Badanie wpływu probiotyków na kolonizację pneumokoków za pomocą testu przylegania in vitro

Podsumowanie

Testy przestrzegania zaleceń in vitro mogą być wykorzystane do badania przyczepiania się Streptococcus pneumoniae do monowarstw komórek nabłonka i do zbadania potencjalnych interwencji, takich jak użycie probiotyków do hamowania kolonizacji pneumokoków.

Streszczenie

Przyleganie Streptococcus pneumoniae (pneumokoków) do nabłonkowej wyściółki nosogardzieli może prowadzić do kolonizacji i jest uważane za warunek wstępny dla infekcji pneumokokowych, takich jak zapalenie płuc i zapalenie ucha środkowego. Testy przylegania in vitro mogą być stosowane do badania przyłączenia pneumokoków do monowarstw komórek nabłonka oraz do zbadania potencjalnych interwencji, takich jak stosowanie probiotyków, w celu zahamowania kolonizacji pneumokoków. Opisany tutaj protokół służy do zbadania skutków działania probiotyku Streptococcus salivarius w sprawie przylegania pneumokoków do ludzkiej linii komórek nabłonkowych CCL-23 (czasami określanych jako komórki HEp-2). Test obejmuje trzy główne etapy: 1) przygotowanie komórek nabłonkowych i bakteryjnych, 2) dodanie bakterii do monowarstw komórek nabłonka oraz 3) wykrycie przylegających pneumokoków za pomocą liczenia żywotnych (seryjne rozcieńczanie i posiew) lub ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR). Technika ta jest stosunkowo prosta i nie wymaga specjalistycznego sprzętu poza konfiguracją do hodowli tkankowej. Test może być wykorzystany do testowania innych gatunków probiotyków i/lub potencjalnych inhibitorów kolonizacji pneumokoków i może być łatwo zmodyfikowany w celu rozwiązania innych pytań naukowych dotyczących przylegania i inwazji pneumokoków.

Wprowadzenie

Streptococcus pneumoniae (pneumokoki) to bakteria Gram-dodatnia, która może powodować infekcje, w tym zapalenie płuc, zapalenie ucha środkowego i zapalenie opon mózgowych. Jest to główna przyczyna chorób u dzieci w krajach o niskich dochodach i odpowiada za około 800 000 zgonów dzieci poniżej piątego roku życia^rocznie1. Pneumokoki są często przenoszone w nosogardzieli małych dzieci. Chociaż ta kolonizacja jest ogólnie uważana za bezobjawową, poprzedza zakażenie pneumokokami i służy jako rezerwuar dla bakterii w populacjach ludzkich². Skoniugowane szczepienie przeciw pneumokokom skutecznie ogranicza nosicielstwo serotypów zawartych w szczepionce. Istnieje jednak ponad 90 serotypów pneumokokowych, a szczepienie może prowadzić do zastąpienia serotypu, w wyniku czego po eliminacji serotypów szczepionkowych następuje wzrost nosicielstwa i chorób spowodowanych serotypami^{nieszczepionkowymi3}. Ponadto w niektórych populacjach wysokiego ryzyka kolonizacja pneumokokami często występuje bardzo wcześnie w życiu, przed podaniem pierwszej dawki szczepionki^4,5. Ostatnio zaproponowano stosowanie probiotyków jako dodatkową strategię hamowania kolonizacji pneumokoków^6,7. Testy przylegania in vitro zastosowano do zbadania przestrzegania zaleceń dotyczących pneumokoków^8,9. Testy te zostały przystosowane do badania wpływu probiotyku Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) na przestrzeganie zaleceń dotyczących pneumokoków¹⁰.

