Ablacja pojedynczej komórki z ośmiokomórkowych zarodków skorupiaka z rodziny Amphipod Parhyale hawaiensis

Podsumowanie

Obuzd Parhyale hawaiensis jest obiecującym organizmem modelowym do badań embriologii skorupiaków oraz porównawczego rozwoju i ewolucji stawonogówów. Protokół ten opisuje metodę ręcznego usuwania pojedynczych blastomerów z zarodków Parhyale we wczesnym stadium rozszczepienia.

Streszczenie

Amfiod Parhyale hawaiensis to mały skorupiak występujący w międzypływowych siedliskach morskich na całym świecie. W ciągu ostatniej dekady Parhyale stał się obiecującym organizmem modelowym do laboratoryjnych badań rozwojowych, dostarczając użytecznego porównania grupy zewnętrznej z dobrze zbadanym organizmem modelowym stawonogów Drosophila melanogaster. W przeciwieństwie do syncytialnych rozszczepieniach Drosophila, wczesne rozszczepienia Parhyale są holoblastyczne. Mapowanie losu za pomocą barwników znacznikowych wstrzykniętych do wczesnych blastomerów wykazało, że wszystkie trzy listki zarodkowe i linia zarodkowa są tworzone w stadium ośmiokomórkowym. Na tym etapie trzy blastomery są przeznaczone do powstania ektodermy, trzy są przeznaczone do powstania mezodermy, a pozostałe dwa blastomery są prekursorami odpowiednio endodermy i linii zarodkowej. Jednak eksperymenty z ablacją blastomerów wykazały, że zarodki Parhyale posiadają również znaczące zdolności regulacyjne, tak że losy blastomerów poddanych ablacji w stadium ośmiokomórkowym mogą zostać przejęte przez potomków niektórych pozostałych blastomerów. Ablacja blastomerów była wcześniej opisywana za pomocą jednej z dwóch metod: iniekcji, a następnie aktywacji barwników fototoksycznych lub ablacji manualnej. Jednak fotoablacja zabija blastomery, ale nie usuwa martwego ciała komórkowego z zarodka. Całkowite fizyczne usunięcie określonych blastomerów może być zatem preferowaną metodą ablacji w niektórych zastosowaniach. W tym miejscu przedstawiamy protokół ręcznego usuwania pojedynczych blastomerów z ośmiokomórkowego stadium zarodków Parhyale, ilustrując narzędzia i procedury manualne niezbędne do całkowitego usunięcia ciała komórki przy jednoczesnym utrzymaniu pozostałych blastomerów przy życiu i nienaruszonym. Protokół ten można zastosować do dowolnej komórki Parhyale w stadium ośmiu komórek lub do blastomerów w innych wczesnych stadiach rozszczepienia. Ponadto, w zasadzie, protokół ten może mieć zastosowanie do zarodków we wczesnym stadium rozszczepienia innych holoblastycznie rozszczepiających bezkręgowców morskich.

