Zoptymalizowane barwienie ujemne: wysokoprzepustowy protokół do badania małej i asymetrycznej struktury białka za pomocą mikroskopii elektronowej

Summary

Ponad połowa białek to małe białka (masa cząsteczkowa <200 kDa), które stanowią wyzwanie zarówno dla obrazowania mikroskopem elektronowym, jak i dla trójwymiarowych rekonstrukcji. Zoptymalizowane barwienie negatywowe to solidny i wysokoprzepustowy protokół umożliwiający uzyskanie obrazów o wysokim kontraście i stosunkowo wysokiej rozdzielczości (~1 nm) małych asymetrycznych białek lub kompleksów w różnych warunkach fizjologicznych.

Abstract

Strukturalne określanie białek jest dość trudne dla białek o masach cząsteczkowych między 40 - 200 kDa. Biorąc pod uwagę, że ponad połowa naturalnych białek ma masę cząsteczkową między 40 a 200 kDa^1,2, potrzebna jest solidna i wysokoprzepustowa metoda o rozdzielczości nanometrowej. Barwienie ujemne (NS) Mikroskopia elektronowa (EM) jest łatwym, szybkim i jakościowym podejściem, które często jest stosowane w laboratoriach badawczych do badania struktury białka i interakcji białko-białko. Niestety, konwencjonalne protokoły NS często generują artefakty strukturalne na białkach, zwłaszcza w przypadku lipoprotein, które zwykle tworzą artefakty rouleaux. Wykorzystując obrazy lipoprotein z mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) jako standardu, kluczowe parametry w warunkach przygotowania próbek NS zostały niedawno przebadane i przedstawione jako zoptymalizowany protokół NS (OpNS), zmodyfikowany konwencjonalny protokół NS ³ . Artefakty takie jak rouleaux mogą być znacznie ograniczone przez OpNS, dodatkowo zapewniając wysoki kontrast wraz z obrazami o dość wysokiej rozdzielczości (blisko 1 nm) małych i asymetrycznych białek. Te obrazy o wysokiej rozdzielczości i wysokim kontraście są korzystne nawet dla pojedynczej rekonstrukcji 3D białka (pojedynczego obiektu, bez średniej), takiej jak przeciwciało 160 kDa, za pomocą metody tomografii elektronowej^4,5. Co więcej, OpNS może być wysokowydajnym narzędziem do badania setek próbek małych białek. Na przykład wcześniej opublikowany mechanizm przenoszenia estru cholesterolu o masie 53 kDa (CETP) obejmował badania przesiewowe i obrazowanie setek próbek ⁶. Biorąc pod uwagę, że cryo-EM rzadko z powodzeniem obrazuje białka mniejsze niż 200 kDa, nie opublikowano jeszcze żadnego badania obejmującego badanie przesiewowe ponad stu warunków próbki, można śmiało nazwać OpNS wysokoprzepustową metodą badania małych białek. Miejmy nadzieję, że zaprezentowany tutaj protokół OpNS może być użytecznym narzędziem do przesuwania granic EM i przyspieszania badań EM nad strukturą, dynamiką i mechanizmami małych białek.

Introduction

Zrozumienie funkcji białka wymaga znajomości struktury białka. Określenie strukturalne jest wyzwaniem w przypadku białek, których masy cząsteczkowe mieszczą się w zakresie 40 - 200 kDa. Krystalografia rentgenowska jest ograniczona przez krystalizację białek; Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest ograniczona do mas cząsteczkowych mniejszych niż 40 KDa, podczas gdy mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) ma trudności zarówno w akwizycji obrazu, jak i trójwymiarowych (3D) rekonstrukcjach małych białek, których masy cząsteczkowe są mniejsze niż 200 kDa. Warto zauważyć, że ponad 50% białek ma masę cząsteczkową w zakresie 40 - 200 kDa^1,2, ponieważ obecne metody stanowią wyzwanie w badaniu białek tej wielkości, potrzebna jest nowa metoda.

Chociaż większość transmisyjnych mikroskopów elektronowych (TEM) jest zdolna do rozdzielczości atomowej, tj. lepszej niż 3 A, osiągnięcie nawet zbliżonej do nanometrowej rozdzielczości struktury z próbek biologicznych jest raczej^trudne7. Uszkodzenia spowodowane promieniowaniem, niski kontrast, odchylenia strukturalne, a także artefakty, takie jak odwodnienie, utrudniają obrazowanie TEM w wysokiej rozdzielczości^3,8.