Oprócz LGG i innych bakterii kwasu mlekowego, Streptococcus salivarius, powszechny mieszkaniec jamy ustnej, został przebadany jako potencjalny probiotyk dla dróg oddechowych ze względu na jego potencjał kolonizacyjny i zdolność do hamowania pneumokoków i innych patogenów układu oddechowego in vitro^11-13. Przedstawiony tutaj protokół opisuje test przylegania stosowany do badania wpływu S. salivarius K12 na przyleganie pneumokoków do ludzkiej linii komórek nabłonkowych CCL-23. Przed zastosowaniem w teście izolaty pneumokoków oceniono pod kątem zdolności do adhezacji, ponieważ właściwości wzrostu i przylegania mogą się znacznie różnić między izolatami^10,14. Krzywe wzrostu pneumokoków i S. salivarius przeprowadzono w celu określenia środkowej fazy logarytmicznej i oszacowania stężenia (jednostki tworzące kolonie lub CFU/ml) na podstawie gęstości optycznej (OD, ryc. 1). Zaleca się zbadanie wzrostu przez liczbę żywotnych i OD dla każdego izolatu przed użyciem w teście. Test ten można wykonać w dowolnym laboratorium ze standardowymi urządzeniami i sprzętem do hodowli tkankowych. W niniejszym protokole badany jest wpływ trzech dawek S. salivarius podanych na 1 godzinę przed dodaniem pneumokoków na przyleganie S. pneumoniae PMP843, izolatu nosiciela serotypu 19F pochodzącego z wymazu z nosogardzieli. Przedstawiono dwa różne sposoby ilościowego oznaczania przylegających pneumokoków: posiew na agarze z krwią w celu określenia liczby żywotnych oraz ekstrakcja DNA i wykrywanie genu lytA pneumokoków metodą qPCR¹⁵. Podstawowy protokół testu przylegania może być łatwo zmodyfikowany w celu przetestowania różnych dawek lub czasu podawania probiotyków, a także może być stosowany z innymi szczepami lub gatunkami bakterii.

