Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Odwrócony dwuhybrydowy system drożdży w celu identyfikacji reszt receptorów jądrowych ssaków, które oddziałują z ligandami i / lub antagonistami

12.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51085

⸱

15 listopada 2013

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine , 2Shanghai Key Laboratory of Complex Prescription and MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines, Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ketokonazol wiąże się z aktywacją receptora Pregnane X (PXR) i antagonizuje ją. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe mutantów PXR u drożdży definiują unikalny region wiązania ketokonazolu. Ta metoda genetyczna oparta na drożdżach odkrywa nowe interakcje receptorów jądrowych z ligandami, które wiążą się z miejscami wiązania powierzchniowego.

Streszczenie

Jako krytyczny regulator metabolizmu leków i stanu zapalnego, receptor Pregnane X (PXR), odgrywa ważną rolę w patofizjologii choroby łączącej metabolizm i stan zapalny (np. stłuszczenie wątroby)1,2. Poczyniono znaczne postępy w identyfikacji ligandów agonistycznych dla PXR, jednak istnieją ograniczone opisy antagonistów podobnych do leków i ich miejsc wiązania na PXR3,4,5. Krytyczną barierą była niezdolność do skutecznego oczyszczenia białka o pełnej długości do badań strukturalnych z antagonistami, pomimo faktu, że PXR został sklonowany i scharakteryzowany w 1998 roku. Nasze laboratorium opracowało nowatorski, wysokoprzepustowy test dwuhybrydowy na bazie drożdży w celu zdefiniowania antagonisty, ketokonazolu, wiążących reszty na PXR6. Nasza metoda polega na stworzeniu bibliotek mutacyjnych, które uratowałyby efekt pojedynczych mutacji na powierzchni AF-2 PXR, co do którego oczekuje się, że będzie oddziaływać z ketokonazolem. Możliwe jest przeprowadzenie drugich mutacji ratunkowych lub "wzmocnień funkcji" w taki sposób, że możliwe jest wyciągnięcie wniosków dotyczących interakcji genetycznej ketokonazolu i pozostałości powierzchniowych na PXR. W związku z tym opracowaliśmy wysokoprzepustowe, dwuhybrydowe badanie przesiewowe drożdży mutantów PXR oddziałujących z jego koaktywatorem, SRC-1. Stosując to podejście, w którym drożdże zostały zmodyfikowane w celu dostosowania do badania leku przeciwgrzybiczego, ketokonazolu, mogliśmy wykazać specyficzne mutacje na PXR wzbogaconym w klony niezdolne do wiązania się z ketokonazolem. Stosując odwrotną logikę, wnioskujemy, że pierwotne reszty są pozostałościami bezpośredniego oddziaływania z ketokonazolem. Test ten stanowi nowatorski, wykonalny test genetyczny do badań przesiewowych w poszukiwaniu miejsc wiązania antagonistów na powierzchni receptorów jądrowych. Test ten można zastosować do dowolnego leku, niezależnie od jego potencjału cytotoksycznego dla drożdży, a także dla białek komórkowych, których nie można badać przy użyciu standardowych metod biologii strukturalnej lub proteomiki. Potencjalne pułapki obejmują interpretację danych (przydatne metody komplementarne), poleganie na pojedynczej metodzie Y2H, wiedzę specjalistyczną w zakresie obchodzenia się z drożdżami lub wykonywania testów dwuhybrydowych drożdży oraz optymalizację testów.

Wprowadzenie

Test dwuhybrydowy (Y2H) drożdży jest szeroko stosowany do odkrywania interakcji białko-białko, a ostatnio do odkrywania nowych małych cząsteczek, które zakłócają kompleksy interakcji białko-białko 7, 8, 9, 10, 11. Jednak konwencjonalne podejścia tego testu, stosowane do odkrywania leków lub "trafień", nie pozwalają na wykrycie reszt oddziaływań allosterycznych związków chemicznych na powierzchni białko-białko, które po zmianie nadal oddziałują i pozwalają na badanie zmienionych reszt11. Rzeczywiście, taka metoda(y), jeśli jest możliwa do opracowania, umożliwiłaby stworzenie elastycznego systemu drożdży do wysokoprzepustowej oceny reszt interakcji allosterycznych, które mają kluczowe znaczenie dla zakłócenia interakcji białko-białko. W kontekście odkrywania leków, najbardziej bezpośrednim sposobem ustalenia interakcji związków z białkami byłoby określenie strukturalne (np. krystalizacja kompleksu białko-inhibitor). Metody te są kłopotliwe, zużywają skomplikowane zasoby i nie jest technicznie wykonalne przeprowadzenie badań strukturalnych na każdym białku.