Wśród różnych podejść TEM, cryo-EM jest zaawansowaną i najnowocześniejszą metodą osiągania struktur o rozdzielczości atomowej wysoce symetrycznych dużych makrocząsteczek w warunkach zbliżonych do fizjologicznych^9-12. Próbka cryo-EM jest przygotowywana w wyniku błyskawicznego zamrażania roztworu próbki, osadzania makrocząsteczek w szklistym lodzie, który jest następnie obrazowany w temperaturach kriogenicznych, takich jak temperatury ciekłego azotu lub helu¹³. Zaletą Cryo-EM jest to, że próbki nie wykazują żadnych artefaktów i są prawie natywne w strukturze^8-12. Cryo-EM ma swoje wady: i) wymagane jest zainstalowanie lub zakupienie dodatkowych urządzeń w celu ulepszenia standardowego instrumentu TEM do funkcji cryo-EM. Do urządzeń zalicza się: anty-concyminator, kriouchwyt, oprogramowanie w trybie niskiej dawki i kamerę CCD o niskiej dawce, chociaż ceny tych urządzeń są znacznie niższe niż cena samego instrumentu TEM; ii) operacja cryo-EM wymaga dłuższego czasu niż operacja NS. Badanie próbki cryo-EM często wymaga więcej czasu na przygotowanie próbek i obsługę przyrządu TEM niż w przypadku NS, ponieważ cryo-EM wymaga rozwiązania dodatkowych trudności, w tym: działania temperatury ciekłego azotu, ładowania próbki, dryftu obrazowania, gradientów temperatury, pracy modelu niskiej dawki, wrażliwości próbki na promieniowanie i ograniczeń dawkowania. Te dodatkowe kroki spowolnią szybkość pozyskiwania użytecznych danych w porównaniu z akwizycją danych NS, chociaż kilka obrazów krio-EM z pewnością może zostać uzyskanych w ciągu 1 godziny lub krócej przez ekspertów krio-EM z instrumentem przygotowanym ze zrównoważonym gradientem temperatury; iii) użytkownicy wymagają dodatkowego szkolenia, takiego jak obchodzenie się z ciekłym azotem, zamrażanie siatek krioelektromagnetycznych, obsługa niskich dawek, pomiar dawki, obsługa ładowania, dryfowanie i wiedza w zakresie przetwarzania obrazu; iv) brak powtarzalnego obrazowania dla tej samej próbki krio podczas różnych sesji TEM. Próbki Cryo-EM łatwo ulegają uszkodzeniu przez zanieczyszczenie lodem podczas załadunku i rozładunku próbek do/z przyrządu TEM. Uszkodzenie to jest szczególnie niepokojące, gdy próbki są trudne do wyizolowania/oczyszczenia¹⁴; v) małe białka (masa cząsteczkowa <200 kDa) są trudne do zobrazowania ze względu na niski kontrast; vi) niski kontrast i wysoki szum obrazów krio-EM zmniejszają wartość korelacji krzyżowej między obrazami, zmniejszając w ten sposób ogólną dokładność w określaniu orientacji, konformacji i klasyfikacji białek, szczególnie w przypadku białek, które są strukturalnie elastyczne i naturalnie ulegają wahaniom w roztworze^4,5.

Barwienie ujemne (NS) jest stosunkowo "starożytną" i historyczną metodą, którą każde laboratorium, z dowolnym typem EM, może wykorzystać do zbadania struktury białka. Brenner i Horne po raz pierwszy opracowali koncepcję barwienia negatywnego pół wieku temu do badania wirusów15. NS uzyskuje się poprzez pokrycie próbki naładowanymi solami metali ciężkich. Koncepcja ta wywodzi się z mikroskopii świetlnej i praktyki osadzania bakterii w roztworze barwienia, zapewniając ciemność wokół próbek, umożliwiając wyższy kontrast obrazu podczas oglądania obrazu negatywowego¹⁶. Ponieważ jony metali ciężkich mają większą zdolność do rozpraszania elektronów w porównaniu z mniej gęstymi atomami w białkach^17-20, a powlekanie barwnikiem metali ciężkich pozwala na większe ograniczenie dawki przy lepszym kontraście. Próbka NS może dostarczać obrazy o wysokim kontraście⁸ w celu łatwiejszego określenia orientacji cząstek i rekonstrukcji 3D niż obrazy z cryo-EM.

Tradycyjny NS, niestety, może wytwarzać artefakty wywołane przez interakcje barwnik-białko, takie jak ogólna agregacja, dysocjacja molekularna, spłaszczanie i układanie^8,21,22. W przypadku białek związanych z lipidami, takich jak lipoproteiny^16,23-30, powszechnym artefaktem są cząsteczki, które są ułożone w stos i upakowane razem w ruleaux (ryc. 1) ^31-36. Wiele badań lipoprotein, takich jak niedenaturująca elektroforeza w żelu gradientowym poliakrylamidowym, badania krio-EM^13,29,37-40, spektrometria mas^39,41 i dane dyfrakcji rentgenowskiej pod małym kątem⁴² pokazują, że cząstki lipoprotein są izolowanymi cząstkami, a nie naturalnie ułożonymi razem, tworząc rouleaux ^{21,29,30,35,42-45}. Obserwacja powstawania rouleaux przez konwencjonalny NS jest prawdopodobnie spowodowana dynamicznymi oddziaływaniami między lipoproteinami złożonymi z apolipoprotein (apo) i fosfolipidów, które są strukturalnie elastyczne w roztworze ^{13,29,30,46-49} i wrażliwością na standardowy protokół NS. Aby zidentyfikować ten artefakt, jako próbkę testową wykorzystano próbkę lipoproteiny (HDL) apolipoproteiny E4 (apoE4) palmitoilo-oleoilofosfatydylocholiny (POPC) o wysokiej gęstości jako próbki testowej i obrazy krio-EM dla wolnego od artefaktów standardu ²⁹, przesiewając próbki NS przygotowane w szeregu warunków. Porównując rozmiary i kształty cząstek uzyskanych z NS i cryo-EM, stwierdzono, że specyficzny rodzaj odczynnika barwiącego i stężenie soli są dwoma kluczowymi parametrami powodującymi dobrze znane zjawiska rouleaux. W związku z tym zgłoszono zoptymalizowany protokół barwienia ujemnego (OpNS).

Przez OpNS, dobrze znane zjawisko rouleaux apoE4 HDL zostało wyeliminowane przez OpNS (Rysunek 2A). Analiza statystyczna wykazała, że OpNS daje bardzo podobne obrazy (mniej niż 5% odchylenia) pod względem wielkości i kształtu w porównaniu do tych z cryo-EM, jednak kontrast został wyeliminowany. Walidacje OpNS przeprowadzono poprzez zbadanie eliminacji artefaktu rouleaux prawie wszystkich klas lub podklas próbek lipoprotein ^{6,29,30,50,51}, w tym apoA-I 7,8 nm (figura 2B), 8,4 nm (figura 2C), dyskoidalnie odtworzona HDL (ryc. 2D), sferyczny rHDL 9,3 nm (figura 2E), HDL ludzkiego osocza (figura 2F), apoA-I wolny od lipidów (rysunek 2G), HDL osocza (Figura 2H), lipoproteina o niskiej gęstości (LDL) (Figura 2I), lipoproteina o średniej gęstości (IDL) (Figura 2J), lipoproteina o bardzo niskiej gęstości (VLDL) (Figura 2K) i liposom POPC (Figura 2L) ³⁰. Dodatkowe walidacje przeprowadzono poprzez obrazowanie małych i asymetrycznych białek, w tym białka przenoszącego estry cholesterolu cholesterolu o masie 53 kDa (CETP) (Figura 3A - C)^6,29 i wysoce elastycznego przeciwciała IgG 160 kDa (Figura 4A i B)^4,5,29,52 oraz dwóch dobrze znanych strukturalnie białek, GroEL i proteasom (Figura 2M i N). W celu wymagania dodatkowej walidacji od współpracowników, jesteśmy otwarci na wszelkie ślepe testy tej metody OpNS.