Protokół

1. Przygotowanie komórek nabłonkowych i bakteryjnych

1. Rozmrażanie komórek nabłonkowych CCL-23
   1. Wstępnie podgrzane minimum niezbędne podłoża (MEM) zawierające 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez ~30 min.
   2. Przed użyciem wysterylizuj zatwierdzoną przez hodowlę tkankową komorę bezpieczeństwa biologicznego światłem UV przez co najmniej 10 minut i przetrzyj obszar roboczy 70% etanolem. Przetrzyj podgrzaną butelkę z mediami 70% etanolem i umieść w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
   3. Za pomocą pipety o pojemności 25 ml przenieść 14 ml podłoża do kolby T-75. Umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C podczas rozmrażania komórek (sekcja 1.1.4).
   4. Wyjmij fiolkę z komórkami CCL-23 z magazynu ciekłego azotu, stosując odpowiednie środki ostrożności i ogrzej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do rozmrożenia ~80%.
   5. Kolbę przygotowaną w ppkt 1.1.3 należy zwrócić do komory bezpieczeństwa biologicznego. Przetrzeć zewnętrzną powierzchnię fiolki z komórkami CCL-23 70% etanolem i przenieść zawartość (1 ml) do kolby T-75 za pomocą pipety P1000.
   6. Inkubować kolbę na boku w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i wilgotności względnej 95% przez noc (16-20 godzin).
   7. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić zdrową morfologię, usuń pożywkę i zastąp 15 ml świeżego, wstępnie podgrzanego MEM + 10% FBS.
2. Utrzymanie komórek nabłonkowych CCL-23
   1. Gdy komórki zlewają się w ~80% (1-2 dni), należy usunąć pożywkę za pomocą pipety o pojemności 25 ml i delikatnie umyć komórki dwukrotnie 8-10 ml wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
   2. Usunąć PBS i dodać 1 ml sterylnego 0,25% trypsyny-EDTA (0,25% (w/v) trypsyny, 0,1 mM EDTA). Obrócić kolbę na bok, obrócić, aby upewnić się, że trypsyna pokrywa zlewającą się warstwę komórek, i inkubować kolbę przez 2-3 minuty w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   3. Zwróć kolbę do komory bezpieczeństwa biologicznego, dodaj 9 ml wstępnie podgrzanego MEM + 10% FBS i pipetuj w górę iw dół 6-8 razy, aby ponownie zawiesić komórki, wyrzucając płyn z boku kolby w celu usunięcia komórek.
   4. Podzielić komórki w stosunku 1:15 (1 ml + 14 ml MEM + 10% FBS) lub 1:30 (0,5 ml + 14,5 ml MEM + 10% FBS), odrzucić nadmiar komórek i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   5. Przejść komórki co najmniej dwa razy przed użyciem w teście przylegania. Zazwyczaj komórki są dzielone co 3-4 dni.
3. Wysiew komórek nabłonkowych CCL-23 (jeden dzień przed testem przylegania, Protokół 2)
   1. Podziel zlewające się komórki, jak opisano w sekcjach 1.2.1-1.2.3, ponownie zawieszając się we wstępnie podgrzanym MEM + 5% FBS (stężenie FBS obniża się, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo ingerencji składników surowicy w test). Usunąć 20 μl komórek i policzyć za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru.
   2. Rozcieńczyć komórki we wstępnie podgrzanym MEM + 5% FBS do stężenia 1,5 x 10⁵ komórek/ml w sterylnej probówce o pojemności 50 ml.
   3. Wysiewać 1 ml komórek/basenik na 24-dołkowej płytce poddanej działaniu kultury tkankowej.
4. Przygotowanie bakterii
   Procedurę tę można zastosować do przygotowania pneumokoków i S. salivarius. Pożywka bakteryjna jest zwykle przechowywana przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C w celu wstępnego ogrzania i przetestowania sterylności (zwykle wydaje się mętna, jeśli jest zanieczyszczona).
   1. Dwa dni przed testem przylegania należy umieścić bakterie smugowe na płytkach z agarem z krwią końską (HBA) i inkubować w temperaturze 35-37 °C i 5% CO₂ przez 18-24 godziny. Jako alternatywę można użyć agaru z krwią owczą.
   2. Następnego dnia przygotuj nocną hodowlę dla każdego gatunku bakterii, pipetując 10 ml bulionu Todda-Hewitta z 0,5% ekstraktem drożdżowym (THB+YE) do sterylnej probówki o pojemności 30 ml. Za pomocą pętli o objętości 10 μl zaszczepij około 10-12 dobrze oddzielonych kolonii. Krótko wirować i inkubować w temperaturze 35-37 °C i 5% CO₂ przez 14-16 godzin. Należy pamiętać, że pneumokoki ulegną autolizie, jeśli zostaną pozostawione zbyt długo w kulturze bulionowej.

2. Test adherencji: Dodawanie bakterii do monowarstw komórek nabłonka

1. Przygotowanie kultur bakterii mid-log pneumokoków i S. salivarius
   1. Odpipetować 10 ml wstępnie podgrzanego THB+YE do każdej z dwóch sterylnych probówek o pojemności 30 ml, z których jedna jest oznaczona jako pneumokoki, a druga jako S. salivarius.
   2. Aby osiągnąć środkową fazę logarytmiczną, pneumokoki wymagają ~3 godzin, a S. salivarius ~2 godziny inkubacji (patrz ryc. 1). Rozpocznij obie kultury w tym samym czasie. Wirować (3-5 sekund) przez noc kultur bakteryjnych i dodać 100 μl pneumokoków i 100 μl S. salivarius do odpowiednich probówek.
   3. Krótko wirować i inkubować kultury w temperaturze 37 °C przez około 2 godziny w przypadku S. salivarius i 3 godziny w przypadku pneumokoków.
2. Przygotowanie komórek CCL-23 do testu adhezji
   1. Za pomocą odwróconego mikroskopu sprawdź 24-dołkową płytkę pod kątem zlewających się monowarstw o zdrowej morfologii komórek. Monowarstwy powinny zlewać się w >80%, bez oznak zlepiania się komórek lub efektów cytopatycznych, takich jak zaokrąglanie komórek lub utrata przylegania (patrz ryc. 2).
   2. Usuń pożywkę z każdej studzienki za pomocą pipety transferowej, lekko przechylając płytkę, aby uniknąć naruszenia monowarstwy komórek.
   3. Aby delikatnie umyć komórki, dodaj ~500 μl wstępnie podgrzanego PBS do każdej studzienki za pomocą pipety serologicznej i usuń ją pipetą transferową, lekko przechylając płytkę. Wyrzuć PBS. Powtórz krok prania raz.
   4. Dodaj 500 μl podgrzanego MEM + 5% FBS do każdej studzienki. Umieścić 24-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze CO₂ podczas przygotowywania kultur bakteryjnych.
      Uwaga: Aby określić dokładną liczbę komórek CCL-23 dla wielokrotności infekcji (MOI), można trypsynizować dwie studzienki i policzyć je w dniu infekcji.