Możliwe do wykonania genetyczne systemy badań przesiewowych leków zostały ustanowione w bakteriach1, 2 i innych systemach modelowych, takich jak dwuhybrydowe ssaki. Systemy te wymagają jednak optymalizacji, a systemy alternatywne, takie jak Y2H, są nadal najczęściej testowane w odkrywaniu leków. Istnieją ograniczenia, które obejmują słabą czułość i wiarygodność oddziaływań przy użyciu metod pojedynczych13 , jednak pojedynczy test Y2H można zmodyfikować, aby odpowiedzieć na konkretne pytania dotyczące pozostałości interakcji. W dziedzinie badań nad receptorami jądrowymi Y2H został wykorzystany do zdefiniowania oddziałujących białek14, jednak te interakcje białkowe rzadko były wykorzystywane do określenia charakteru, w którym ligandy/antagoniści oddziałują z kompleksami receptor-białko jądrowe. W związku z tym nasze laboratorium skoncentrowało wysiłki na zdefiniowaniu metody, szczególnie w przypadku białek receptorowych, które nie są łatwo podatne na metody oparte na proteomice, która pozwoliłaby odkryć nowe reszty oddziałujące ligand/antagonista przy użyciu platformy odkrywczej opartej na odwrotnym Y2H.

Na podstawie naszego poprzedniego odkrycia, że ketokonazol zakłóca PXR i jego aktywator SRC-1, opracowaliśmy nowatorski system odwrotnego Y2H, który umożliwia nam definiowanie i badanie reszt oddziałujących z ketokonazolem na PXR6. Nasza metoda opiera się na właściwościach drożdżowego białka GAL4, które składa się z rozłącznych domen odpowiedzialnych za wiązanie DNA i aktywację transkrypcji. Białko PXR LBD ulega ekspresji jako fuzja z domeną wiążącą DNA LEXA (DNA-BD), podczas gdy białka koaktywatorów pełnej długości SRC-1 (koaktywator receptora steroidowego 1) ulegają ekspresji jako fuzje z domeną aktywacji GAL4 (AD). Interakcja między białkami fuzyjnymi PXR i SRC-1 prowadzi do transkrypcyjnej aktywacji miejsc wiążących GAL4 zawierających gen reporterowy β-LacZ, który jest zintegrowany z genomem drożdży. Ketokonazol, antagonista PXR, zaburza interakcję PXR i SRC-1 15, 16, 17 i możemy wykryć interakcję PXR i SRC-1 w obecności lub braku ketokonazolu po zabarwieniu kolonii na filtrach pod kątem aktywności X-gal. Zasada działania Y2H jest zilustrowana na rysunku 1, a procedura eksperymentalna jest podsumowana na rysunku 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Budowa fuzji PXR i SRC-1 w wektorach drożdży