OpNS jako protokół o wysokiej przepustowości został również wykorzystany do badania mechanizmu białkowego poprzez badanie setek próbek małych białek, takich jak CETP, które wiązały się z różnymi białkami w warunkach serii (w tym CETP oddziałujące z 4 klasami lipoprotein, rekombinowanym HDL, HDL w osoczu, LDL i VLDL, z/bez 2 przeciwciał, H300 i N13, poniżej 9 czasów inkubacji, w tym 3 min, 20 min, 1 godz., 2 godz., 4 godz., 8 godz., 24 godz., 48 godz. i 72 godz., w 4 proporcjach molowych, tj. 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4 i 3 rozcieńczeniach, tj. 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml i 0,001 mg/ml, plus dodatkowe próbki kontrolne, w tym sam CETP, sam LDL, i sam VLDL, z potrójnymi testami powyższych eksperymentów przeprowadzonymi przez różne osoby)^6,29. Obrazy CETP wykonane przez OpNS dostarczyły obrazów o wysokim kontraście z dość drobnymi szczegółami strukturalnymi; co pozwoliło nam z powodzeniem zrekonstruować mapę gęstości 3D małego białka CETP o masie 53 kDa (Rysunek 3D - F) poprzez rekonstrukcję pojedynczej cząstki. Co więcej, obrazy OpNS o wysokim kontraście dostarczają nam wystarczającego sygnału z pojedynczego białka (Figura 4A - C), co pozwoliło nam osiągnąć pośrednią rozdzielczość (~1,5 nm) pojedynczej (jeden obiekt, brak średniej) struktury 3D przeciwciała IgG za pomocą metody tomografii elektronowej pojedynczych cząstek (IPET) (Figura 4E - J)⁵. Szczegółowy opis strategii rekonstrukcji IPET, metodologii, procesów krok po kroku i analizy zmienności strukturalnej został wcześniej przedstawiony⁴. Film o procedurach rekonstrukcji przeciwciał IPET, w tym surowe obrazy i wyniki pośrednie, mapa gęstości 3D i dokowanie strukturalne, był również dostępny publicznie po umieszczeniu na YouTube⁵. Porównanie rekonstrukcji 3D z różnych pojedynczych cząstek przeciwciał może ujawnić dynamikę białek i zmiany konformacyjne podczas reakcji chemicznych^4,5.

Biorąc pod uwagę, że ponad 50% białek ma masę cząsteczkową w zakresie od 40 do 200 kDa^1,2, sukces w obrazowaniu tych małych białek dowodzi, że metoda OpNS jest użytecznym narzędziem do przesuwania konwencjonalnej granicy EM w kierunku małych i asymetrycznych oznaczeń strukturalnych i odkryć mechanizmów. W związku z tym szczegółowy protokół jest dostarczony jak poniżej.

Protocol

1. Przygotowanie świeżego roztworu do barwienia negatywnego o stężeniu 1% (w/v)

1. Umieść 1 mg proszku mrówczanu uranylu (UF) w szklanej butelce zawierającej 100 ml wody dejonizowanej w ciemnym pomieszczeniu lub pudełku.
2. Wymieszaj roztwór O/N w temperaturze RT w ciemnym pomieszczeniu/pudełku. Owiń butelkę z roztworem folią aluminiową, aby zapobiec wpadaniu światła do roztworu.
3. Delikatnie przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 μm (wielkość porów) zamontowany na strzykawce o pojemności 5 ml. Przefiltrowany roztwór zebrano do kilku rurek Falcon pokrytych folią aluminiową. Strzykawka z filtrem musi być również owinięta folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
4. Przefiltrować roztwór ponownie przez filtr 0,02 μm (wielkość porów) zamontowany na strzykawce o pojemności 1 ml. Przefiltrowany roztwór zebrano i podwielokrotniono do fiolek o pojemności 2 ml. Strzykawki i fiolki należy przykryć folią aluminiową przed użyciem.
5. Zamrozić podwielokrotne fiolki za pomocą kleszczy o długich uchwytach, zanurzając fiolki w pojemniku wypełnionym ciekłym azotem natychmiast po przefiltrowaniu roztworu.
6. Przenieść zamrożone fiolki do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu przechowywania i wykorzystania w przyszłości.

2. Przygotowanie stanowiska do barwienia negatywnego i stanowiska do inkubacji

1. Rozmrozić fiolkę z 1% roztworem UF w łaźni wodnej ustawionej na suchą temperaturę (RT). Upewnij się, że folia aluminiowa pozostaje owinięta wokół fiolki, aby zapobiec ekspozycji na światło.
2. Przefiltruj roztwór po całkowitym rozmrożeniu za pomocą owiniętej folią aluminiową strzykawki o pojemności 1 ml z filtrem 0,02 μm. Zbierz przefiltrowany roztwór do nowej fiolki owiniętej folią aluminiową i umieść go na lodzie w pojemniku na lód pokrytym nakrętką, czekając na użycie.
3. Przygotuj płytki roztworu, naciskając palcem arkusz Parafilmu o długości ~ 8 cali na powierzchnię pustej płytki krystalizacyjnej białka. Wygeneruje rzędy okrągłych płytek o średnicy ~5 mm. Wykonaj 6 płytek w każdym rzędzie, umieść płytki Parafilm na powierzchni spłaszczonego lodu w pokrywie pojemnika na lód, jako stację roboczą do barwienia.
4. Odpipetować ~35 μl wody dejonizowanej na każdą z trzech lewych płytek w każdym rzędzie, a pipetą ~35 μl przefiltrowanego roztworu UF na prawe trzy płytki w każdym rzędzie. Przykryj stację roboczą barwienia pokrywką, aby zapobiec ekspozycji na światło przed barwieniem białek.
5. Przygotuj stację inkubacyjną z siatką EM, wypełniając puste pudełko do połowy lodem i przyklejając obok wieszaka, który można zamontować na podstawie nośnej. Umieść pęsetę do próbek w wieszaku, w którym końcówki pęsety znajdują się blisko powierzchni lodu. Zakryj do połowy końcówki pęsety na wysokości krawędzi pudełka. Idealnym pojemnikiem na lód do wykonania stacji inkubacyjnej jest użycie pustego pojemnika na końcówki do pipet.