3. Test zgodności

1. Dodaj pneumokoki do komórek CCL-23 w MOI ~10:1. Zbadaj warunki wymienione w tabeli 1 w zduplikowanych studzienkach.
   1. Zmierzyć gęstość optyczną w temperaturze A₆₀₀ (OD) 1 ml kultury S. salivarius. OD powinien wynosić od 0,3 do 0,6.
   2. Przenieść 5 ml kultury S. salivarius do probówki o pojemności 10 ml i odwirować przy 1,870 x g przez 4 minuty.
   3. Odrzucić supernatant i na podstawie odczytu OD w sekcji 3.1.1 ponownie zawiesić S. salivarius w 200-1,000 μl 0,85% NaCl (końcowe stężenie ~1,5 x 10⁹ CFU/ml). Jako ogólną wskazówkę, OD 0,375 zostanie ponownie zawieszony w 260 μl. Przygotować rozcieńczenia S. salivarius w proporcjach 1:10 i 1:100, używając 0,85% NaCl.
      Uwaga: W sumie w teście zostaną przetestowane trzy stężenia (reprezentujące wysokie, średnie i niskie dawki) S. salivarius. Wysoka dawka to stosunek ~10 S. salivarius : 1 pneumokoki, pożywka to ~1 S. salivarius : 1 pneumokoki, a niska to ~1 S. salivarius : 10 pneumokoków.
   4. Wyjąć płytkę 24-dołkową z inkubatora.
   5. Ze studzienek kontrolnych heparyny usunąć 40 μl pożywki i dodać 50 μl heparyny (1 000 U/ml stężenia podstawowego) do uzyskania końcowego stężenia 100 U/ml.
   6. Dodać 10 μl 0,85% NaCl do studzienek zawierających tylko komórki CCL-23 i studzienek zawierających komórki CCL-23 i pneumokoki (bez S. salivarius).
   7. Dodać 10 ul nierozcieńczonego, 1:10 i 1:100 S. salivarius do odpowiednich studzienek.
      Uwaga: S. salivarius można również dodać w tym samym czasie co pneumokoki (koaddycja) lub 1 godzinę po pneumokokach (po dodaniu), aby zbadać wpływ czasu podawania probiotyku.
   8. Odwirować 24-dołkową płytkę o sile 114 x g przez 3 minuty, aby ułatwić kontakt bakterii z warstwą komórkową i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   9. Wykonaj seryjne rozcieńczanie zapasu S. salivarius w 0,85% NaCl i płytkę na zduplikowanych płytkach HBA w celu uzyskania żywotnych liczb. Najpierw dodaj 50 μl bulionu do 450 μl 0,85% NaCl, aby uzyskać rozcieńczenie ^10-1, następnie wir pulsacyjny (5 sekund), zmień końcówki i dodaj 50 μl rozcieńczenia ^10-1 do 450 μl 0,85% NaCl, aby uzyskać rozcieńczenie ^10-2 i tak dalej do ^10-7.
   10. Na płytki nanieść 100 μl rozcieńczeń ^10-5, ^10-6 i ^10-7 w dwóch egzemplarzach na płytki HBA i rozprowadzić za pomocą sterylnego rozsiewacza. Inkubować płytki HBA odwrócone przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   11. Pod koniec trwającej 1 godzinę inkubacji powtórzyć sekcje 3.1.1-3.1.3 dla pneumokoków. OD powinny wynosić od 0,2 do 0,7. Odwirować 1 ml kultury pneumokoków i ponownie zawiesić osad w 300-2,000 μl 0,85% NaCl (na podstawie odczytu OD) do stężenia ~1,5 x^10,8 CFU/ml. Jako ogólną wskazówkę, OD 0,3 zostanie ponownie zawieszony w 500 μl.
   12. Po 1 godzinie inkubacji z S. salivarius dodać 10 μl nierozcieńczonych pneumokoków do wszystkich studzienek z wyjątkiem studzienek kontroli ujemnej (zawierających tylko komórki).
   13. Odwirować 24-dołkową płytkę o sile 114 x g przez 3 minuty i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 3 godziny. Przeprowadzić seryjne rozcieńczanie podłoża pneumokoków w 0,85% NaCl, jak opisano w sekcji 3.1.9, a następnie rozcieńczenia płytki ^10-4, ^10-5 i ^10-6 na zduplikowanych płytkach HBA w celu uzyskania żywotnych liczb.
2. Po 3 godzinach sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że monowarstwy wyglądają zdrowo (patrz ryc. 2). Wyjąć pożywkę z każdej studzienki i delikatnie umyć komórki 3 razy, jak opisano w sekcji 2.2.3. przy użyciu innej pipety dla każdego stanu. Ten krok jest niezbędny do usunięcia nieprzylegających pneumokoków. Monowarstwy nie powinny rozpadać się podczas procesu prania; Można to potwierdzić, sprawdzając ponownie pod mikroskopem.