  1. Amplifikacja PCR ludzkiego PXR LBD (107-434 aminokwasów) i ludzkiej pełnej długości SRC-1 (1-1401 aminokwasów).
    1. Użyj plazmidu pSG5-hPXR8 jako matrycy PXR LBD, użyj plazmidu pCMX-SRC1 jako szablonu SRC-1.
    2. Rozmrozić PCR SuperMix, matryce DNA i startery (patrz Materiały), trzymać je na lodzie.
    3. Dodać 0,25 μg/μl matrycy DNA 1 μl, 10 mM par starterów po 2 μl każda, PCR SuperMix 45 μl i dodaćH2O, aby uzyskać całkowitą objętość do 50 μl.
    4. Ustaw PCR na jeden cykl 94 °C przez 2 min, 20 cykli 94 °C przez 30 sekund, 55 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 2 minuty, a następnie jeden cykl 72 °C przez 10 minut w celu przedłużenia. Sprawdź produkty PCR, uruchamiając je na 1% żelu agarozowym.
  2. Klonowanie produktów PCR do wektorów Y2H.
    1. Oczyść produkty PCR z 1% żelu agarozowego. Trawić wektor PXR, LBD, PCR i Y2H pSH2-1 z BamHI i SalI; trawić SRC-1 PCR i wektor Y2H pGADNOT z NotΙ i SalΙ. Aby to zrobić, dodaj 1 μg DNA, 3 μl 10x buforu reakcyjnego, 1 μl enzymów restrykcyjnych, a na koniecH2O, aby uzyskać całkowitą objętość do 30 μl.
    2. Próbki mineralizacji umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1 godzinę. Sprawdź trawienie, stosując 1% żel agarozowy.
    3. Oczyść próbki trawienia z 1% żelu agarozowego, podlizaj strawione produkty PCR i wektory Y2H i przekształć w komórki kompetentne DH5α.
    4. Wybierz kolonie i wyizoluj plazmidowe DNA.
  3. Zidentyfikuj plazmidowe DNA pSH2-1-PXR przez trawienie BamHI/SalI, zidentyfikuj plazmidowe DNA pGADNOT-SRC-1 przez trawienie NotI/SalI. Zweryfikuj wszystkie dodatnie plazmidowe DNA przez sekwencjonowanie.

2. Drożdże Testy dwuhybrydowe

  1. Zaszczepić szczep drożdży w 5 ml YPAD i inkubować przez noc przez ciągłe mieszanie (220 obr./min w temperaturze 30 °C). Uwaga: Szczep Saccharomyces cerevisiae to CTY10-5d (MATa ade2 trp1-901 leu2-3,112 his3-200 ga l4-gal80- URA3::lexA-lacZ), który zawiera zintegrowany gen GAL1-lacZ z operatorem lexA 10. Aby uzyskać żywotne komórki drożdży odporne na ketokonazol, ale te, które nie przenosiły zmian transportera jako przyczyny oporności na azol18-20, uzyskano nowe szczepy drożdży CTY10-5d, najpierw usuwając ERG3 (erg3Δ), a następnie wprowadzając dodatkową delecję w genach ERG11 ( erg3Δ / erg11Δ) przez rekombinację homologiczną. Szczegóły konstrukcyjne zostały opisane we wcześniej opublikowanym rękopisie6 .
  2. Następnego dnia (rano) zaszczepić drożdże (1:20) w 5 ml YAPD i inkubować do uzyskania OD600 ~ 0,2 przez ciągłe mieszanie (220 obr./min w 30 °C).
  3. Granulować komórki z prędkością 2 000 obr./min w mikrowirówce przez 2 minuty i wyrzucić supernatant. Następnie przemyj granulat dwukrotnie wodą w autoklawie i raz 0,1 M LiAc.
  4. Po ostatnim płukaniu odrzucić supernatant i dodać następujące odczynniki do osadu komórkowego: 240 μl PEG 3500 50% w/v, 36 μl 1 M LiAc, 50 μl 2 mg/ml gotowanego nasienia łososia ssDNA, H2O 34 μl. Wirować do wymieszania, dodać 1 μg pSH-PXR i 1 μg pGADNOT-SRC-1 DNA i wymieszać.
  5. Przenieść mieszaninę do probówki okrągłodennej z polistyrenu, zamieszać przemianę, mieszać (220 obr./min w 30 °C) przez 30 min. Przenieść probówkę do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C i inkubować przez dodatkowe 30 min.
  6. Odwirować probówkę z prędkością 2 000 obr./min przez 2 minuty i usunąć supernatant. Umyj granulat raz wodą w autoklawie.
  7. Odpipetować 100 μl sterylnej wody do probówki, ponownie zawiesić komórki poprzez delikatne stukanie palcem i pipetowanie, a następnie umieścić na płytkach -His/-Leu Dropout Medium (preparat na jeden litr -His/-Leu Dropout Medium: 20 g dekstrozy, 1,7 g YNB, 0,67 g CSM-His/-Leu, 5 g siarczanu amonu, 1,5% agaru) i inkubować w temperaturze 30 °C przez 3-4 dni w celu wyizolowania transformantów.