3. Operacja OpNS

1. Wyładowanie jarzeniowe cienkich siatek miedzianych EM o oczkach 300 pokrytych folią węglową przez 10 sekund.
2. Podnieś siatkę za pomocą pęsety i zaczep pęsetę o wieszak, trzymając siatkę pod kątem 45° i 1 cal nad powierzchnią lodu wewnątrz stacji inkubacyjnej.
3. Rozcieńczyć próbkę białka solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (DBPS) firmy Dulbecco przy końcowym stężeniu białka od ~0,01 do ~0,005 mg/ml. Natychmiast po rozcieńczeniu rozcieńczyć ~4 μl rozcieńczonej próbki po stronie węglowej siatki EM. (DPBS może zostać zamieniony na inny bufor, jeśli białko jest wrażliwe na DPBS)
4. Inkubować próbkę na siatkach EM przez ~1 minutę w stacji inkubacji.
5. Usuń nadmiar roztworu, szybko dotykając krawędzi siatki bibułą filtracyjną.
6. Szybko przyłóż siatkę do pierwszej kropli (~35 μl) powierzchni czystej wody na powierzchni arkusza Parafilm zaraz po usunięciu nadmiaru roztworu z siatki EM. A następnie natychmiast usuń nadmiar wody za pomocą bibuły filtracyjnej.
7. Powtórzyć krok 3.6 przez kolejne dwa razy, myjąc siatkę EM na pozostałych dwóch kropelkach wody na Parafilm (kroki 3.6 i 3.7 można pominąć, jeśli próbka jest bardzo wrażliwa na wodę).
8. Umieść siatkę EM natychmiast na powierzchni pierwszej kropli roztworu UF zaraz po usunięciu nadmiaru wody z siatki EM. A następnie inkubować przez 10 sekund. Upewnij się, że procedury mycia wodą zostały zakończone w ciągu 3 sekund przed uniesieniem siatki na powierzchni roztworu UF. Im krótszy czas prania, tym lepsza będzie jakość.
9. Wyczyść pęsetę, wbijając końcówki w bibułę filtracyjną ~2 - 3 razy.
10. Usuń nadmiar roztworu z siatki, stykając krawędź siatki z bibułą filtracyjną, a następnie unieś siatkę na drugiej kropli UF.
11. Kontynuuj powyżej kroku 3.10 na drugiej kropli.
12. Spławić siatkę na trzeciej kropli roztworu UF i przykryć stację barwienia na ~1 min.
13. Opcjonalny krok: szybko umyć ruszt na powierzchni wody, jak opisano w ppkt 3.6. Ten dodatkowy krok będzie korzystny dla próbek zawierających nadmiernie załadowane wolne cząstki złota lub plamy tła.
14. Usuń nadmiar roztworu, dotykając bibuły filtracyjnej do całego tyłu siatki (po przeciwnej stronie węglowej). Wysuszyć siatkę pod delikatnym strumieniem azotu gazowego o temperaturze pokojowej zaraz po zaobserwowaniu, jak roztwór wchłania się do bibuły filtracyjnej.
15. Umieść siatkę na arkuszu bibuły filtracyjnej wewnątrz szalki Petriego i częściowo przykryj naczynie nakrętką, aby wyschło przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. W przypadku niektórych próbek umieść siatkę w inkubatorze o temperaturze 40 °C i piecz przez godzinę.
16. Przechowuj siatkę w skrzynce siatki EM do przyszłego badania EM.

4. Egzamin EM

1. Prawidłowo wyrównaj TEM przed badaniem EM małych białek na siatce.
   1. Sprawdź rozdzielczość najwyższego widocznego pierścienia Thona, który jest widmem mocy amorficznej warstwy węglowej, aby określić, czy TEM został prawidłowo wyrównany. Ponieważ TEM jest współdzielony przez wielu różnych użytkowników, TEM często nie był odpowiednio wyrównany.
   2. Dokładnie sprawdź widmo mocy w obszarze folii węglowej próbki, aby dostosować warunki wyrównania maszyny. Najwyższe widoczne pierścienie Thon są lepsze niż rozdzielczość docelowa.
      UWAGA: Jako przykład prawidłowego ustawienia TEM filamentu LaB6 pracującego pod wysokim napięciem 120 kV, można zwizualizować ponad 20 pierścieni Thon, w których odpowiednia rozdzielczość może być lepsza niż 5,0 A. Ten pierścień Thona został osiągnięty przez transfer Fouriera amorficznej warstwy węgla zobrazowanej pod rozogniskowaniem ~1,6 μm i dawką 20,4 e-/Å2 (Ryc. 5).
      UWAGA: Obserwacja pierścienia Thon-ring o wysokiej rozdzielczości jest warunkiem koniecznym, ale niewystarczającym do prawidłowego ustawienia. Aby faktycznie uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości, ważnych jest również wiele innych parametrów, takich jak jakość próbki, uszkodzenia spowodowane promieniowaniem, ładowanie i dryfowanie, a także szybkość dawki oświetlenia.
2. Ustaw ostrość z powrotem na ogniskową bliską Scherzerowi, aby zobrazować małe białka na idealnie wybarwionym obszarze.
3. Wyszukaj "zachmurzony" obszar do zobrazowania. Idealnie zabarwiony obszar znajduje się zwykle w pobliżu krawędzi grubszego obszaru plamy, który wygląda jak "mętny" obszar na siatce, ponieważ grubość plamy zwykle nie jest równomiernie rozłożona na siatce pokrytej węglem (rysunek 6). Zazwyczaj małe powiększenie (<100x) miało pomóc w znalezieniu tych mętnych obszarów przed zbliżeniem w celu zobrazowania.