Wprowadzenie

Skorupiak z Parhyale hawaiensis pojawił się w ciągu ostatniej dekady jako obiecujący organizm modelowy o dużym potencjale do wykorzystania w badaniach nad ewolucyjną biologią rozwoju¹. Wśród stawonogów większość systemów modelowych to owady, a najszerzej badanym z nich jest muszka owocowa Drosophila melanogaster. D. melanogaster należy do rzędu owadów Diptera i jako taki wykazuje wiele cech embriologicznych, które są wywodzące się w odniesieniu do tych u owadów rozgałęziających się zasadniczo². Co więcej, owady są zagnieżdżone w podtypie Pancrustacea³, co oznacza, że owady mają swoich najbliższych krewnych w długotrwałej "naturalnej" grupie zwanej pancrustaceans, i że ta grupa jest parafiletyczna. Sugeruje to, że oprócz zasadniczo rozgałęzionych modeli owadów, potrzebne są badania innych skorupiaków, aby uzyskać szerszy pogląd na ewolucyjną historię cech rozwojowych i mechanizmów molekularnych, które zostały tak dobrze zbadane u D. melanogaster. Jednak bardzo niewiele skorupiaków jest dobrze przygotowanych do eksperymentalnej analizy laboratoryjnej rozwoju. Amfiod P. hawaiensis jest wysoce elastycznym laboratoryjnym systemem modelowym, podatnym na szereg technik eksperymentalnych. Obunogi wykazują wiele unikalnych cech w obrębie swojego nadrzędnego rzędu Peracarida (skoczki plażowe, scudy i krewetki studzienne) i dlatego uważa się, że pochodzą stosunkowo z tej grupy skorupiaków. Niemniej jednak, względna łatwość embriologicznej i funkcjonalnej manipulacji genetycznej oferowana przez Parhyale sprawia, że ten amfipod jest cennym dodatkiem do obecnego inwentarza organizmów modelowych.

Jako zwierzę laboratoryjne, P. hawaiensis oferuje wiele zalet. Zwierzęta są tolerancyjne na szeroki zakres temperatur i zasolenia i dobrze przeżywają w dużych kulturach sztucznej wody morskiej¹. Łatwo jest odróżnić samce i samice na podstawie wyraźnych różnic morfologicznych, w szczególności dużych, haczykowatych, przednich wyrostków tułowia, których samce używają do chwytania samic podczas krycia. Do prac embriologicznych i rozwojowych P. hawaiensis ma kilka bardzo atrakcyjnych cech. Embriogeneza trwa około 10 dni, a czas do dojrzałości płciowej wynosi około sześciu tygodni w temperaturze 28 ºC (należy jednak pamiętać, że Parhyale przeżywa dobrze w temperaturach w zakresie około 20-30 ºC, a szczegółowe informacje na temat stopnia zaawansowania rozwoju są dostępne dla zarodków hodowanych w temperaturze¹⁸ ºC 4, 25 ºC⁴ i 26 ºC^5,6). Dorosłe osobniki łączą się w pary przez cały rok w laboratorium, więc zarodki są dostępne o każdej porze roku. Samice składają od 2 do 20 (w zależności od wieku samicy) zapłodnionych jaj do brzusznej torby lęgowej znajdującej się między kilkoma pierwszymi parami nóg (ryc. 1A i 1B) i możliwe jest zebranie tych zarodków na bardzo wczesnym etapie rozwoju bez zabijania samicy lub uszkadzania zarodków (ryc. 1C). Zarodki przeżywają w przefiltrowanej sztucznej wodzie morskiej aż do wylęgu, mogą być utrwalone do późniejszej ekspresji genów lub analizy histologicznej⁷, a szczegółowa tabela etapów pozwala na dokładną identyfikację postępów w rozwoju⁵. Solidne protokoły zostały wykorzystane do przeprowadzenia analizy ekspresji genów poprzez hybrydyzację in situ ^8-15 lub barwienie immunologiczne^4,16,17, funkcjonalne knockdown przez interferencję RNA^13,15 lub morpholinos¹² oraz stabilną transgenezę linii zarodkowej¹⁸. Korzystając z systemu transgenezy, metody indukowalnej ekspresji¹⁴ i pułapki wzmacniającej¹⁹ mogą być również wykorzystane do zbadania funkcji genów u P. hawaiensis. Chociaż publicznie dostępna sekwencja genomu nie jest obecnie dostępna, transkryptom zawierający transkrypty wytworzone podczas oogenezy i embriogenezy został de novo zgromadzony i opisany²⁰ oraz zdeponowany w przeszukiwalnej bazie danych²¹, co ułatwia odkrywanie genów. Podsumowując, P. hawaiensis jest wysoce elastycznym organizmem modelowym, nadającym się do wielu eksperymentalnych i genetycznych podejść do zrozumienia rozwoju.

