fluorescencji. Węglan sodu służy do przekształcania próbek w bufor i pH stosowany w pożywce mocującej.
10. Przechwytuj obrazy próbek tkanek barwionych immunologicznie w 400-krotnym powiększeniu do analizy.

5. Analiza obwodów neuronowych

1. Włókna neurytowe określono ilościowo (liczbę i wielkość żylaków oraz stopień rozgałęzienia) za pomocą Neuroleucida i Neuroexplorer. Można to jednak również zrobić ręcznie lub za pomocą Simple Neurite Tracer (bezpłatnej aplikacji, którą można pobrać online).
2. Prześledź poszczególne wypustki włókien od mózgu do przedsionka i określ ilościowo liczbę żylaków, gałęzie i liczbę dużych żylaków na jednostkę długości. Włókna aksonalne wystające z mózgu są zgrupowane w nerwie nawrotowym i nie są dostępne do analizy, dopóki nie dotrą do przedsionka, gdzie oddzielają się i fascykulują.

Obwód pokarmowy serotoninergiczny u larw Drosophila może służyć jako niezwykle skuteczny model do obserwacji wpływu poszczególnych czynników na rozwój układu nerwowego. Poprzez ilościowe określenie szybkości karmienia możliwe jest powiązanie architektury aksonalnej obwodu zasilającego z jego funkcjonalnym wyjściem (ilustracja 1). Test lokomotoryczny jest stosowany jako fizjologiczna kontrola cofania się haczyków ustnych, ponieważ larwy używają haczyków ustnych do poruszania się po powierzchni agaru. Nie powinno być różnicy w reakcjach lokomotorycznych między genotypami kontrolnymi i zmutowanymi, jeśli mutacje wpływają tylko na obwód żywieniowy8 (ryc. 2A). Jeśli wystąpią znaczące różnice, możliwe jest, że zachowanie larw zostało naruszone przez niewłaściwe obchodzenie się. Jeśli larwy zatrzymają się podczas testu, aby spróbować przebić się przez podłoże agarowe, mogą być zbyt stare i prawdopodobnie przechodzą w wędrujące stadium rozwojowe. Możliwe jest również, że podłoże agarowe może być zbyt twarde, co utrudnia chwytanie substratu agarowego przez haczyki larwalne w ustach; Można temu zaradzić, zwilżając powierzchnię agaru.

Ten test może być użyty do oceny, czy szczepy Drosophila z neuronalnymi wadami anatomicznymi wpływają na rozwój serotoninergicznego obwodu żywieniowego. Zmutowane otwarte ciało elipsoidalne (ebo3) ma defekt strukturalny w elipsoidalnym ciele kompleksu centralnego. Porównanie z dzikim szczepem rodzicielskim Canton-S, CSwu, ujawnia, że te anatomiczne defekty podczas rozwoju mózgu skutkują depresją karmienia, podczas gdy lokomocja nie jest zaburzona (Figura 2B).

Anatomiczne defekty u mutantów ebo3 wydają się zmieniać rozwój architektury neurytowej jelita. Rycina 3 przedstawia zmiany w architekturze włókien w larwach ebo3 w porównaniu z CSwu; Larwy te wykazują wzrost rozgałęzień, a także wzrost liczby zarówno małych, jak i dużych żylaków na długości neurytów. Zwróć uwagę na węzły gałęzi (strzałki), żylaki (groty strzałek) i duże żylaki (gwiazdki). Rysunek 4 przedstawia ilościowe określenie tych obrazów.