Results

Implementacje OpNS obejmują badania strukturalne i morfologiczne różnych gatunków lipoprotein, takich jak: powstający rekombinowany HDL (rHDL), sferyczny rekombinowany HDL, osocz HDL, LDL, IDL i VLDL (Rysunek 2)³⁰; a także małe białka, takie jak CETP 53 kDa (jedne z najmniejszych białek pomyślnie zobrazowanych przez EM) (Rysunek 3)⁶ i przeciwciała IgG 160 kDa (jedno z najbardziej dynamicznych i niejednorodnych białek) (Figura 4) ^4,5,29,52, nawet 28 kDa lipidowej wolnej apolipoproteiny A-1 (Figura 2L) oraz GroEL i proteasomy (Figura 2M i N).

Inne przykłady OpNS jako metody wysokoprzepustowej to badanie interakcji białko-białko w celu odkrycia mechanizmów białkowych, takich jak CETP 53 kDa. Jak opisano we wprowadzeniu, to, w jaki sposób CETP oddziałuje z różnymi podklasami lipoprotein, zbadano poprzez zbadanie ponad 400 próbek EM⁶ O ile nam wiadomo, nie było takiego przypadku badania krio-EM, które obejmuje badanie przesiewowe prawie stu różnych warunków .

OpNS może rozszerzać granice EM, aby badać małe i asymetryczne struktury białek 3D, a nawet rozszerzać, aby osiągnąć strukturę 3D z pojedynczego i indywidualnego białka (bez uśredniania). Na przykład przeciwciało IgG to cząsteczka o masie 160 kDa o bardzo elastycznej strukturze, w której rekonstrukcja 3D w rozdzielczości pośredniej jest trudna do osiągnięcia. metodę OpNS zastosowano do zobrazowania pojedynczego przeciwciała IgG z serii kątów nachylenia (Figura 4E i H). Obrazy białek o dość wysokiej rozdzielczości i wysokim kontraście z OpNS pozwoliły na pomyślną rekonstrukcję pojedynczego białka za pomocą tomografii elektronowej pojedynczych cząstek (IPET) (Figura 4E - J)^4,5. W rekonstrukcji IPET 3D⁴ serie pochylenia 2D docelowego przeciwciała były stopniowo dopasowywane do obliczonego globalnego środka poprzez następnie iteracyjną rekonstrukcję, aby osiągnąć gęstość 3D w rozdzielczości ~14,1 A (Figura 4F i G)⁴. Za pomocą tego samego podejścia zrekonstruowano pojedynczy kompleks przeciwciało-peptyd, a peptyd indukował zmianę konformacyjną domeny wewnętrznej pojedynczej cząstki przeciwciała (Figura 4I i J, rozdzielczość ~16,6 A)^4,5. Porównując rekonstrukcje 3D z różnych pojedynczych cząstek, analiza strukturalna może pozwolić nam ujawnić fluktuacje termodynamiczne białek, a nawet "strzelić" w pośrednie etapy reakcji chemicznej^4,5,29,53,54.

Podsumowując, białka o masie cząsteczkowej między 40 kDa - 200 kDa stanowią wyzwanie dla standardowych badań strukturalnych i rekonstrukcji EM. Biorąc pod uwagę, że ponad 50% białek ma masę cząsteczkową w zakresie od 40 do 200 kDa^1,2, przedstawiamy metodę OpNS jako solidne i wysokowydajne narzędzie, które przesuwa konwencjonalną granicę EM w kierunku małych i asymetrycznych oznaczeń strukturalnych, a nawet badań mechanistycznych.