3. Test filtra X-gal

  1. Przyciąć membranę nitrocelulozową do rozmiaru części szalki Petriego. Oznacz membranę nitrocelulozową, aby zaznaczyć orientację.
  2. Umieść oznaczoną membranę nitrocelulozową na koloniach drożdży, upewnij się, że membrana styka się z powierzchnią podłoża płytkowego.
  3. Zdjąć membranę, ułożyć ją stroną kolonijną do góry na bibule filtracyjnej o grubości 3 mm i umieścić membranę i bibułę filtracyjną w temperaturze -80 °C na 15 minut.
  4. Przygotuj roztwór X-gal. Dodać 50 μl 20 mg/ml X-gal i 15 μl β-merkaptoetanolu do 5 ml buforu Z (1 l buforu zawiera 16,1 g Na2HPO47H2O, 5,5 g NaH2PO4 H2O, 0,75 g KCl, 0,25 gMgSO4•7H2O) . Jeśli bufor Z był przechowywany w temperaturze 4 °C, przed dodaniem tych odczynników należy go doprowadzić do temperatury pokojowej.
  5. Umieścić dwa kółka z bibuły filtracyjnej o grubości 3 mm na szalce Petriego i namoczyć je w 5 ml roztworu X-gal. Odcedź nadmiar buforu z szalki Petriego i umieść membranę nitrocelulozową stroną z kolonią do góry.
  6. Zamknij pokrywę, upewnij się, że membrana całkowicie styka się z bibułą filtracyjną i jest całkowicie mokra. Zawinąć szalkę Petriego w folię i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut do nocy.

4. Test płynnego β-galonu

  1. Hoduj drożdże w płynnym podłożu -His/-Leu Dropout do OD600 0,7.
  2. Przenieść 1 ml pożywki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować z prędkością 3 000 obr./min przez 2 min. Odrzucić supernatant.
  3. Dodać 1 ml buforu Z w celu ponownego zawieszenia osadu, ponownie odwirować z prędkością 3 000 obr./min przez 2 minuty. Wyrzucić supernatant.
  4. Dodać 150 μl buforu Z z 2ME w celu ponownego zawieszenia osadu komórkowego, wymieszać, a następnie dodać 50 μl chloroformu i 20 μl 0,1% SDS. Energicznie wirować próbkę przez 15 sekund.
  5. Dodać 700 μl roztworu ONPG (1 mg/ml w buforze Z). Ustawić stoper, inkubować w temperaturze 30 °C wystarczająco długo, aby umożliwić rozwinięcie się żółtego koloru i zanotować całkowity czas reakcji.
  6. Dodać 500 μl 1 M Na2CO3 w celu zatrzymania reakcji i oznaczyć absorbancję przy 420 nm. Ślepa próba to 700 μl roztworu ONPG plus 500 μl 1 M Na2CO3 .

Oblicz jednostki Millera w następujący sposób: Jednostki Millera = (Å420*1,000)/(Å600*min*ml)

Å420: jednostki absorbancji przy 420 nanometrach; Å600: jednostki absorbancji przy 600 nanometrach; min: czas reakcji w minutach; ML: objętość reakcji w ml