W przeciwieństwie do wczesnych syncytialnych rozszczepień D. melanogaster, zarodki P. hawaiensis rozszczepiają się holoblastycznie po zapłodnieniu (Rysunek 2A). Analiza śledzenia linii wykazała, że przy trzecim rozszczepieniu każdy z blastomerów trzeciego rozszczepienia jest specyficznie przeznaczony do powstania jednego z trzech listków zarodkowych lub linii zarodkowej⁶ (ryc. 2B). Dane te, wraz z danymi z mikromacierzy²², analizami linii komórkowych^6,23 i eksperymentami z izolacją blastomerów4 sugerują, że potencjały rozwojowe są segregowane do co najmniej niektórych blastomerów trzeciego rozszczepienia przez asymetryczne dziedziczenie determinantów losu komórki. W związku z tym w eksperymentach z ablacją blastomerów, w których prekursor linii zarodkowej (określany jako "g" w nomenklaturze⁶ linii komórek Parhyale) został usunięty w stadium ośmiu komórek, zarodki nie miały komórek rozrodczych w późniejszych stadiach rozwojowych⁴, na co wskazuje brak komórek wyrażających białko Vasa, które jest markerem linii zarodkowej u większości metazoanów²⁴. W przeciwieństwie do tego, eksperymenty z somatyczną ablacją blastomerów wykazały, że zarodki P. hawaiensis posiadają również znaczące zdolności regulacyjne, tak że los blastomerów mezodermy lub prekursorów ektodermy uległych ablacji w stadium ośmiokomórkowym może zostać przejęty przez potomków niektórych z pozostałych blastomerów²⁵. Nie wiadomo, w jaki sposób może zachodzić regulacyjna zamiana losu komórki i w jakim stopniu autonomiczne przyjmowanie losu komórki przez blastomery somatyczne pozostaje nieznane. Eksperymentalne techniki embriologiczne, takie jak ablacja blastomerów, mogą być przydatne w zrozumieniu względnej autonomii i braku autonomii decyzji dotyczących losu komórki^26,27 i dlatego są interesujące w badaniach nad embriogenezą P. hawaiensis.

W eksperymentach, które wykazały regulacyjną wymianę linii ektodermalnych i mezodermalnych, ablacja blastomerów była wykonywana przez wstrzyknięcie²⁸ i późniejsze wzbudzenie barwników fototoksycznych²⁵. Chociaż technika ta jest skuteczna w zabijaniu wstrzykniętego blastomeru (blastomerów), nie usuwa całkowicie martwego ciała komórkowego z zarodka. Ponadto zaobserwowano różnice między danymi dotyczącymi linii komórkowych zebranymi aż do etapów gastrulacji embriogenezy poprzez wstrzyknięcie blastomerów z fluorescencyjnymi znacznikami linii^28,29, a danymi zebranymi przez śledzenie niezaburzonych blastomerów przez rozwój tych samych stadiów embrionalnych²³. Całkowite fizyczne usunięcie określonych blastomerów może być zatem preferowaną metodą ablacji w niektórych zastosowaniach.

Wcześniej opublikowaliśmy wyniki analiz linii komórkowych embrionów, w których pojedyncze komórki były ręcznie ablowane²³. Jednak delikatne operacje wymagane do usunięcia pojedynczych blastomerów z zarodków we wczesnym stadium rozszczepienia nie zostały jeszcze w pełni opisane. W niniejszej pracy przedstawiono protokół pobierania zarodków P. hawaiensis oraz ręcznej ablacji pojedynczego blastomeru z zarodka w stadium ośmiokomórkowym. Celem tej metody jest osiągnięcie całkowitego usunięcia ciała komórki z zarodka, co pozwala na obserwację zachowań komórkowych i kompetencji losu komórek pozostałych komórek podczas embriogenezy i rozwoju postembrionalnego. Nasz protokół pokazuje usunięcie prekursora linii zarodkowej g (ryc. 2C), ale może być zastosowany do dowolnej komórki w stadium ośmiokomórkowym lub do blastomerów we wcześniejszych stadiach rozszczepienia. Zasadniczo protokół ten może być stosowany do usuwania pojedynczych komórek z zarodków we wczesnej fazie rozszczepienia innych holoblastycznie rozszczepiających bezkręgowców morskich.