Rysunek 1. Artefakt Rouleau lipoprotein przez konwencjonalne barwienie ujemne (NS) EM. Mikrofotografie elektronowe (powyżej paneli) i wybrane cząstki (poniżej paneli) pokazują różne lipoproteiny z rouleaux po NS z kwasem fosfowolframowym (PTA) w standardowej procedurze mieszania. (A) Odtworzony HDL (rHDL) z ApoE4, (B) dyskoidalny rHDL zawierający apoA-I 9,6 nm, (C) apoB zawierający LDL w osoczu, (D) liposomy POPC niezawierające apolipoproteiny. Paski: 50 nm. Rozmiar okna: A i C, 20 nm; B, 30 nm. Journal of Lipid Research początkowo opublikował tę pracę^29,30. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Struktura białka poprzez zoptymalizowane barwienie ujemne (OpNS) EM. Mikrofotografie elektronowe pokazują różne lipoproteiny i liposomy bez artefaktu rouleaux przez OpNS. A) rHDL zawierający apoE4; B) 7,8 nm rHDL; C) 8,4 nm rHDL; D) 9,6 nm rHDL; (E) sferyczny rHDL 9,3 nm; (F) Osocze ludzkie α-HDL; g) HDL w osoczu; H) LDL w osoczu ludzkim; (I) IDL w osoczu ludzkim; J) Osocze ludzkie VLDL; (K) Liposom POPC; (L) apoA-I wolne od lipidów. Dodatkową weryfikację przeprowadzono przy użyciu próbek (M) GroEL i (N) Proteasomu. Mikrofotografie (powyżej paneli) i wybrane cząstki (poniżej paneli). Paski: 50 nm. Rozmiar okna: A - D, 20 nm; E i F, 25 nm; G, 20 nm; H, 25 nm; I, 50 nm; J i K, 100 nm; L, 80 nm., Z wyjątkiem wolnego od lipidów apoA-I, GroEL i Proteasomu, Badanie to zostało pierwotnie opublikowane w Journal of Lipid Research^29,30. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Mikrografie elektronowe OpNS CETP. (A) Mikrografia poglądowa z cząstkami w kształcie banana CETP (przerywane koła). (B) Wybrane cząstki surowe w okienkach. (C) Trzy pojedyncze surowe obrazy cząstek CETP wyraźnie pokazujące większą, cięższą i większą końcówkę kulistą, w tym drugą mniejszą, lżejszą i węższą końcówkę (lewy panel), widok z góry pokazujący podobne obszary końcowe o mniejszej ogólnej krzywiźnie (panel środkowy) i widok końcowy w dół długiej osi CETP (prawy panel). (D) Nałożenie struktury krystalicznej (PDB: 2OBD) na te surowe obrazy cząstek CETP, dobrze pasuje zarówno pod względem kształtu strukturalnego, jak i wielkości domeny, pokazując, że orientacja może być prawie bezpośrednio zdefiniowana nawet bez pomocy komputera (odpowiednie panele do (C)). (E) Wolne od odniesienia średnie klasy 2D (proces ab initio do obliczania podobieństw (obliczanie korelacji krzyżowej) tych losowo zorientowanych cząstek, cząstki o dużym podobieństwie do siebie zostały pogrupowane, wyrównane, a następnie uśrednione w celu zmniejszenia szumu tła i zwiększenia kontrastu obrazu cząstki. Referencyjne średnie klas 2D są obliczane przez refine2D.py oprogramowanie w pakiecie EMAN, w którym żaden początkowy model stworzony przez człowieka nie był zaangażowany w tę średnią klas. Średnie klasy referencyjnej mogą być używane jako niezależna metoda do walidacji rekonstrukcji 3D na podstawie rekonstrukcji pojedynczej cząstki). (F) Wybrane średnie klasy 2D bez odniesienia wykazują większy koniec dystalny w porównaniu z innymi. (G) Porównanie nałożonej struktury krystalicznej (PDB: 2OBD) do średnich bez odniesienia, obrazy nakładane pokazują prawie idealne dopasowanie między średnią struktury krystalicznej a średnią klasy bez odniesienia zarówno pod względem kształtu struktury, jak i rozmiaru domeny (niski panel). (F) Mapa gęstości 3D CETP w rozdzielczości 13 A została zrekonstruowana z 8 879 cząstek zobrazowanych za pomocą OpNS i metody rekonstrukcji pojedynczej cząstki (górny panel), a prążkowane ciało zostało zadokowane do tej rekonstrukcji pojedynczej cząstki przez strukturę krystaliczną (niski panel). Szczegółowe informacje na temat rekonstrukcji pojedynczej cząstki, w tym wstępne przetwarzanie obrazu, model początkowy, procedury udoskonalania, rozkład kątów i korelacja powłoki Fouriera (FSC) zostały opublikowane w sekcji dotyczącej metody i informacjach uzupełniających w oryginalnej pracy (H) Końcowe porównanie rekonstrukcji pojedynczej cząstki (górny panel) i dodatkowe porównanie dopasowania PDB (dolny panel) ⁶. Pręty: A, 50 nm; B - D, 10 nm; F, 3 nm. Niektóre z tych rycin zostały wcześniej opublikowane w Nature Chemical Biology⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Obrazy OpNS i rekonstrukcje cząstek ludzkich przeciwciał IgG 1. (A) Przegląd obrazów OpNS ludzkiego przeciwciała IgG1. Cząstki pokazane w białych kółkach wyraźnie pokazują cząstki z 3 poddomenami. (B) Wybrane surowe obrazy o wysokiej rozdzielczości pięciu pojedynczych niesprzężonych cząstek przeciwciał i (C) odpowiadające im obrazy z redukcją szumów poprzez ręczną redukcję szumów otaczających krawędź surowych cząstek (bez dotykania jakiejkolwiek gęstości wewnątrz cząstek) w celu łatwej wizualizacji. (D) Struktura krystaliczna (wpis PDB 1IGT) przeciwciała IgG1, które było zorientowane na podobne oglądanie jak obrazy EM. Porównanie odpowiednich obrazów pokazuje wiele wspólnych cech między obrazem EM a strukturą krystaliczną, w tym pozycje domen i kształty. (E) Procedura krok po kroku rekonstrukcji 3D ab initio z pojedynczego przeciwciała IgG1 (bez średniej, jeden pojedynczy obiekt) przy użyciu metody tomografii elektronowej pojedynczych cząstek (IPET). (F) Końcowa rekonstrukcja 3D pojedynczej cząsteczki przeciwciała o rozdzielczości 14.1 A wykazała trzy domeny w kształcie pączka formujące się w kształcie litery "Y". (G) Dokowanie struktur krystalicznych domen odpowiednio do każdej z odpowiednich map gęstości domen i ręczne powtarzanie pętli między domenami. (H) Procedura rekonstrukcji 3D pojedynczego kompleksu peptydowego IgG (bez średniej, jeden pojedynczy obiekt) za pomocą IPET. (I) Ostateczna rekonstrukcja 3D kompleksu peptydowego IgG została wyświetlona w rozdzielczości 16.6 A pokazała trzy domeny w kształcie pręcików formujące się w kształcie litery "Y". (J) Odpowiednio, dokowanie struktury krystalicznej każdej domeny przeciwciała IgG (wpis PDB: 1IGT) do każdej gęstości kształtu pręcika wykazało słabe dopasowanie do struktur krystalicznych domeny, co sugeruje zmianę konformacyjną domeny wewnętrznej po koniugacji peptydu. Szczegółowa procedura, analiza rozdzielczości i statystyki zostały opisane w pracy oryginalnej ⁵ Bars: A, 50 nm; B - D, 10 nm. Praca ta została pierwotnie opublikowana w PLoS ONE⁴ i Scientific Reports⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Widmo mocy amorficznej warstwy węglowej zobrazowane pod kątem rozogniskowania 1,6 μm za pomocą obiektywu Zeiss Libra 120 LaB6 TEM. