Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku po technice analizy fluktuacji k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) do pomiaru współczynników dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych białek błony plazmatycznej w żywych komórkach ssaków.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Łatwy pomiar współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej znakowanych EGFP za pomocą spektroskopii korelacji obrazów k-space
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dyfuzja boczna i kompartmentalizacja białek błony komórkowej są ściśle regulowane w komórkach, dlatego badanie tych procesów ujawni nowe informacje na temat funkcji i regulacji białek błony komórkowej. Niedawno opracowano spektroskopię korelacji obrazów k-Space (kICS)1, aby umożliwić rutynowe pomiary współczynników dyfuzji bezpośrednio z obrazów znakowanych fluorescencyjnie białek błony plazmatycznej, co pozwoliło uniknąć systematycznych błędów wprowadzonych przez fotofizykę sondy. Chociaż podstawy teoretyczne analizy są złożone, metoda może być wdrażana przez osoby niebędące ekspertami przy użyciu ogólnodostępnego kodu do pomiaru współczynników dyfuzji białek. kICS oblicza funkcję korelacji czasowej na podstawie stosu obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej po transformacji Fouriera każdego obrazu do przestrzeni odwrotnej (k-). Następnie uśrednianie kołowe, transformacja logarytmu naturalnego i dopasowania liniowe do funkcji korelacji dają współczynnik dyfuzji. Niniejszy artykuł zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący analizy obrazu i pomiaru współczynników dyfuzji za pomocą kICS.
Po pierwsze, za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego uzyskuje się sekwencję obrazu o wysokiej liczbie klatek na sekundę fluorescencyjnie znakowanego białka błony plazmatycznej. Następnie wybierany jest obszar zainteresowania (ROI) unikający organelli wewnątrzkomórkowych, ruchomych pęcherzyków lub wystających obszarów błony. Stos ROI jest importowany do ogólnodostępnego kodu, a kilka zdefiniowanych parametrów (patrz sekcja Metoda) jest ustawianych do analizy kICS. Następnie program generuje wykres "nachylenie zboczy" na podstawie funkcji korelacji czasowej w przestrzeni k, a współczynnik dyfuzji jest obliczany na podstawie nachylenia wykresu. Poniżej znajduje się procedura kICS krok po kroku do pomiaru współczynnika dyfuzji białka błonowego przy użyciu kanału wodnego nerek akwaporyny-3 oznaczonej EGFP jako przykładu kanonicznego.
Wprowadzenie
Czterowymiarowa organizacja czasoprzestrzenna i boczna ruchliwość białek błony plazmatycznej są ściśle regulowane i mogą odgrywać rolę w funkcjonowaniu, aktywności i interakcjach białko-białko. Dyfuzja boczna białek błony plazmatycznej była tradycyjnie badana poprzez obliczanie współczynników dyfuzji dla pojedynczych cząstek na podstawie obrazowania poklatkowego białek błony plazmatycznej znakowanych kropkami kwantowymi lub barwnikiem2-4. Takie podejście wymaga wstawienia znacznika zewnątrzkomórkowego do białka błony plazmatycznej w celu znakowania kropkami kwantowymi lub barwnikiem, co może zagrozić fałdowaniu i funkcji białka, a zatem nie może być osiągni....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Akwizycja białek oznaczonych EGFP w błonie plazmatycznej do analizy kICS może być wykonana na mikroskopie epifluorescencyjnym, ustawie TIRF lub na mikroskopie z wirującym dyskiem w celu uzyskania obrazów interesującej nas błony. Do analizy potrzebny jest rozmiar piksela kamery, a także czas między klatkami obrazu. Do analizy można wykorzystać sekwencje obrazów o długości 100-1 200 klatek z częstotliwością odświeżania 4-30 Hz. Podczas akwizycji ważne jest, aby przez cały czas trwania obrazowania utrzymywać ostrość błony i skupić się na ułamku płaskiej błony, w której fluorescencja jest równomiernie rozprowadzona. Ruchome pęcherzyki, wystające obszary błony i organelle ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby uzyskać odpowiednie stosy obrazów do analizy metodą kICS, można wykorzystać różne systemy mikroskopowe. Możliwa jest analiza sekwencji obrazów z mikroskopu epi-fluorescencyjnego, jak również z układu TIRF lub mikroskopu z dyskiem obrotowym (spinning disk). Błona musi być płaska, bez dużych, ruchomych organelli komórkowych lub ruchomych pęcherzyków/obiektów. Niniejsza praca przedstawia sekwencję obrazów time-lapse białka AQP3 znakowanego EGFP w żywych komórkach MDCK, obrazowanych na mikroskopie z dyskiem obrotowym z o.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule przedstawiono szczegółowy przegląd krok po kroku, w jaki sposób można zastosować metodę analizy kICS do wyznaczania współczynników dyfuzji na podstawie obrazów mikroskopowych białek znakowanych białkami fluorescencyjnymi. Analiza jest niezależna od wyboru sondy o bardzo szerokim zakresie dynamiki gęstości znakowania, a zatem może być również stosowana do białek znakowanych kropkami kwantowymi, a także barwników i białek fluorescencyjnych, takich jak EGFP.
Aby obliczyć prawidłowe wsp.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Lundbeck Junior Group Leader Fellowship dla LNN. PWW dziękuje za wsparcie finansowe ze strony Kanadyjskiej Rady ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC). Dziękujemy również Duńskiemu Centrum Bioobrazowania Molekularnego na Uniwersytecie Południowej Danii za dostęp do mikroskopii z wirującym dyskiem.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 31600-083 | |
| FBS | Invitrogen | 10082147 | |
| Penicilin | Sigma | 13752 | |
| Kanamycyna | Gibco | 15160070 | |
| Streptomycyna | Gibco | 11860038 | |
| Czerwone wolne podłoże fenolowe | Gibco | 11880-028 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Aparatura | |||
| Wirujący dysk Mikroskop | Nikon | Ti Eclipse | |
| EMCCD Kamera | Andor | Ixon+ |
Bibliografia
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
