Artykuł metodologiczny

Korekcja dryfu próbki po konfokalnym obrazowaniu poklatkowym 4D

DOI:

10.3791/51086

⸱

12 kwietnia 2014

 ,  , 
1School of Biological Sciences, Monash University, 2Janelia Farm Research Campus, Howard Hughes Medical Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia poklatkowa pozwala na wizualizację procesów rozwojowych. Wzrost lub dryf próbek podczas akwizycji obrazu zmniejsza zdolność do dokładnego śledzenia i mierzenia ruchów komórek podczas rozwoju. Opisujemy zastosowanie oprogramowania do przetwarzania obrazów typu open source w celu skorygowania trójwymiarowego dryfu próbki w czasie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generowanie czterowymiarowych (4D) zestawów danych konfokalnych; składających się z sekwencji obrazów 3D w czasie; stanowi doskonałą metodologię do uchwycenia zachowań komórkowych związanych z procesami rozwojowymi. Zdolność do śledzenia i śledzenia ruchów komórek jest ograniczona przez ruchy próbki, które występują z powodu dryfu próbki lub, w niektórych przypadkach, wzrostu podczas akwizycji obrazu. Śledzenie komórek w zestawach danych, na które ma wpływ dryf i/lub wzrost, uwzględni te ruchy w dowolnej analizie położenia komórek. Może to prowadzić do pozornego przemieszczania się struktur statycznych w próbce. W związku z tym przed przystąpieniem do śledzenia komórek należy skorygować wszelkie odchylenia próbki. Korzystając z dystrybucji 1 ImageJ 2,3 na Fidżi o otwartym kodzie źródłowym i wbudowanych narzędzi LOCI 4, opracowaliśmy wtyczkę Correct 3D drift, aby usunąć błędne ruchy próbki w zestawach danych konfokalnych. Protokół ten skutecznie kompensuje translację próbki lub zmiany w pozycji ogniskowej, wykorzystując korelację fazową do rejestracji każdego punktu czasowego czterowymiarowych zestawów danych konfokalnych, zachowując jednocześnie możliwość wizualizacji i pomiaru ruchów komórek w przedłużonych eksperymentach poklatkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie konfokalne jest szeroko stosowane w biologii komórkowej i rozwojowej do śledzenia ruchów komórek i zmian w morfologii. Uchwycenie serii przekrojów optycznych w różnych płaszczyznach ogniskowych pozwala na wygenerowanie trójwymiarowego (3D) modelu próbki, który można następnie rozszerzyć do czterowymiarowego (4D) poprzez utworzenie serii poklatkowych zestawów danych 3D. Generowanie zestawów danych 4D pozwala na szczegółowy pomiar ruchów i zachowań komórek. W długoterminowych eksperymentach poklatkowych często obserwuje się ruch próbki. Może to być spowodowane niewielkimi niedokładnościami w sprzęcie, stoliku sterującym i pozycjach ogniskowych. Podczas gdy w innych przypadkach dryft jest wynikiem ruchów wywołanych wzrostem próbki lub elastycznością w podłożu mocującym próbkę. Istnieją metody kompensacji lub ograniczenia tych ruchów, w tym ulepszenia sprzętowych systemów ustawiania ostrości i zwiększona sztywność medium montażowego. Jednak w wielu przypadkach podejścia te nie mogą być stosowane ze względu na ustawienia obrazowania wymagane do zapewnienia odpowiednich warunków do utrzymania i wzrostu próbek. Istnieją rozwiązania programowe typu open source do korekcji ruchu w 2D w czasie, poprzez użycie wtyczek StackReg i TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 w ImageJ lub Fiji, ale nie można ich zastosować do zestawów danych 4D.

Aby skorygować dryf próbki, opracowaliśmy wtyczkę (Correct 3D Drift) do korzystania z platformy przetwarzania obrazowania o otwartym kodzie źródłowym, Fiji 1. Nasza wtyczka jest w stanie przeprowadzić rejestrację korelacji fazowej w celu skorygowania ruchu, który występuje w wyniku dryfu próbki w trójwymiarowych eksperymentach poklatkowych. Korelacja fazowa 6 to wydajna obliczeniowo metoda określania translacji między obrazami. Opisana tutaj wtyczka wykorzystuje bibliotekę korelacji fazowych opracowaną przez Preibisch et al.Rozdział 7. W eksperymentach wielokanałowych wtyczka wykorzystuje jeden kanał do określenia wymaganej korekcji. Ta korekta jest następnie stosowana do wszelkich dodatkowych kanałów, co skutkuje rejestracją zestawu danych 4D.  