Uwaga: Pożywki usunięte na tym etapie mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w celu przeprowadzenia dodatkowych analiz (np. pomiaru poziomu cytokin).

1. Dodać 200 μl 0,1% digitoniny (delikatnego detergentu) do każdego dołka i inkubować przez 7 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
2. Dodaj 800 μl pożywki THB do każdego dołka. Lizuj komórki, pipetując w górę i w dół, a w razie potrzeby zeskrob studzienki 3-4 razy końcówką pipety, aby upewnić się, że monowarstwa komórek została całkowicie usunięta. Zmieniaj końcówki między studzienkami.
3. Usuń zawartość z każdej studzienki za pomocą pipety P1000 i przenieś do oznakowanych probówek do mikrofuge.

4. Kwantyfikacja przylegających pneumokoków

Przylegające pneumokoki mogą być określone ilościowo poprzez określenie liczby żywotnych (seryjne rozcieńczanie i posiewanie na agarze z krwią) lub przez ilościowe PCR w czasie rzeczywistym.

1. Realna metoda liczenia
   Metodę tę należy wykonać natychmiast po kroku 3.5 testu przylegania.
   1. Dla każdej studzienki testowej przygotować seryjne rozcieńczenia próbek pobranych w kroku 3.5 testu przylegania, dodając 50 μl próbek do 450 μl 0,85% NaCl, pulsując wirując i seryjnie rozcieńczając, jak opisano w sekcji 3.1.9, aż do rozcieńczenia ^10-6.
   2. Umieścić 100 μl rozcieńczeń ^10-3, ^10-4, ^10-5 i ^10-6 w dwóch powtórzeniach na agarze z krwią, rozprowadzić za pomocą sterylnego rozsiewacza i inkubować odwrócone płytki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .} Należy pamiętać, że studzienki zawierające same komórki CCL-23 nie powinny zawierać żadnych bakterii i mogą być posiane w postaci czystej (100 μl nierozcieńczonej) jako kontrola sterylności.
   3. Następnego dnia należy oznaczyć inokulę przeciwko pneumokokom, licząc kolonie na odpowiednich płytkach rozcieńczających (zawierających 30-300 kolonii) przygotowanych w sekcji 3.1.13 testu przylegania. Obliczyć jtk/ml inokulu, używając uśrednionej wartości z dwóch płytek. Podobnie, oznacz inokulę S. salivarius, licząc kolonie na płytkach przygotowanych w sekcji 3.1.10.
      Uwaga: Płytki powinny zawierać wyłącznie pneumokoki; Obecność innych gatunków wskazuje, że test był zanieczyszczony, a wyniki są nieważne.
   4. W celu określenia poziomów przylegania wirusa pneumokoków należy policzyć odpowiednią płytkę rozcieńczającą (zawierającą 30-300 kolonii pneumokoków) dla każdej próbki przygotowanej w sekcji 4.1.1. Należy zauważyć, że kolonie S. salivarius będą małe i białe, podczas gdy pneumokoki będą płaskie i zielonkawe z powodu hemolizy α, jak pokazano na rycinie 3. Aby obliczyć adhezję pneumokoków, należy znormalizować liczbę przylegających pneumokoków z warunku b. Komórki CCL-23 + pneumokoki do 100% i porównać przylegające pneumokoki z innych schorzeń do tego stanu.
2. Metoda qPCR
   Próbki pobrane w etapie 3.5 testu przylegania można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu ekstrakcji DNA. Ekstrakcję DNA przeprowadza się przy użyciu dostępnego w handlu zestawu i opisano w sekcjach 4.2.1–4.2.9, a test qPCR w sekcjach 4.2.10-4.2.20.
   1. Przygotuj enzymatyczny bufor do lizy (50 mM bufor fosforanowy o pH 6,7 zawierający 1 mg/ml lizozymu, 0,075 mg/ml mutanolizyny i 2 mg/ml proteinazy K). Poniższy przepis można wykorzystać: zrobić 10 ml (wystarcza na 50 ekstrakcji). Bufor enzymatyczny do lizy powinien być świeżo przygotowany przed użyciem.
      