Protokół

Komentarze, które mogą być pomocne w wykonaniu określonych kroków, są zaznaczone kursywą.

1. Dzień 1: Przygotowanie materiałów

1. Przygotuj następujące materiały (patrz Tabela Materiałów i Wyposażenia):
   • Pipety Pasteura 15 cm i 22 cm
   • Diamentowy skryba
   • przefiltrowana sztuczna woda morska (zasolenie między 0,0018-0,0020) zawierająca 1 mg/ml amfoterycyny B (1:100 z 100 mg/ml roztworu podstawowego), 100 jednostek/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny (1:50 roztworu podstawowego zawierającego 5 000 jednostek/ml penicyliny i 5 000 mg/ml streptomycyny)
   • filtrowana sztuczna woda morska (zasolenie między 0,0018-0,0020) bez dodatków
   • duży plastikowy pojemnik do zakwaterowania par (co najmniej 15 cm x 15 cm x 5 cm)
   • małe (3 cm lub 5 cm) szalki Petriego wyłożone Sylgardem
   • małe (3 cm lub 5 cm) szalki Petriego
   • szkiełko zegarkowe lub szklana płytka wielodołkowa
   • kleszcze (używamy kleszczy pochodzących ze starych kleszczy Dumont #5, które zostały przypadkowo uszkodzone w innych procedurach laboratoryjnych, które zmieniliśmy za pomocą kamienia do ostrzenia kleszczy, aby upewnić się, że końce kleszczy są gładkie, że oba zęby są tej samej długości i że nie mają już ostrych końcówek. Niezwykle cienkie kleszcze, takie jak nowe kleszcze Dumont #5, są niepożądane, ponieważ mogą uszkodzić zarodki i/lub samice.)
   • pipeta Pasteura z poszerzonym końcem (patrz krok 1.2 poniżej)
   • narzędzie do pobierania zarodków składające się z cienkiego, zakrzywionego drutu wolframowego osadzonego w cienkim końcu pipety Pasteura (może być zastąpione alternatywnym narzędziem; patrz ppkt 1.3 poniżej)
   • pipeta doustna z małym otworem (patrz krok 1.4 poniżej)
   • szklana igła wykonana z ciągniętej szklanej kapilary (patrz krok 1.5 poniżej)
   W protokole tym nie stosuje się materiałów toksycznych dla ludzi. Badacze powinni jednak upewnić się, że noszą rękawice lub inny strój ochronny zgodnie z wytycznymi dotyczącymi zarządzania ryzykiem obowiązującymi w ich instytucji.
2. Aby wykonać poszerzoną pipetę Pasteura, najpierw naciąć około 15 cm pipety Pasteura w miejscu, w którym pipeta zaczyna się zwężać, za pomocą rysika diamentowego, owinąć nacięty obszar pipety w Kimwipe lub ręczniku papierowym, aby chronić palce, a następnie ostrożnie odłamać końcówkę na linii nacięcia. Przytrzymaj złamany koniec pipety nad płomieniem palnika Bunsena przez kilka sekund, aby wygładzić krawędzie. Otwór powinien być nieco węższy niż maksymalna szerokość pipety.
3. Aby wykonać narzędzie do preparowania drutu wolframowego, włóż drut wolframowy do końca szklanej pipety Pasteura o średnicy 15 cm i przytrzymaj krótko nad płomieniem palnika Bunsena, aby stopić szkło, mocując drut na miejscu. Użyj kleszczy, aby delikatnie wygiąć koniec drutu w haczykowaty kształt. Zobacz rysunek 3, aby zapoznać się z przykładem odpowiedniego kształtu dla tego narzędzia.
4. Aby zrobić mały otwór na pipetę doustną, przeciągnij cienką końcówkę pipety Pasteura o długości 22 cm na dwie części nad płomieniem i odłam końcówkę małego końca. Włóż do końcówki uchwytu na pipety do ust.
5. Wykonaj szklaną igłę, która będzie używana do nakłuwania badanych blastomerów podczas procedury ablacji, za pomocą ściągacza do igieł. Igła o odpowiednim kształcie jest pokazana na rysunku 4. Igła ta została naciągnięta na ściągacz igłowy Sutter P97 za pomocą programu o parametrach 2x(ciepło = 566, ciągnięcie = 100, prędkość = 20, czas = 250) + 1X (ciepło = 566, pociągnięcie = 100, prędkość = 100, czas = 250). Konkretny program i instrument używany do wykonania igły może się różnić, ale igła musi mieć cienki czubek, a jednocześnie być wystarczająco mocna, aby nie pękła przy nacisku na kosmówkę zarodka.