W systemie modeli danio pręgowanego możliwe jest wykonywanie zdjęć poklatkowych przez okres wielu godzin, a nawet kilku dni 8. Powszechną metodą dosiadowywania danio pręgowanego jest osadzenie znieczulonego żywego zarodka w agarozie o niskiej temperaturze topnienia (0,8-1,5%), ograniczając jego ruch 9-11. Podczas gdy ruch jest ograniczony, wzrost próbki nadal następuje, co powoduje, że komórki w polu widzenia zmieniają pozycję. Aby śledzić ruch komórek w zarodku, należy najpierw skorygować ruch całej próbki. Protokół ten został opracowany z próbkami danio pręgowanego i został wykorzystany do obrazowania rozwoju somitów12, ale może być zastosowany do dowolnego zestawu danych konfokalnych 4D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Eksperymenty z obrazowaniem poklatkowym 4D

Ustawienia używane do pozyskiwania obrazów będą się różnić w zależności od używanego sprzętu. Zdolność mikroskopii konfokalnej do optycznego przekroju próbki zależy od wielu czynników: długości fali wzbudzenia, wielkości otworka, apertury numerycznej obiektywu, współczynnika załamania światła próbki i ośrodka, w którym próbka jest osadzona. Wybrany rozmiar otworka konfokalnego określi grubość zebranego przekroju optycznego. Mniejszy otwór stworzy cieńszy przekrój optyczny, zwiększając rozdzielczość osi z, ale zmniejszając ilość przechwytywanego światła. Większy otwór zwiększy grubość przekroju optycznego, zmniejszając rozdzielczość osi z, ale zwiększając ilość przechwytywanego światła.

Dodatkowe czynniki, które należy wziąć pod uwagę podczas zbierania danych 4D przed korektą, obejmują:

  1. Zoptymalizuj szybkość skanowania, aby usunąć lub ograniczyć dryft podczas przechwytywania pojedynczego punktu czasowego. W związku z tym czas potrzebny na zebranie obrazu powinien stanowić niewielki ułamek odstępu między punktami czasowymi.
  2. Idealnie powtarzające się struktury lub siatki nie nadają się jako struktury do rejestracji, ponieważ nie jest możliwe określenie wymaganej korekty. Losowo rozmieszczone koraliki lub nierówne struktury pozwolą na jednoznaczną rejestrację.
  3. Jeśli spodziewany jest dryf, zwiększ obszar skanowania oraz górny i dolny limit ostrości, aby upewnić się, że obszar zainteresowania pozostanie w stosie obrazów.
  4. Oprócz zapewnienia odpowiedniej rozdzielczości przestrzennej w celu rozpoznania interesujących struktur, należy ustawić częstotliwość próbkowania, aby zapewnić rozdzielczość czasową dla badanych zdarzeń dynamicznych.
    Uwaga: Czas między punktami czasowymi obrazu powinien zatem wynosić co najmniej połowę odstępu czasu między regularnie powtarzającymi się zdarzeniami i skracać się w przypadku zdarzeń nieregularnych.

2. Otwieranie zestawu danych konfokalnych

Pakiet open source Fiji jest dystrybucją programu ImageJ, który zawiera preinstalowane wtyczki do wykonywania licznych procesów na danych zebranych z eksperymentów mikroskopowych. Oprogramowanie zapewnia łatwiejszą architekturę aktualizacji wtyczek i zawiera kopię wtyczki Correct 3D drift używanej dla tego protokołu. Oprogramowanie obsługuje import szerokiej gamy zastrzeżonych formatów obrazów mikroskopowych za pomocą wtyczki importu Bio-Formats Open Microscopy Environment.

  1. Zainstaluj program Fidżi (http://fiji.sc/Downloads).
  2. Załaduj pozyskany zestaw danych za pomocą wtyczki LOCI Bio-Formats Importer.
  3. Jeśli zestaw danych jest większy niż pamięć przydzielona programowi, wybierz opcję "Użyj stosu wirtualnego" w sekcji Zarządzanie pamięcią.

