Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku po technice analizy fluktuacji k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) do pomiaru współczynników dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych białek błony plazmatycznej w żywych komórkach ssaków.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Łatwy pomiar współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej znakowanych EGFP za pomocą spektroskopii korelacji obrazów k-space
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dyfuzja boczna i kompartmentalizacja białek błony komórkowej są ściśle regulowane w komórkach, dlatego badanie tych procesów ujawni nowe informacje na temat funkcji i regulacji białek błony komórkowej. Niedawno opracowano spektroskopię korelacji obrazów k-Space (kICS)1, aby umożliwić rutynowe pomiary współczynników dyfuzji bezpośrednio z obrazów znakowanych fluorescencyjnie białek błony plazmatycznej, co pozwoliło uniknąć systematycznych błędów wprowadzonych przez fotofizykę sondy. Chociaż podstawy teoretyczne analizy są złożone, metoda może być wdrażana przez osoby niebędące ekspertami przy użyciu ogólnodostępnego kodu do pomiaru współczynników dyfuzji białek. kICS oblicza funkcję korelacji czasowej na podstawie stosu obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej po transformacji Fouriera każdego obrazu do przestrzeni odwrotnej (k-). Następnie uśrednianie kołowe, transformacja logarytmu naturalnego i dopasowania liniowe do funkcji korelacji dają współczynnik dyfuzji. Niniejszy artykuł zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący analizy obrazu i pomiaru współczynników dyfuzji za pomocą kICS.
Po pierwsze, za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego uzyskuje się sekwencję obrazu o wysokiej liczbie klatek na sekundę fluorescencyjnie znakowanego białka błony plazmatycznej. Następnie wybierany jest obszar zainteresowania (ROI) unikający organelli wewnątrzkomórkowych, ruchomych pęcherzyków lub wystających obszarów błony. Stos ROI jest importowany do ogólnodostępnego kodu, a kilka zdefiniowanych parametrów (patrz sekcja Metoda) jest ustawianych do analizy kICS. Następnie program generuje wykres "nachylenie zboczy" na podstawie funkcji korelacji czasowej w przestrzeni k, a współczynnik dyfuzji jest obliczany na podstawie nachylenia wykresu. Poniżej znajduje się procedura kICS krok po kroku do pomiaru współczynnika dyfuzji białka błonowego przy użyciu kanału wodnego nerek akwaporyny-3 oznaczonej EGFP jako przykładu kanonicznego.
Wprowadzenie
Czterowymiarowa organizacja czasoprzestrzenna i boczna ruchliwość białek błony plazmatycznej są ściśle regulowane i mogą odgrywać rolę w funkcjonowaniu, aktywności i interakcjach białko-białko. Dyfuzja boczna białek błony plazmatycznej była tradycyjnie badana poprzez obliczanie współczynników dyfuzji dla pojedynczych cząstek na podstawie obrazowania poklatkowego białek błony plazmatycznej znakowanych kropkami kwantowymi lub barwnikiem2-4. Takie podejście wymaga wstawienia znacznika zewnątrzkomórkowego do białka błony plazmatycznej w celu znakowania kropkami kwantowymi lub barwnikiem, co może zagrozić fałdowaniu i funkcji białka, a zatem nie może być osiągnięte w przypadku niektórych białek. Wykazano, że steryczna objętość kropki kwantowej spowalnia dyfuzję białka5, a co więcej, tylko niewielka część białek w populacji jest znakowana kropkami kwantowymi i nie wiadomo, czy ta frakcja jest reprezentatywna dla całkowitej puli białek błony plazmatycznej. Pomiary współczynników dyfuzji za pomocą śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) na podstawie serii obrazów białek znakowanych kropkami kwantowymi obejmują mapowanie zobrazowanych pozycji pików cząstek za pomocą dwuwymiarowych dopasowań Gaussa, a następnie obszernych algorytmów analizy. Analiza jest bardzo intensywna obliczeniowo, wymaga obszernego dopasowania krzywej nieliniowej w każdej klatce obrazu sekwencji poklatkowej do przybliżeń funkcji rozpiętości punktów mikroskopu (zwykle dwuwymiarowych przestrzennych Gaussianów), a następnie powiązania pozycji cząstek w trajektorie cząstek opisujące ruch pojedynczych cząsteczek6,7.