2. Dzień 1: Zbieranie par godowych Parhyale

1. Użyj poszerzonej pipety Pasteura (krok 1.2 powyżej), aby zebrać par P. hawaiensis z dużego pojemnika na hodowlę i przenieść je do oddzielnego pojemnika zawierającego czystą sztuczną wodę morską. Nie jest konieczne, aby ta woda morska była filtrowana. Najlepiej jest zebrać pary kryjące się późnym popołudniem i pozostawić je na noc w temperaturze pokojowej (20-23 ºC), tak aby następnego ranka większość zarodków była niedawno zapłodniona i zdeponowana, a więc we wczesnych stadiach rozszczepienia nadająca się do ablacji. Zbierz co najmniej 20 par godowych, aby upewnić się, że niektóre samice będą nosiły zarodki we wczesnej fazie rozszczepienia do następnego ranka.

3. Dzień 2: Zbieranie zarodków Parhyale

• Następnego ranka zainfauuj przefiltrowaną sztuczną wodę morską (FASW) CO₂ . Niektóre samice będą pływać swobodnie od samców w nocy; zebrać te oddzielone samice i znieczulić je w FASW / CO₂. Pozostałe niesparowane samce można wyjąć z pojemnika na pary godowe i przywrócić do dużej kultury. Pozostałe pary kryjące można zachować do pobrania zarodków później tego samego dnia lub następnego dnia.
• Przenieść pojedynczą znieczuloną kobietę z zarodkami do szkiełka zegarkowego w FASW / CO₂. Wszystkie oddzielone samice prawdopodobnie złożą jaja, które będą widoczne gołym okiem jako bladoróżowe lub fioletowe sferoidy przez przezroczyste płytki biodrowe samic (ryc. 1A). Aby ustalić, czy zarodki są we wczesnym stadium rozszczepienia, a zatem nadają się do ablacji blastomerami, badacz będzie musiał usunąć zarodki z torby lęgowej i zbadać je pod mikroskopem.
• Oglądając zabieg pod mikroskopem preparacyjnym, chwyć kleszczem płytki biodrowe wzdłuż jednej strony ciała. Zarodki będą widoczne w brzusznej torbie lęgowej między tymi płytkami biodrowymi (ryc. 1B).
• Włóż cienkie, zakrzywione narzędzie druciane (Rysunek 3; krok 1.3 powyżej) do tylnego końca torby lęgowej i delikatnie podnieś drut w kierunku przedniego końca woreczka lęgowego, aby oddzielić pokrycia woreczka lęgowego (są to zmodyfikowane brzuszne przydatki zwane oostegites³⁰), otwierając woreczek i rozluźniając zarodki. Zarodki, które znajdują się w ciągu pierwszej godziny od złożenia, są zamknięte w bardzo cienkiej, przezroczystej błonie, która łatwo zostanie przerwana przez druciane narzędzie; Błona ta znika po około 2-3 godzinach od złożenia jaj, a zarodki nie są w żaden sposób związane ze sobą ani z samicą od tego momentu przez cały okres embriogenezy. Jeśli badacze uznają, że manewrowanie zakrzywionym drucianym narzędziem do usuwania zarodków z torby lęgowej jest niewygodne lub trudne, można użyć alternatywnego narzędzia, o ile ruchy są delikatne i nie wywiera się ostrego nacisku na zarodki lub torbę lęgową. Inne narzędzia odpowiednie do usuwania zarodków z torby lęgowej to kleszcze lub szklana kapilara z uszczelnionym i wygładzonym końcem.
• Za pomocą niezmienionej pipety Pasteura o długości 15 cm przepłukać wodę przez otwartą torebkę z czerwiem, wypychając zarodki, które powinny osiąść na dnie szkiełka zegarka. Przenieść samicę do czystego FASW (bez CO₂ ), aby umożliwić regenerację przed ponownym wprowadzeniem jej do głównej hodowli. Wiele samic można umieścić w tym samym naczyniu regeneracyjnym, ale pozwól samicom w pełni wyzdrowieć przed powrotem do głównej kultury, ponieważ mogą zostać zjedzone przez inne zwierzęta, jeśli nadal są częściowo znieczulone.
• Za pomocą niezmienionej pipety Pasteura o długości 15 cm przenieś zarodki na szalkę Petriego z czystym FASW i obejrzyj pod mikroskopem, aby określić ich stadium embrionalne. Oddzielne zarodki, które znajdują się w trzecim rozszczepieniu (etap 4 ⁵), które nadają się do tej procedury. Powinno być również możliwe zastosowanie tego protokołu do każdego etapu rozszczepienia przed powstaniem krążka zarodkowego (etapy 7-8, ⁵).