Prawidłowe określenie ilościowe architektury aksonalnej wymaga, aby obrazy były niezwykle wyraźne. Rysunek 5A przedstawia obraz odpowiedni do analizy. Obrazy o gorszej jakości utrudnią odróżnienie błonnika od żylaków (ryc. 5B). Podczas fotografowania architektury włókien unikaj robienia zdjęć, które zawierają występy w przedniej części przedsionka, ponieważ włókna są ciasno związane, oddzielają się od siebie i mogą wyglądać tak, jakby były rozgałęzione. Więcej tylnych włókien w jelicie środkowym jest bardziej rozgałęzionych, ponieważ fascykulują się, gdy znajdą się w tej tkance. Kwantyfikacja liczby gałęzi i żylaków oraz wielkości żylaków może być analizowana ręcznie lub za pomocą programu przeznaczonego do badania morfologii neurytów, takiego jak Neuroleucida. Dopóki proventriculus nie zostanie uszkodzony podczas protokołu immunohistochemicznego, a obraz jest ostry, preparaty będą dopuszczalne do obrazowania i analizy. Jeśli architektura włókien jest wyraźnie odróżnialna od tła i jeśli można zidentyfikować poszczególne żylaki na całej długości neurytu, preparat nadaje się do analizy. Ponadto, jeśli poszczególne żylaki można zidentyfikować na podstawie reszty włókna, jest to również kolejny wskaźnik jakości obrazu do analizy. Analizowane są wszystkie włókna, z wyjątkiem tych, które znajdują się poza zakresem ostrości (w niektórych przypadkach włókna będą zakrzywiać się między wieloma płaszczyznami ostrości).

Rysunek 1. Obwód żerowania larw. Filet a larwy w 3. stadium rozwojowym z tkankami mózgu i jelit (A). Tkanki jelitowe wypreparowane z larw w 3. stadium rozwojowym wybarwiono immunologicznie przeciwciałem przeciwko neuronalnej hydroksylazie tryptofanu Drosophila (DTRH, B) lub 5-HT (C). A,B. E, przełyk; Mh, haczyki do ust; Pr, proventriculus; Br, mózg (zwróć uwagę na wzór neuronów 5-HT). Grot strzałki oznacza nerw czołowy; strzała, nawracający nerw. C. proventriculus z włóknami aksonalnymi (grotami strzał). Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 2. Wady anatomiczne podczas rozwoju mózgu skutkują depresyjnymi zachowaniami żywieniowymi. Zwierzęta badano pod kątem zachowań lokomotorycznych (A) i żywieniowych (B). Lokomocja pozostała nienaruszona. n = 20 dla każdego testu behawioralnego, z 2-3 niezależnych eksperymentów. p<0,0001, niesparowany test t. Linie powyżej wykresu reprezentują błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 3. Wady anatomiczne podczas rozwoju OUN powodują aberrację w architekturze włókien jelitowych. Tkanka jelitowa wycięta z larw w 3.stadium rozwojowym i wybarwiona immunologicznie anty-5-HT. Strzałka oznacza węzeł rozgałęzienia. Grot strzały oznacza niewielką żylak. Gwiazdka oznacza duże żylaki. Podziałka = 40 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 4. Wady anatomiczne podczas rozwoju mózgu skutkują nieprawidłową architekturą włókien jelitowych. Analiza tkanki przedsionkowej larw z 3stopnia rozwojowego wypreparowanych i inkubowanych z anty-5-HT. Rozgałęzienia neurytowe (A), liczba całkowitych żylaków na 0,1 mm długości neurytu (B) i liczba dużych żylaków (>1 μm2) na 0,1 mm długości (C). CSwu, 20 włókien z 17 jelit z 2 niezależnych eksperymentów; EBO3, 20 włókien z 18 jelit z 3 niezależnych eksperymentów. p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05, niesparowany test t. Linie powyżej wykresu przedstawiają błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 5. Jakość obrazów jest ważna dla prawidłowej oceny ilościowej architektury włókien jelitowych. Tkanki jelitowe wycięte z larw CSwu w 3. stadium rozwojowym i wybarwione immunologicznie anty-5-HT. (A). Obraz dobrej jakości. (B). Słaba jakość obrazu. Podziałka = 40 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Nie mamy nic do ujawnienia.