Niedawno opracowana technika korelacji obrazów, spektroskopia korelacji obrazów k-Space (kICS) umożliwia względnie proste pomiary współczynników dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych białek błony plazmatycznej. Możliwość rutynowego obliczania współczynników dyfuzji białek błonowych znakowanych białkami fluorescencyjnymi za pomocą kICS jest unikalnym narzędziem, które ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjną analizą SPT z użyciem kropek kwantowych: Nie jest wymagane wprowadzanie znaczników zewnątrzkomórkowych i czasochłonne znakowanie zewnątrzkomórkowe (można stosować linie komórkowe wyrażające białka fluorescencyjne); Współczynniki dyfuzji są ekstrahowane z całkowitej puli białek fluorescencyjnych w porównaniu z podzbiorem znakowanym kropkami kwantowymi; Analiza jest prosta bez konieczności śledzenia pojedynczych białek, a analizę można przeprowadzić przy użyciu istniejącego kodu bez konieczności dodatkowego programowania przez użytkownika. Metoda jest szybka, ponieważ jest to technika uśredniania, która umożliwia szybkie obliczanie i obliczanie współczynników dyfuzji. Te szybkie pomiary dyfuzji dla populacji białek uzupełniają bardziej szczegółowe informacje o transporcie molekularnym uzyskane dla podzbioru populacji za pomocą żmudnych metod SPT.
kICS czas koreluje sekwencje obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej, które zostały najpierw przekształcone w przestrzeń Fouriera, a tym samym oddziela fluktuacje fluorescencji spowodowane fotofizyką od tych spowodowanych transportem molekularnym1. W rezultacie, kICS może określić gęstość liczbową, prędkość przepływu i dyfuzję cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie, będąc bezstronnym przez złożone fotowybielanie lub mruganie fluoroforów. To sprawia, że kICS jest użytecznym narzędziem do szybkiego określania dynamiki dyfuzji znakowanych fluorescencyjnie białek błony komórkowej bez konieczności tworzenia niestandardowych algorytmów pisania. Oprócz białek znakowanych fluorescencyjnie, kICS można również zastosować do białek błonowych znakowanych kropkamikwantowymi 8.
Ten artykuł krok po kroku wprowadza do tego, jak używać kICS do wyodrębniania współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej oznaczonych EGFP, pokazując, jak umieścić uprawę, jak używać kodu i jak oceniać wygenerowane poletka, z których wyodrębniane są współczynniki dyfuzji. Jako przykład przedstawiono dane uzyskane za pomocą wirującej mikroskopii dyskowej ustawionej w trybie półcałkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF), białka kanału wodnego nerek akwaporyny-3 (AQP3) znakowanego EGFP.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Akwizycja białek oznaczonych EGFP w błonie plazmatycznej do analizy kICS może być wykonana na mikroskopie epifluorescencyjnym, ustawie TIRF lub na mikroskopie z wirującym dyskiem w celu uzyskania obrazów interesującej nas błony. Do analizy potrzebny jest rozmiar piksela kamery, a także czas między klatkami obrazu. Do analizy można wykorzystać sekwencje obrazów o długości 100-1 200 klatek z częstotliwością odświeżania 4-30 Hz. Podczas akwizycji ważne jest, aby przez cały czas trwania obrazowania utrzymywać ostrość błony i skupić się na ułamku płaskiej błony, w której fluorescencja jest równomiernie rozprowadzona. Ruchome pęcherzyki, wystające obszary błony i organelle komórkowe mogą zostać wycięte w dalszej części procesu analizy. Czas akwizycji powinien być tak dobrany, aby nie było dryftu ani ruchu ogniwa.
Aby uzyskać skrypty kodu kICS dla MATLAB, skontaktuj się z Paulem Wisemanem (Paul.Wiseman@McGill.ca). Przy pierwszym użyciu kodu kICS otwórz MATLAB i kliknij plik, następnie ustaw ścieżkę, a następnie kliknij dodaj z podfolderami i znajdź folder na komputerze, w którym znajduje się kod kICS. Następnie kliknij ok, zapisz i zamknij. Teraz kontynuuj analizę upraw opisaną w kolejnych punktach.
1. Zaimportuj interesującą sekwencję obrazów do programu do analizy obrazowania jako stos TIFF
Zapisz plik pod nazwą: stack1.tif.
- Wybierz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) w płaskiej części błony, z wyłączeniem ruchomych organelli komórkowych i wystających obszarów błony. Wielkość uprawy jest dobierana tak, aby wygenerowano wystarczającą ilość statystyk dla dobrych działek k2.