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości wymaga wystarczających dowodów, aby wykazać, że EM ma prawidłowe wyrównanie i zdolność do wysokiej rozdzielczości. Analiza widma mocy pobliskiego obszaru węglowego w sieci jest skuteczną metodą sprawdzenia stanu koherencji wiązki przed pozyskaniem danych. Transfer Fouriera obrazu amorficznego obszaru węgla pokazuje funkcję transferu kontrastu związaną z instrumentem (CTF), tzw. pierścienie Thona. Właściwe wyrównanie i spójność może być odzwierciedlone przez liczbę widocznych pierścieni Thona i najwyższą rozdzielczość widocznych pierścieni Thon w warunkach stosunkowo wysokiego rozmycia. Jako przykład prawie prawidłowego stanu wyrównania TEM wyposażonego w filament LaB₆, ponad ~20 pierścieni Thon (~5 A) można wygenerować z filmu węglowego przy rozogniskowaniu 1,6 μm przy dawce 20,4 e^-/Ų. Pierścienie Thon uzyskane z TEM z niższej półki mają podobny efekt do tego z wysokiej klasy TEM, na przykład TEM z pistoletem z emisją polową (FEG) wzmocnionym działaniem w odpowiednich warunkach wyrównania. Praca ta została pierwotnie opublikowana w Scientific Reports⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Przykładowe mikrofotografie "idealnych" obszarów do obrazowania OpNS. Trzy próbki białek, (A) GroEL (B) Proteasom (C) sferyczny HDL, zostały użyte jako przykłady w celu zademonstrowania idealnego OpNS do obrazowania. Ponieważ plamy są nierównomiernie rozłożone w próbce, małe powiększenie próbki zwykle wydaje się "mętne" (skrajny lewy panel). Idealne obszary do obrazowania zwykle znajdują się w granicach tych "chmur". Przykład powiększania krok po kroku jednego "mętnego" obszaru plamy (lewy środkowy panel) pokazuje obrazy w dużym powiększeniu przedstawiające obrazy cząstek o wysokiej rozdzielczości i wysokim kontraście (prawy środkowy panel). Wybrane obrazy cząstek pokazują szczegóły struktury białek (skrajny prawy panel). Paski: 30nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Schematyczny schemat procedur OpNS. (A) Stacja inkubacji z siatką EM, prosta stacja do inkubacji roztworu próbki na siatce rozżarzonej. (B) Stacja robocza do barwienia, zaprojektowana w celu utrzymania kropelek wody myjących i kropelek plam nad złożem lodu, przy jednoczesnym zminimalizowaniu ekspozycji plam na światło. (C) Przegląd procedury barwienia, ilustrujący: kierunek blottingu, 3x płukanie wodą, 3x ekspozycja na plamy UF, inkubacja barwienia z odwróconą siatką próbki na kropelkach plamy i końcowe osuszanie próbki z tyłu w celu zapewnienia cienkiej warstwy roztworu barwienia próbki przed wysuszeniem powietrzem azotowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8. Obrazy o wysokiej rozdzielczości CETP małego białka 53 kDa ujawnione dzięki zmodyfikowanej metodzie OpNS, barwieniu kriopozytywnemu (cryo-PS). Pięć wybranych miękkich, zamaskowanych surowych obrazów cząstek CETP o kształcie koła, miękko zamaskowanych, o kształcie koła, przedstawiających cząstki CETP (z odwróconym kontrastem) oraz zamaskowanych cząstek o kształcie cząstek (ręcznie zredukowane szumy otaczające krawędzie obrazów surowych cząstek, ale bez modyfikowania gęstości w obrębie cząstek), aby ułatwić wizualizację. Porównanie struktury krystalicznej wszystkich atomów i wstęg z zamaskowanymi surowymi cząstkami wyrównanymi do podobnych orientacji każdej cząstki do obrazów EM. Szczegóły surowego obrazu o wysokiej rozdzielczości wykazują pewne podobieństwo do struktury krystalicznej, podczas gdy nie wszystkie cechy struktury krystalicznej można rozpoznać na podstawie surowych danych. Co ciekawe, te surowe obrazy wykazują podobieństwo na obu końcach terminali z pobliskimi małymi okrągłymi otworami widocznymi na ręcznie zredukowanych obrazach szumów (trójkąty); ponadto nici w obszarach C-końcowych w obrazach cząstek uzupełniają strukturę krystaliczną β-arkuszy (strzałki) i wreszcie wystające pętle w obszarze C-końcowym CETP są podobne do struktury krystalicznej (diamenty). (A) Pięć wybranych surowych obrazów cząstek CETP o wysokiej rozdzielczości i okrągłym kształcie, miękko zamaskowanych, (z odwróconym kontrastem). (B) Filtrowanie dolnoprzepustowe do 10A. (C) Filtrowanie górnoprzepustowe wyższe do 20A. (D) Zamaskowane obrazy z ręczną redukcją szumów. (E) Porównanie struktury krystalicznej według struktury wstęgi. (F) Porównanie struktury krystalicznej przez wszystkie reprezentacje atomów. Pasek: 5nm. Część tej pracy została opublikowana w Nature Chemical Biology⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9. Mikrofotografie elektronowe liposomów pokazujące tworzenie rouleau za pomocą konwencjonalnego protokołu NS (barwienie PTA) przy różnym zasoleniu. (A) Wysokie zasolenie (~0,5 MNaCl). (B) Regularne zasolenie (~0,25 M NaCl). (C) Niskie zasolenie (~0,1 M NaCl). (D) Czysta woda. Mikrofotografie (powyżej panelu) i wybrane cząstki w okienkach (poniżej panelu) pokazane. Paski: 100 nm. Rozmiar okna: 80 nm. Journal of Lipid Research pierwotnie opublikował tę pracę³⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W porównaniu z konwencjonalnymi technikami NS, OpNS może zapobiegać artefaktom rouleaux (ryc. 1 i 9), zapewniając wiarygodne i rozsądne szczegóły strukturalne małych białek o wysokiej rozdzielczości (~1 nm) (ryc. 2). W porównaniu z cryo-EM, OpNS zapewnia metodę o wysokiej przepustowości i może badać szeroką gamę białek i interakcji białko-białko⁶. Jednak OpNS nadal ma swoje wady. W porównaniu z konwencjonalnym NS, OpNS pociąga za sobą: i) bardziej skomplikowane etapy przygotowania próbki; ii) przy użyciu substancji promieniotwórczej, UF; iii) utrzymanie świeżości plamy ze względu na krótszą siłę działania plamy UF ze względu na jej wrażliwość na światło; iv) w celu zapobieżenia wytrącaniu się osadów, roztwór UF musi być przechowywany w temperaturze -80 °C i wymaga rozmrożenia przed użyciem; v) i wreszcie wszystkie UF muszą być traktowane jako odpady niebezpieczne. W porównaniu do cryo-EM, OpNS zapewnia obrazy o stosunkowo niższej rozdzielczości i nie ma gwarancji na jakikolwiek jeszcze nie odkryty artefakt w przyszłości.