3. Korygowanie dryfu obiektu 3D w przetwarzaniu końcowym

Podczas długiego eksperymentu poklatkowego próbka może się poruszać, nawet gdy jest osadzona. Aby skorygować dowolny ruch i umożliwić analizę zobrazowanych zdarzeń migracji, można przeprowadzić przetwarzanie końcowe obrazów. Cała obróbka obrazu po przetworzeniu musi być jasno opisana w metodologii wszelkich analiz wynikających z tej pracy.

  1. Po załadowaniu zestawu danych uruchom wtyczkę Correct 3D drift
    2. .
  2. Jeśli istnieje wiele kanałów obrazu, wybierz kanał, który ma być używany do rejestrowania obrazów. Idealnie byłoby, gdyby reprezentowało to strukturę statyczną w próbie, a nie jakiekolwiek elementy migrujące lub ruchome. Jeśli jednak nie jest to możliwe, należy wybrać kanał o najmniejszym ruchu.
  3. Jeśli dostępna pamięć RAM w systemie używanym do tej analizy jest mniejsza niż dwukrotny rozmiar oryginalnego zestawu danych, wybierz opcję Użyj stosu wirtualnego. Spowoduje to zapisanie zarejestrowanego hyperstacka jako sekwencji obrazów, zamiast zapisywania pliku w pamięci RAM.
    1. Wybierz folder, w którym wtyczka ma wyprowadzać pojedyncze pliki poprawionych obrazów. Dla każdego kanału w każdej pozycji z zostanie utworzony osobny plik obrazu.
  4. Wtyczka przeprowadzi następnie analizę korelacji fazowej parami między każdym punktem czasowym, aby określić wymaganą poprawkę, która jest następnie stosowana do zestawu danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W rozwijającym się danio pręgowanym komórki mięśni szybkich łączą się w wielojądrowe włókna od 19 godziny po zapłodnieniu (stadium 20 somitów) 13. Aby zwizualizować ruch jąder i fuzję komórek mięśniowych, przeprowadziliśmy konfokalne obrazowanie 4D w czasie rzeczywistym (time-lapse), wykorzystując linię transgeniczną wykazującą ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod kontrolą promotora α-aktyny szkieletowej w celu znakowania wszystkich komórek mięśniowych 14, oraz wstrzykując RNA kodu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasza zdolność do korzystania z oprogramowania do przetwarzania końcowego w celu skorygowania dryfu próbki zestawów danych pochodzących z rozszerzonych eksperymentów mikroskopii poklatkowej jest ograniczona przez wiele czynników. Zdolność do odróżnienia dryfu od ruchu migracyjnego próbki zależy od zastosowanych markerów komórkowych. Markery komórkowe, które albo ulegają szerokiej ekspresji w próbce, albo nie biorą udziału w zdarzeniach migracyjnych podczas akwizycji obrazu, stanowią najlepsze źródło korekcji dryfu. Wtycz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Gaby Martins i organizatorom warsztatów EMBO2010 Developmental Imaging w , gdzie rozpoczęła się ta praca, a także wszystkim współtwórcom projektów Fiji i ImageJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian (trikaina)Sigma-AldrichA5040
Agaroza o niskiej temperaturze żelowaniaSigma-AldrichA9414-25G
Dumont #4 KleszczeMikroskopia elektronowa Nauki0208-4-PO
Jednorazowa pipeta z podziałką 3 mlSamco212
Polietylenowa pipetatransferowa
9cm bakteryjne szalki PetriegoGreiner Bio One632180
Rurki fluorowane etylenowo-propylenowe (FEP)BolaS1815-04
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM-710Zeiss
W 20x/1.0 DIC ObiektywZeiss421452-9600-000
Obiektyw planapochromatyczny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  2. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
  3. Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
  4. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  5. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
  6. Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
  7. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).
  8. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
  9. Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
  10. Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
  11. Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
  12. Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
  13. Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).
  14. Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie konfokalne 4Dmikroskopia poklatkowarejestracja korelacji fazowejwtyczka Fiji ImageJkorekta dryfu 3Danaliza zbior w danych konfokalnychledzenie ruchu kom rekprzetwarzanie wirtualnych stos wprojekcja maksymalnej intensywno ci

Powiązane artykuły