- Przytnij region i zapisz go jako plik TIFF w odpowiednim folderze. Jeśli istnieje kilka kadrów z tego samego filmu, użyj przyrostu liczbowego, np. "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", " stack1crop3.tif".
- Umieść folder zawierający uprawy lokalnie na komputerze, a nie na serwerze, podczas wykonywania analizy kICS.
2. Importuj uprawy do oprogramowania do analizy jeden po drugim, aby przeprowadzić analizę
- Otwórz MATLAB i wpisz "icsgui" w oknie poleceń i naciśnij ENTER. Graficzny interfejs użytkownika ICS to nazwa pliku wykonywalnego programu graficznego interfejsu użytkownika do spektroskopii korelacji obrazów.
- W graficznym interfejsie użytkownika ICS kliknij zakładkę "kICS". Zrzut ekranu okna analizy pokazano na rysunku 1.
- Znajdź folder o nazwie folderu "Kod MATLAB" i przewiń do pliku o nazwie pliku "Skrypty" i otwórz go, klikając go dwukrotnie. Alternatywnie kliknij plik prawym przyciskiem myszy i wybierz "otwórz za pomocą MATLAB" lub przejdź do pliku, otwórz w MATLAB i otwórz plik skryptów. Ten plik nazywa się Edytor.
- W edytorze przewiń do "Załaduj zestawy danych kICS", a następnie skopiuj lub wpisz nazwę pliku i lokalizację folderu w wierszu poleceń, który zaczyna się od img = np. "C:\Users\Documents\AQP3dynamics\stack1crop.tif". W wierszu poleceń poniżej lokalizacji folderu ustaw liczbę ramek do analizy – np. [1:500]. Użyj tych samych ustawień dla wszystkich kolejnych filmów w serii danych. Jeśli w późniejszych klatkach występuje przesunięcie ostrości, należy je wykluczyć z analizy.
- W edytorze kliknij "zapisz", a następnie kliknij "oceń komórkę". Zestaw danych jest teraz ładowany do oprogramowania analitycznego.
- W oknie Analiza kICS w graficznym interfejsie użytkownika wprowadź ustawienia analizy:
- Odznacz pola "Komórka T".
- Wprowadź liczbę opóźnień czasowych, które mają być analizowane. Liczba opóźnień czasowych (τ) będzie miała wpływ na wykres dyfuzji i musi być tak dobrana, aby wykres dyfuzji był liniowy. Zacznij od wpisania 25, a następnie zmniejsz do miejsca, w którym wykres dyfuzji jest liniowy. τ to liczba opóźnień czasowych, które porównuje analiza kICS, a opóźnienie czasowe to czas między jedną klatką a drugą. Należy wybrać najmniejszą wartość, która daje wykres liniowy. Maksymalna liczba opóźnień jest wybierana tak, aby uzyskać dopasowanie liniowe, wybranie wyższej wartości spowoduje wygenerowanie danych, których nie można dopasować do linii.
- Wprowadź maksymalną wartość k2 (patrz kółko 1 na rysunku 1), zwykle jest to 20-50. Dobry wykres k2 to wykres, na którym znajduje się wiele punktów danych, które są rozmieszczone wzdłuż linii. Zacznij od wprowadzenia liczby 70, a następnie zmniejsz po ocenie wykresów k2 i dyfuzji i wybierz najniższą wartość, w której punkty danych skupiają się wokół linii prostej. Wartość k2 jest kwadratem wielkości przestrzennego wektora k w przestrzeni Fouriera.
Początkowo analizę należy powtarzać aż do wyznaczenia najlepszych wartości, a następnie używać tych samych ustawień dla wszystkich kolejnych filmów w serii danych, ale zawsze sprawdzać, czy wybrane ustawienia dobrze pasują do danych: dobre wykresy k2 i liniowy wykres dyfuzyjny. - Kliknij "Przechowuj ustawienia i kontynuuj".
- Kliknij "tak", aby wyświetlić wszystkie wykresy.
- Kliknij "Załaduj serię obrazów" (patrz kółko 2 na rysunku 1), a następnie kliknij "przestrzeń robocza".
- Wybierz "imgSerCrop", a następnie kliknij "Importuj z obszaru roboczego".
- Wprowadź ustawienia systemu obrazowania. W polu "rozmiar piksela" wprowadź projektowany rozmiar piksela dla systemu obrazowania, w którym rejestrowane są stosy obrazów. Dla AQP3-EGFP użyto 0,111. W polu "Wprowadź czas (s) między klatkami" dla AQP3-EGFP użyto wartości 0,1150.