4. Dzień 2: Ablacja pojedynczych komórek

1. Wypełnij szalkę Petriego wyłożoną Sylgardem płytką warstwą FASW. Użyj niezmienionej pipety Pasteura o długości 15 cm, aby przenieść pojedynczy zarodek na płytkę.
2. Za pomocą kleszczy delikatnie przetocz zarodek, aby zidentyfikować komórkę, która ma zostać poddana ablacie (ryc. 2A i 2B). Prekursor linii zarodkowej g może być zidentyfikowany jako najmniejszy mikromer, który znajduje się na najmniejszym makromerze Mav. Ponadto g nie styka się bezpośrednio z komórką en, która jest mikromerem znajdującym się naprzeciwko niej, ponieważ prekursor mezodermy mikromery ml i mr mają wspólną granicę komórkową w środku zarodka. MR to blastomer po prawej stronie G, a ml to mikromer po lewej stronie G. Siostrzanymi makromerami mr, ml i en są prekursory ektodermy odpowiednio Er, El i Ep.
3. Z kleszczami w lewej ręce, jeśli badacz jest praworęczny (lub w prawej ręce, jeśli badacz jest leworęczny), ustaw zarodek z komórką będącą przedmiotem zainteresowania w prawo (lub w lewo, jeśli badacz jest leworęczny) i delikatnie chwyć zarodek między kleszczami, aby go ustabilizować.
4. Za pomocą wyciągniętej szklanej igły (krok 1.5 powyżej; Ryc. 4), delikatnie nakłuj komórkę będącą przedmiotem zainteresowania. Nie należy wkładać igły zbyt głęboko, aby nie wepchnąć igły w komórki sąsiadujące lub poniżej komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Igła musi jedynie przebić kosmówkę i znajdującą się pod nią błonę komórkową i nie musi sięgać głęboko w komórkę, która ma zostać poddana ablacji.
5. Zamień igłę używaną do nakłuwania zarodka na szklaną końcówkę pipety do jamy ustnej na cienką wyciągniętą końcówkę pipety Pasteura (krok 1.4 powyżej). Trzymaj końcówkę pipety blisko otworu utworzonego w interesującej nas komórce i bardzo delikatnie odsysaj.