      7,25 ml 50 mM roztworu buforu fosforanowego (pH 6,7)
      1,00 ml bulionu 10 mg/ml lizozymu do uzyskania końcowego [1 mg/ml]
      0,75 ml 1 mg/ml mutanolizyny dla końcowego [0,075 mg/ml]
      1,00 ml 20 mg/ml białka K dla końcowego [2 mg/ml]
       
   2. Rozmrozić próbki na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Przeprowadzić wir i przenieść 100 μl porcji każdej próbki do oznakowanych probówek do mikrofuge. Włóż oryginalne próbki z powrotem do zamrażarki w temperaturze -20°C.
   3. Odwirować próbki o masie 6 700 x g przez 10 minut.
   4. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Dodać 200 μl enzymatycznego buforu do lizy do osadu i ponownie zawiesić. Inkubować próbki w temperaturze 56 °C przez 30 minut. Odwirować krótko (5 sekund) przy 6 700 x g, aby zebrać płyn na dnie probówki.
   5. Dodaj 10 μl 20% SDS, aby zakończyć lizę komórek i delikatnie mieszaj w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
   6. Dodać 4 μl RNazy A (100 mg/ml bulionu) i delikatnie mieszać (na kołysce lub odwracając probówki) w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
   7. Dodać 200 μl buforu AL (z zestawu) i wirować przez 15 sekund. Inkubować próbki w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Krótko odwirować (5 sekund) przy 6 700 x g, aby zebrać płyn na dnie probówki.
   8. Dodać 200 μl 100% EtOH i wirować przez 15 sekund. Krótko zakręcić, aby zebrać płyn na dnie probówki, a następnie przenieść mieszaninę (w tym osad) do kolumny wirowej (w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml) bez zwilżania obręczy. Postępuj zgodnie z instrukcjami prania zgodnie z protokołem producenta (nie pokazano tutaj).
   9. Aby wymyć DNA, przenieść kolumnę do znakowanej probówki do mikrofuge, dodać 50 μl buforu AE (z zestawu) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min. Wirować przy 4 300 x g przez 1 min. Powtórzyć raz dla końcowej objętości elucji wynoszącej 100 μl. DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
   10. Aby wykonać qPCR, sterylizuj kaptury światłem UV przez 15 minut przed rozpoczęciem. Zaleca się przygotowanie arkusza mapy 96-dołkowej w celu zapisania lokalizacji studni dla każdej próbki.
   11. Przygotować krzywą wzorcową, używając zapasu 10 ng/μl genomowego DNA pneumokoków (wyekstrahowanego ze szczepu referencyjnego ATCC 6305).
       1. Rozmrozić pneumokokowe DNA i krótko odwirować (5 sekund) w wirówce stołowej.
       2. Wykonaj seryjne rozcieńczenia w stosunku 1:10 w 6 wstępnie znakowanych probówkach do mikrofuge, dodając 3 μl DNA do 27 μl H₂O, zmieniając końcówki i wirując między każdym rozcieńczeniem. Końcowa seria rozcieńczeń składa się z 6 probówek: 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 i 0,00001 ng/μl.
          Uwaga: Można je przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