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeprowadziliśmy analizę, aby sprawdzić, czy jesteśmy w stanie wykryć kolorymetryczny odczyt asocjacji PXR oraz koaktywatora receptora steroidowego-1 (SRC-1). Ponieważ drożdże charakteryzują się znaczną produkcją steroli, wcześniej wykazano, że ekspresja lacZ w drożdżach może być indukowana bez konieczności dodawania dodatkowego ligandu egzogennego. Stwierdziliśmy, że ekspresja lacZ (niebieskie kolonie) jest również indukowana w szczepie drożdży transformowanym PXR i SRC-1; jednak nie obserwuje się indukcji ekspresji La...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W naszym zmodyfikowanym teście Y2H zidentyfikowaliśmy ważne reszty dla interakcji ketokonazolu na PXR6. Ponieważ SRC-1 jest koaktywatorem (i został sklonowany do wektora pGADNot), przetestowaliśmy również, czy SRC-1 może aktywować ekspresję lacZ po sklonowaniu do systemu wektorów pSH i czy zmieni to profil aktywacji i / lub wpłynie na nieszczelność testu dwuhybrydowego drożdży. Korzystając z naszych przeprojektowanych plazmidów, przeprowadziliśmy testy dwuhybrydowe w drożdżach erg3Δ/erg11Δ. T...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) Granty CA127231 oraz The Damon Runyon Foundation Clinical Investigator Award (CI 1502) (dla S.M.). Chcielibyśmy podziękować profesorowi Zdenkowi Dvorakowi z Uniwersytetu Palackiego w Ołomuńcu w Czechach za jego pomocne spostrzeżenia na temat możliwości przeniesienia tej techniki do ich instytucji i standaryzacji protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczep drożdży CTY10-5d erg3Δ/erg11ΔNasze drożdżelaboratoryjne CTY10-5d zostały podwójnie znokautowane ERG3 i ERG11 (erg3Δ/erg11Δ/erg11Δ) 6 .
YPD Pożywka wzrostowaBD Biosciences630409
Difco Drożdżowa baza azotowa (YNB) bez aminokwasów i siarczanu amonuBD Biosciences233520
Bacto AgarBD Biosciences214010
CSM-His/-Leu Kompletna mieszanka suplementówMP Biomedicals4250-412
ONPG (o-nitrofenyl Β-D-galaktopiranozyd).Sigma-AldrichN1127
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250
Bulion Luria (LB)Sigma-AldrichL3022
X-GalFisherBP-1615
Ugotowane DNA plemników łososia (10 mg / ml)Life Technology156-017
AmpicylinaAcros Organics61177
KetokonazolSigma-AldrichK1003
N,N-dimetyloformamidAcros Organics326871000
Octan lituSigma-AldrichL4158
50% roztwór PEG-3350, sterylizowany filtremSigma-AldrichP-3640
Membrana nitrocelulozowaWhatman10402091
10 cm szalka PetriegoFisher875712
5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATCATGTCC-3'naszlaboratoryjnyPXR LBD do przodu starter do pSH2-1
5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'naszlaboratoriumPXR LBD odwrotny starter do pSH2-1
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGCATCATCC -3'naszlaboratoryjnySRC-1 do przodu podkład do pGADNOT
5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'naszelaboratoriumSRC-1 odwrócony starter do pGADNOT
Platinum PCR SupermixInvitrogen11306-016
BamHInasze laboratoriumR0136
NotInasze laboratoriumR0189
SalI nasze laboratorium R0138

Bibliografia

  1. Kliewer, S. A., et al. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. Cell. 92 (1), 73-82 (1998).
  2. Blumberg, B., et al. a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor. Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).
  3. Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists. Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).
  4. Pondugula, S. R., Mani, S. Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response. Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).
  5. Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. PXR antagonists and implications for drug metabolism. Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).
  6. Li, H., et al. Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR. J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).
  7. Hollenberg, S. M., et al. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).
  8. Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell. 74 (1), 205-214 (1993).
  9. Wang, H., et al. The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor. Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).
  10. Kalpana, G. V., Goff, S. P. Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).
  11. Hamdi, A., Colas, P. Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery. TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).
  12. Battesti, A., Bouveret, E. The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli. Methods. 58 (4), 325-334 (2012).
  13. Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems. Methods. 58 (4), 317-324 (2012).
  14. Albers, M., et al. Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins. Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).
  15. Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics. J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).
  16. Huang, H., et al. Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole. Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).
  17. Wang, H., et al. Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs. Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).
  18. Ghannoum, M. A., Rice, L. B. Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).
  19. Kaur, R., Bachhawat, A. K. The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology. 145, 809-818 (1999).
  20. White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).
  21. Serebriiskii, I. G., et al. Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets. Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).
  22. Yang, L., et al. Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer. Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).
  23. Zhan, Y. Y., et al. The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK. Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza dwuhybrydowa dro d yinterakcja receptor w j drowychwi zanie ligandu PXRmiejsca wi zania ketokonazolukoaktywator SRC 1przesiewanie biblioteki mutacyjnejp ynny test beta galaktoksydazytest kolonii na filtrzemiejsca wi zania antagonist wprzesiewanie wysokoprzepustowe
Odwrócony dwuhybrydowy system drożdży w celu identyfikacji reszt receptorów jądrowych ssaków, które oddziałują z ligandami i / lub antagonistami
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.