6. Bardzo delikatnie ściśnij zarodek kleszczami. Gdy zawartość blastomeru jest wypychana z kosmówki przez otwór utworzony w kroku 4.4, należy ją zassać do pipety ustnej, aby umożliwić niezakłócony widok zarodka. Jeśli jest wystarczająco duża, można zauważyć, że jądro przebitej komórki również się wyłania. Jest to dobra kontrola, aby upewnić się, że cała zawartość komórki została usunięta i nie można jej ponownie zregenerować.
7. Uważnie obserwuj zarodek, gdy badany blastomer jest usuwany. Granica przebitej komórki cofnie się w kierunku w kosmówce, dzięki czemu przecięcia komórek znajdujących się pod spodem staną się widoczne. Kontynuuj wywieranie nacisku, aż cały interesujący nas blastomer zostanie usunięty. Użyj kleszczy, aby przetoczyć zarodek z boku na bok i wizualnie potwierdź, że cały interesujący nas blastomer zniknął.
8. Za pomocą niezmienionej pipety Pasteura o długości 15 cm przenieś zarodek do czystego FASW+ (FASW + 1 mg/ml amfoterycyny B, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny).
9. Hoduj zarodki po ablacji blastomerów w indywidualnych dołkach na czystej 48-dołkowej płytce w FASW+, zmieniając 50% FASW+ uzupełnionego antybiotykiem dziennie. W naszych rękach zarodki przeżywają i rozwijają się dobrze, nawet po ablacji, w zakresie temperatur od 18 do 28 ºC. Naukowcy powinni hodować swoje zarodki w temperaturze, dla której mają czystą (ale niekoniecznie sterylną) powierzchnię, na której mogą hodować zarodki przy minimalnych zakłóceniach. Aby móc porównać czas zdarzeń rozwojowych w zarodkach poddanych ablacji blastomerem z grupą kontrolną, odsyłamy czytelnika do szczegółowych informacji na temat stopnia zaawansowania rozwoju, które są dostępne dla zarodków hodowanych w temperaturze¹⁸ ºC 4, 25 ºC⁴ i 26 ºC^5,6.

Wyniki

Po pomyślnej ablacji pojedynczych mikromerów P. hawaiensis w trzecim podziale, zgodnie z opisem w niniejszym protokole, pozostałe mikromery stopniowo i nieznacznie zmieniają swoje położenie, aby częściowo zająć przestrzeń wcześniej zajmowaną przez ablacyjny blastomer. Na przykład po usunięciu g, sąsiednie blastomery mr oraz ml lekko się przesuwają i zaczynają dzielić boczny brzeg komórkowy, który wcześniej znajdował się w bezpośrednim kontakcie z g