   12. Przygotuj lytA mastermix w następujący sposób w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml w sterylnym kapturze do PCR. Rozmrozić składniki na lodzie i wirować bezpośrednio przed użyciem. składnik na reakcję x 102 (pełna płyta) lytA F 0,25 μl z 10 μM zapasu 25,5 μl lytA R 0,25 μl z 10 μM zapasu 25,5 μl Sonda lytA 0,5 μl materiału 10 μM 51 μl H₂O 9,5 μl 969 μl Mieszanka mistrzowska 12,5 μl 1,275 μl Ostatni tom 23 μl 2 346 μl Uwaga: Niektóre maszyny do PCR w czasie rzeczywistym wymagają użycia barwnika referencyjnego, który jest zawarty w niektórych komercyjnych mieszankach wzorcowych lub może być dodawany osobno. Protokół ten jest przeznaczony do przeprowadzania reakcji 25 μl na płytce 96-dołkowej, ale można go dostosować do różnych maszyn do PCR w czasie rzeczywistym. Startery i sekwencje sondy zostały pierwotnie opublikowane przez Carvalho i wsp.¹⁵ i są pokazane na liście materiałów.
   13. Odwirować i załadować 23 μl/studzienkę mieszanki litu A do odpowiednich studzienek. Zapoznaj się z mapą tablic.
   14. Płytkę transportową należy przetransportować do miejsca dodawania szablonu (najlepiej sterylnej szafki w oddzielnym pomieszczeniu) w celu załadowania próbki.
   15. Użyj pipety P2 do załadowania próbek, zmieniając końcówki dla każdego dołka. Wszystkie próbki są uruchamiane w dwóch egzemplarzach. Zapoznaj się z mapą tablicy, aby uzyskać informacje o lokalizacji.
   16. W przypadku baseników o krzywej wzorcowej dodać 1 μl/basenik odpowiedniego rozcieńczenia DNA krzywej wzorcowej plus 1 μl/basenik H₂O, aby doprowadzić końcową objętość do 25 μl. W przypadku studzienek kontrolnych bez szablonu dodać 2 μl H₂O.
   17. Dodać 2 μl/basenik próbki DNA do odpowiednich studzienek.
   18. Zakryj wszystkie używane studzienki. Upewnij się, że nakrętki są dobrze zamknięte. Szybko obróć płytkę PCR (5 sekund) przed załadowaniem płytki do maszyny do PCR w czasie rzeczywistym.
   19. Załaduj płytkę do maszyny do PCR i uruchom qPCR zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta maszyny. Zalecane są następujące warunki cyklicznego badania sondy hydrolizy:

       Krok 1 (1x):	3 min w 95 °C
       Krok 2 (40x):	20 s w 95 °C
       	20 s w 60 °C

   20. Zbierz dane i określ ilościowo DNA pneumokoków za pomocą krzywej standardowej. Obciążenia bakteryjne są obliczane w sposób opisany wcześniej¹⁷, szacując, że 1 pg genomowego DNA odpowiada 447,4 komórkom i podawane jako CFU/ml (przy założeniu, że jeden genom na CFU i jedna kopia lytA na genom; patrz Rysunek 4). Aby test zakończył się sukcesem, wartość R² powinna wynosić ≥0,98, a wszystkie pozytywne wyniki mieszczą się w zakresie krzywej wzorcowej (wartości cT mniejsze niż wartości uzyskane dla punktu krzywej wzorcowej 0,00001 ng/μl są uważane za tło/lytA ujemne).
       Uwaga: Niektóre systemy PCR w czasie rzeczywistym są dostarczane z oprogramowaniem analitycznym, które można wykorzystać do konstruowania krzywych standardowych i obliczania niewiadomych. W przeciwnym razie obliczenia te można wykonać w Excelu lub podobnych programach. Przykładowa krzywa standardowa jest pokazana na rysunku 4.
   21. Aby obliczyć adhezję pneumokoków, należy znormalizować liczbę przylegających pneumokoków z warunku b. Komórki CCL-23 + pneumokoki do 100% i porównać przylegające pneumokoki z innych schorzeń do tego stanu.

