Korekcja dryfu próbki po konfokalnym obrazowaniu poklatkowym 4D

Obrazowanie konfokalne jest szeroko stosowane w biologii komórkowej i rozwojowej do śledzenia ruchów komórek i zmian w morfologii. Uchwycenie serii przekrojów optycznych w różnych płaszczyznach ogniskowych pozwala na wygenerowanie trójwymiarowego (3D) modelu próbki, który można następnie rozszerzyć do czterowymiarowego (4D) poprzez utworzenie serii poklatkowych zestawów danych 3D. Generowanie zestawów danych 4D pozwala na szczegółowy pomiar ruchów i zachowań komórek. W długoterminowych eksperymentach poklatkowych często obserwuje się ruch próbki. Może to być spowodowane niewielkimi niedokładnościami w sprzęcie, stoliku sterującym i pozycjach ogniskowych. Podczas gdy w innych przypadkach dryft jest wynikiem ruchów wywołanych wzrostem próbki lub elastycznością w podłożu mocującym próbkę. Istnieją metody kompensacji lub ograniczenia tych ruchów, w tym ulepszenia sprzętowych systemów ustawiania ostrości i zwiększona sztywność medium montażowego. Jednak w wielu przypadkach podejścia te nie mogą być stosowane ze względu na ustawienia obrazowania wymagane do zapewnienia odpowiednich warunków do utrzymania i wzrostu próbek. Istnieją rozwiązania programowe typu open source do korekcji ruchu w 2D w czasie, poprzez użycie wtyczek StackReg i TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) ⁵ w ImageJ lub Fiji, ale nie można ich zastosować do zestawów danych 4D.

Aby skorygować dryf próbki, opracowaliśmy wtyczkę (Correct 3D Drift) do korzystania z platformy przetwarzania obrazowania o otwartym kodzie źródłowym, Fiji ¹. Nasza wtyczka jest w stanie przeprowadzić rejestrację korelacji fazowej w celu skorygowania ruchu, który występuje w wyniku dryfu próbki w trójwymiarowych eksperymentach poklatkowych. Korelacja fazowa ⁶ to wydajna obliczeniowo metoda określania translacji między obrazami. Opisana tutaj wtyczka wykorzystuje bibliotekę korelacji fazowych opracowaną przez Preibisch et al.^{Rozdział 7}. W eksperymentach wielokanałowych wtyczka wykorzystuje jeden kanał do określenia wymaganej korekcji. Ta korekta jest następnie stosowana do wszelkich dodatkowych kanałów, co skutkuje rejestracją zestawu danych 4D.  

W systemie modeli danio pręgowanego możliwe jest wykonywanie zdjęć poklatkowych przez okres wielu godzin, a nawet kilku dni ⁸. Powszechną metodą dosiadowywania danio pręgowanego jest osadzenie znieczulonego żywego zarodka w agarozie o niskiej temperaturze topnienia (0,8-1,5%), ograniczając jego ruch ^9-11. Podczas gdy ruch jest ograniczony, wzrost próbki nadal następuje, co powoduje, że komórki w polu widzenia zmieniają pozycję. Aby śledzić ruch komórek w zarodku, należy najpierw skorygować ruch całej próbki. Protokół ten został opracowany z próbkami danio pręgowanego i został wykorzystany do obrazowania rozwoju somitów¹², ale może być zastosowany do dowolnego zestawu danych konfokalnych 4D.

1. Eksperymenty z obrazowaniem poklatkowym 4D

Ustawienia używane do pozyskiwania obrazów będą się różnić w zależności od używanego sprzętu. Zdolność mikroskopii konfokalnej do optycznego przekroju próbki zależy od wielu czynników: długości fali wzbudzenia, wielkości otworka, apertury numerycznej obiektywu, współczynnika załamania światła próbki i ośrodka, w którym próbka jest osadzona. Wybrany rozmiar otworka konfokalnego określi grubość zebranego przekroju optycznego. Mniejszy otwór stworzy cieńszy przekrój optyczny, zwiększając rozdzielczość osi z, ale zmniejszając ilość przechwytywanego światła. Większy otwór zwiększy grubość przekroju optycznego, zmniejszając rozdzielczość osi z, ale zwiększając ilość przechwytywanego światła.

Dodatkowe czynniki, które należy wziąć pod uwagę podczas zbierania danych 4D przed korektą, obejmują:

1. Zoptymalizuj szybkość skanowania, aby usunąć lub ograniczyć dryft podczas przechwytywania pojedynczego punktu czasowego. W związku z tym czas potrzebny na zebranie obrazu powinien stanowić niewielki ułamek odstępu między punktami czasowymi.
2. Idealnie powtarzające się struktury lub siatki nie nadają się jako struktury do rejestracji, ponieważ nie jest możliwe określenie wymaganej korekty. Losowo rozmieszczone koraliki lub nierówne struktury pozwolą na jednoznaczną rejestrację.
3. Jeśli spodziewany jest dryf, zwiększ obszar skanowania oraz górny i dolny limit ostrości, aby upewnić się, że obszar zainteresowania pozostanie w stosie obrazów.
4. Oprócz zapewnienia odpowiedniej rozdzielczości przestrzennej w celu rozpoznania interesujących struktur, należy ustawić częstotliwość próbkowania, aby zapewnić rozdzielczość czasową dla badanych zdarzeń dynamicznych.
   Uwaga: Czas między punktami czasowymi obrazu powinien zatem wynosić co najmniej połowę odstępu czasu między regularnie powtarzającymi się zdarzeniami i skracać się w przypadku zdarzeń nieregularnych.