Dyskusja

Opisujemy protokół ręcznej ablacji i całkowitego fizycznego usunięcia pojedynczych blastomerów z wczesnych stadiów rozszczepienia amfipoda P. hawaiensis. Demonstrujemy zastosowanie tego protokołu, usuwając pojedynczą komórkę progenitorową linii zarodkowej g z zarodka w stadium ośmiokomórkowym i pokazujemy, że ablacja zakończyła się sukcesem, potwierdzając brak komórek potomnych g w późniejszej embriogenezie. Protokół ten może być stosowany do usuwania dowolnych mikromerów z zaro...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pipeta Pasteura 15 cm	Wheaton	53499-630 VWR	Do przenoszenia nienaruszonych i ablowanych blastomerem zarodków z naczynia na szalkę.
Pipeta Pasteura 22 cm	Wheaton	53499-632 VWR	Do wykonywania końcówek do pipet doustnych.
3 cm szalki Petriego	Thermo Scientific	25382-334 VWR	Użyj niektórych niezmienionych do pobierania i przechowywania zarodków; pokryj niektóre warstwą Sylgardu (patrz poniżej), aby stworzyć powierzchnię roboczą do ablacji blastomerów.
Płytki 48-dołkowe	Greiner Bio-One	82051-004 VWR	Do hodowli zarodków po ablacji.
Filtry butelkowe 0,2 i mikro; m	Nalge Nunc International	28199-296 VWR	Za utworzenie FASW (patrz poniżej).
Palnik Bunsena	VWR	89038-530 VWR	Do tworzenia narzędzia z drutu wolframowego i pipety z cienką końcówką do ust.
Rysik diamentowy	Musco Sports Lighting	52865-005 VWR	Do tworzenia pipet Pasteura z szerokim otworem do zbierania par.
Kleszcze	Fine Science Tools	11050-10 Fine Science Tools	Do trzymania znieczulonych samic podczas usuwania zarodków z torby lęgowej. Nie muszą to być kleszcze Dumonta z cienką końcówką - końcówki mogą być co najmniej tak, jak końcówki kleszczy, dla których numer katalogowy jest tutaj podany.
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942 Sigma Aldrich	Dodać do FASW do końcowego stężenia 1 mg/ml i użyć tego roztworu do hodowli zarodków poddanych blastomerowi.
Szklane kapilary o długości 4 cali, 1/0,58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4 World Precision Instruments	Do wykonywania igieł do nakłuwania blastomeru do ablacji.
Szklane szkiełko zegarkowe o średnicy 300 mm	Mikroskopia elektronowa Nauki	70543-30 Nauki o mikroskopii elektronowej	Do stosowania przy usuwaniu zarodków z torby lęgowej znieczulonych samic.
Sztuczna woda morska Instant Ocean (ASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	Wytwarza ASW, rozpuszczając sól w wodzie dejonizowanej do zasolenia 1,022-1,024.
Sztuczna woda morska filtrowana przez ocean (FASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	wykorzystuje 0,2 i mikro; m filtry do sterylizacji ASW. W razie potrzeby uzupełnić w małych ilościach (< 250 ml).
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026 VWR	Do bezpiecznego odłamywania cienkiej końcówki pipet Pasteura zmodyfikowanych do zbierania par.
Adapter do pipet doustnych	Drummond Labware	A5177-5EA Sigma Aldrich	Włóż cienką końcówkę pipety Pasteura do tego końca, która ma być używana do usuwania wytłaczanej zawartości komórek podczas procedury ablacji.
Rurka do pipety do ust	Aldrich	Z280356 Sigma Aldrich	Przytnij ją tak, aby była wystarczająco długa, aby wygodnie wisiała na szyi podczas zabiegu ablacji.
Ściągacz igieł	Sutter Instrument Company	P97 Sutter Instrument Company	Do wykonywania igieł ze szklanych naczyń włosowatych do nakłuwania blastomeru do ablacji.
Roztwór penicyliny-streptomycyny	Mediatech	45000-650 VWR	Dodać do FASW do końcowego stężenia 100 jednostek/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny i użyć tego roztworu do hodowli zarodków poddanych ablacji blastomerowej.
Gumowa bańka	Mikroskopia elektronowa Sciences	100488-418 VWR	Do używania pipet Pasteura do przenoszenia zarodków z naczynia na talerz
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604 Fisher Scientific	Uzupełnij makijaż zgodnie z instrukcją producenta. Wlej warstwę o grubości 2-5 mm na 3-centymetrową szalkę Petriego, aby stworzyć powierzchnię roboczą do ablacji blastomerów.
Drut wolframowy o średnicy 0,004 cala	Systemy AM	719000 Systemy AM	Użyj tego, aby stworzyć narzędzie do usuwania zarodków z torby lęgowej znieczulonych samic.

.