Wyniki

Wyniki reprezentatywnego eksperymentu, w którym pneumokoki (S. pneumoniae PMP843, kolonizujący izolat 19F) zostały dodane do komórek CCL-23 1 godzinę po dodaniu S. salivarius, a przestrzeganie zaleceń dotyczących pneumokoków zostało określone ilościowo zarówno przez liczbę żywotnych, jak i lytA qPCR, przedstawiono w Tabeli 2. Wyniki były spójne między obiema metodami zarówno dla bezwzględnej liczby bakterii (przedstawionej jako jtk/ml), jak i % przylegania, znormalizowanego do ...

Dyskusja

Krytyczną częścią tego testu jest dodanie odpowiednich stężeń S. salivarius i pneumokoków w sekcjach 3.1.7 i 3.1.12. Stężenia są szacowane na podstawie odczytów OD, ale dokładna inokula nie jest określana, dopóki płytki nie zostaną policzone następnego dnia. Z tego powodu zalecamy wykonanie krzywych wzrostu w celu zmierzenia OD i liczby żywotnych (CFU/ml) w czasie dla wszystkich szczepów bakteryjnych użytych w teście, aby zidentyfikować środkową fazę logarytmiczną i pomóc w oszacowaniu stężenia przez OD. Ponadto...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Minimalna zawartość podstawowych pożywek (MEM)	Thermo Fisher Scientific	SH30244.01
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30084.03
Kolba T-75	Nunc	156472
Ogniwa CCL-23	ATCC	CCL-23
Technologie Trypsyna	Życia	15090046
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej	Nunc	142475
Płytki z agarem z krwią końską (HBA)	Oxoid	PP2001	Dopuszczalne są również płytki z agarem z krwią owczą
Todd-Hewitt	Broth	Oxoid CM0189
Ekstrakt z drożdży	Beckton Dickinson	212750
Digitonina	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Kuwety jednorazowe	Kartell	1938
Heparyna	Pfizer	2112105	jest dostępna w sterylnych ampułkach w dawce 5 000 j.m./5m/
Sterylny rozsiewacz	Technoplas	S10805050	alternatywnie, rozsiewacz do szkła może być zanurzony w 96% etanolu i sterylizowany płomieniowo przed każdym użyciem
Lizozym	Sigma-Aldrich	L6876
Mutanolizyna	Sigma-Aldrich	M9901
Proteinaza K	Qiagen	19133
SDS 20% roztwór	Ambion	AM9820
RNaza A	Qiagen	19101
Mini-zestaw QIAamp DNA (250)	Qiagen	51306
Podkład LytA F	Sigma-Aldrich	Wykonany na zamówienie	sekwencja 5' -> 3' ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
Podkład LytA R	Sigma-Aldrich	Wykonany na zamówienie	sekwencja 5' -> 3'  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
Sonda LytA	Eurogentec	Wykonana na zamówienie	sekwencja 5' -> 3' Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, można stosować alternatywne fluorofory
Woda wolna od nukleaz	Ambion	AM9906
Brilliant III Ultra Szybki QPCR mastermix	Agilent Technologies	600880
Thermo-Fast 96 Płytka detekcyjna	Thermo Fisher Scientific	AB-1100
Ultraprzezroczyste paski z nakrętką qPCR	Thermo Fisher Scientific	AB-0866
System QPCR Mx3005	firmy Agilent Technologies	401449
*Alternatywne źródła są dostępne dla większości/wszystkich wymienionych