2. Otwieranie zestawu danych konfokalnych

Pakiet open source Fiji jest dystrybucją programu ImageJ, który zawiera preinstalowane wtyczki do wykonywania licznych procesów na danych zebranych z eksperymentów mikroskopowych. Oprogramowanie zapewnia łatwiejszą architekturę aktualizacji wtyczek i zawiera kopię wtyczki Correct 3D drift używanej dla tego protokołu. Oprogramowanie obsługuje import szerokiej gamy zastrzeżonych formatów obrazów mikroskopowych za pomocą wtyczki importu Bio-Formats Open Microscopy Environment.

1. Zainstaluj program Fidżi (http://fiji.sc/Downloads).
2. Załaduj pozyskany zestaw danych za pomocą wtyczki LOCI Bio-Formats Importer.
3. Jeśli zestaw danych jest większy niż pamięć przydzielona programowi, wybierz opcję "Użyj stosu wirtualnego" w sekcji Zarządzanie pamięcią.

3. Korygowanie dryfu obiektu 3D w przetwarzaniu końcowym

Podczas długiego eksperymentu poklatkowego próbka może się poruszać, nawet gdy jest osadzona. Aby skorygować dowolny ruch i umożliwić analizę zobrazowanych zdarzeń migracji, można przeprowadzić przetwarzanie końcowe obrazów. Cała obróbka obrazu po przetworzeniu musi być jasno opisana w metodologii wszelkich analiz wynikających z tej pracy.

1. Po załadowaniu zestawu danych uruchom wtyczkę Correct 3D drift
.
2. Jeśli istnieje wiele kanałów obrazu, wybierz kanał, który ma być używany do rejestrowania obrazów. Idealnie byłoby, gdyby reprezentowało to strukturę statyczną w próbie, a nie jakiekolwiek elementy migrujące lub ruchome. Jeśli jednak nie jest to możliwe, należy wybrać kanał o najmniejszym ruchu.
3. Jeśli dostępna pamięć RAM w systemie używanym do tej analizy jest mniejsza niż dwukrotny rozmiar oryginalnego zestawu danych, wybierz opcję Użyj stosu wirtualnego. Spowoduje to zapisanie zarejestrowanego hyperstacka jako sekwencji obrazów, zamiast zapisywania pliku w pamięci RAM.
   1. Wybierz folder, w którym wtyczka ma wyprowadzać pojedyncze pliki poprawionych obrazów. Dla każdego kanału w każdej pozycji z zostanie utworzony osobny plik obrazu.
4. Wtyczka przeprowadzi następnie analizę korelacji fazowej parami między każdym punktem czasowym, aby określić wymaganą poprawkę, która jest następnie stosowana do zestawu danych.

U rozwijającego się danio pręgowanego, szybkie komórki mięśniowe łączą się w wielojądrowe włókna po 19 godzinach od zapłodnienia (20- stadium somitowe) 13. W celu wizualizacji ruchu jąder i fuzji komórek mięśniowych przeprowadziliśmy konfokalne obrazowanie poklatkowe 4D przy użyciu szczepu transgenicznego, który eksprymuje białko zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą szkieletowego promotora α-aktyny w celu znakowania wszystkich komórek mięśniowych 14 i wstrzykniętego RNA kodującego czerwone białko fluorescencyjne mCherry oznaczone sekwencją lokalizacji jądrowej, do oznaczania jąder. Wstrzyknięte zarodki transgeniczne umieszczono w agarozie o niskiej temperaturze topnienia i wykonano sekwencję obrazu składającą się z 71 skrawków optycznych uchwyconych w odstępach 2,0 μm co 20 minut przez okres 2 godzin. W trakcie eksperymentu poklatkowego zaobserwowano dryf próbki o wielkości około 7 μm, co skutkowało rozmyciem nakładających się na siebie obrazów (ryc. 1A) i pozornym ruchem jąder w czasie (ryc. 1B). Zastosowanie wtyczki może skutkować zarejestrowaną sekwencją obrazów (rysunki 1C i 1D).

Ilustracja 1: protokół koryguje ruch próbki podczas akwizycji obrazu w przestrzeni trójwymiarowej. Średni obraz projekcji maksymalnych projekcji z każdego punktu czasowego nieskorygowanego zestawu danych, pokazujący specyficzną dla mięśni ekspresję GFP (A) i sekwencję lokalizacji jądrowej sprzężoną z mCherry (B). Zakres tego ruchu zmniejsza zdolność śledzenia jąder mięśniowych i fuzji, a obraz GFP jest ewidentny. Wynikowe skorygowane obrazy są pokazane w (C) i (D), demonstrując rejestrację zbioru danych.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.