- Kliknij "wybierz ROI", wpisz "1", kliknij ok i "użyj całego obrazu".
- Kliknij "Wykonaj analizę kICS" i kliknij tak, aby wykonać "filtrowanie nieruchome". Wyniki otworzą się automatycznie jako obrazy.
- Zminimalizuj okno ustawień, zminimalizuj okno informacji o komórce i zminimalizuj okno fotofizyki. W oknie dynamiki sprawdź, czy wykres dynamiki pokazuje liniowe dopasowanie danych do linii o ujemnym nachyleniu, co oznacza, że punkty danych są skorelowane i można założyć dyfuzję swobodną. Zapisać współczynnik dyfuzji dla określonych ustawień opóźnienia czasowego i k2 (nie jest konieczne notowanie odchylenia standardowego pasowania). Punkty danych na wykresach k2 muszą być zgrupowane wokół linii dla danych opóźnień czasowych.
- Zaznacz pole wyboru "Zapisz otwarte figury jako obrazy", a następnie kliknij "Zapisz otwarte figury jako obrazy", aby zapisać pliki wynikowe. Zapisz w nowym folderze w folderze C:\Users\Documents\AQP3diffusion. Kliknij "wyczyść bieżące dane" i kontynuuj analizę następnej uprawy.
3. Średnia obliczonego współczynnika dyfuzji jest obliczana, aby uzyskać przegląd analizowanych danych
- Wprowadź poszczególne współczynniki dyfuzji z każdego ROI w arkuszu kalkulacyjnym (pamiętaj, aby zanotować wartości τ i k2), użyj nazw upraw, jak określono powyżej.
- Oblicz średni współczynnik dyfuzji i odchylenie standardowe za pomocą arkusza kalkulacyjnego.
- Wykonaj test Kołmogorowa-Smirnowa lub test t uczniów, aby ocenić różnice statystyczne przy użyciu 5% poziomu istotności. Można dokonać porównań ilościowych między komórkami (na przykład leczonymi i nieleczonymi).
- Otwórz wersję arkusza kalkulacyjnego wykresów dyfuzyjnych, która została wygenerowana przez oprogramowanie analityczne dla każdej uprawy, i uśrednij dane dla każdego warunku dla każdego opóźnienia czasowego. Wygeneruj nowy uśredniony wykres dyfuzji do prezentacji w artykułach lub prezentacjach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby uzyskać odpowiednie stosy obrazów do analizy metodą kICS, można wykorzystać różne systemy mikroskopowe. Możliwa jest analiza sekwencji obrazów z mikroskopu epi-fluorescencyjnego, jak również z układu TIRF lub mikroskopu z dyskiem obrotowym (spinning disk). Błona musi być płaska, bez dużych, ruchomych organelli komórkowych lub ruchomych pęcherzyków/obiektów. Niniejsza praca przedstawia sekwencję obrazów time-lapse białka AQP3 znakowanego EGFP w żywych komórkach MDCK, obrazowanych na mikroskopie z dyskiem obrotowym z o...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule przedstawiono szczegółowy przegląd krok po kroku, w jaki sposób można zastosować metodę analizy kICS do wyznaczania współczynników dyfuzji na podstawie obrazów mikroskopowych białek znakowanych białkami fluorescencyjnymi. Analiza jest niezależna od wyboru sondy o bardzo szerokim zakresie dynamiki gęstości znakowania, a zatem może być również stosowana do białek znakowanych kropkami kwantowymi, a także barwników i białek fluorescencyjnych, takich jak EGFP.
Aby obliczyć prawidłowe wsp...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Lundbeck Junior Group Leader Fellowship dla LNN. PWW dziękuje za wsparcie finansowe ze strony Kanadyjskiej Rady ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC). Dziękujemy również Duńskiemu Centrum Bioobrazowania Molekularnego na Uniwersytecie Południowej Danii za dostęp do mikroskopii z wirującym dyskiem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 31600-083 | |
| FBS | Invitrogen | 10082147 | |
| Penicilin | Sigma | 13752 | |
| Kanamycyna | Gibco | 15160070 | |
| Streptomycyna | Gibco | 11860038 | |
| Czerwone wolne podłoże fenolowe | Gibco | 11880-028 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Aparatura | |||
| Wirujący dysk Mikroskop | Nikon | Ti Eclipse | |
| EMCCD Kamera | Andor | Ixon+ |
Bibliografia
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
- Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
- Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
- Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
- Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
- Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
- Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