Działanie NS Wpływ proceduralny na tworzenie lipoprotein rouleaux

Protokoły NS przygotowania białek do badania^16,29-36,55 można podzielić na trzy główne grupy metod⁵⁰: mieszanie⁵⁵, kropla po kropli¹⁶ i procedury płukania²⁹. i) Protokół mieszania wymaga wstępnego wymieszania próbki barwienia i białka w określonym stosunku, a następnie nałożenia zmieszanego roztworu na folię węglową pokrytą na siatce, ostatecznie usuwając nadmiar roztworu bibułą filtracyjną przed wysuszeniem na powietrzu w celu badania EM⁵⁵. ii) Protokół kropla po kropli polega na nałożeniu kropli próbki (~ 4 μl) bezpośrednio na siatkę EM pokrytą węglem, pozostawiając na ~ 1 minutę, a następnie usuwając nadmiar roztworu próbki przed nałożeniem kropli (~ 4 μl) roztworu barwie po tej samej stronie siatki. Po ~1 min inkubacji usunąć nadmiar plamy poprzez kontakt z czystą bibułą filtracyjną, ostatecznie poddając do suszenia na powietrzu^16,56-58. iii) Protokół płukania (rysunek 7) wymagający nałożenia roztworu próbki na siatkę EM pokrytą węglem przez 1 minutę, a następnie trzykrotne przemycie wodą dejonizowaną zaraz po usunięciu nadmiaru roztworu za każdym razem za pomocą bibuły filtracyjnej^3,29,30. Protokół OpNS został zmodyfikowany w stosunku do tej procedury mycia.

Rodzaje barwienia NS i wpływ na tworzenie lipoprotein rouleaux

W NS silniejsze rozpraszanie elektronów spowodowane barwieniem metalami ciężkimi zapewnia kontrast z białkami^17-20,59. Próbki NS mogą dodatkowo cierpieć na większe dawki promieniowania i wzmacniać cechy białka poprzez ostrzejszy kontrast ujemny^8,9,60. Barwniki metali ciężkich można podzielić na: anionowe, w tym kwas fosfowolframowy (PTA)¹⁶, wolframian metyloaminy¹⁴ i wolfracian krzemu⁶¹; i kationowe, takie jak octan uranylu (UA)⁶², UF^3,29,30 i azotan uranylu (UN)⁶³. Jednym z najczęściej stosowanych anionowych barwników NS jest PTA^33,64-67. PTA to kwas heteropoli, który jest zwykle stosowany o pH około 7,0 - 7,5. PTA może być również stosowany do barwienia dodatniego^3,16,68. Ujemne ładunki PTA mogą pośredniczyć w oddziaływaniach elektrostatycznych z nienasyconymi lipidami dodatnio naładowanymi grupami głowy, takimi jak POPC, zarówno na powierzchniach lipoprotein, jak i liposomów. PTA może powodować tworzenie się ruleaux poprzez tę interakcję ^29,30 nawet przy regularnym zasoleniu buforu^29,30 (ryc. 1). Barwienia uranylowe, takie jak UA, UF i UN, są alternatywnym wyborem dla kationowych barwników metali ciężkich, a w szczególności UA jest często stosowany do NS różnych próbek biologicznych^62,69,70. Eksperymenty wykazały, że UF nie powoduje ruleaux lipoprotein zawierających nienasycone lipidy kwasów tłuszczowych, takich jak POPC. Jednak UF może nadal indukować tworzenie rouleaux na lipoproteinach, które zawierają nasycone lipidy kwasów tłuszczowych, takie jak dimyrystoylfosfatydylocholina (DMPC) i 1-heksadekanoilo-2-oktadekanoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (PSPC). Szczegółowy mechanizm tej interakcji nie jest znany. UA/UF/UN mogą pracować przy niższych wartościach pH w zakresie od 3,5 do 4,6. Tak niższe wartości pH mogą nie być odpowiednie dla niektórych makrocząsteczek biologicznych, które są wrażliwe na pH^14,71. Co ciekawe, UA/UF może naprawić strukturę białka w ciągu kilku milisekund za pomocą nieznanego mechanizmu⁷². W przeciwieństwie do PTA, UA/UF jest bardziej podobny do soli niż kwasu.

UF podobno może zapewnić lepsze wyniki niż UA⁷³, w którym plamy UF i UN mają mniejsze rozmiary ziaren niż UA (UF: 0,3 nm, UN: ~0,5 nm)^3,74. Interesującym przykładem są drugorzędowe szczegóły przypominające strukturę małego białka (53 kDa CETP) bezpośrednio wizualizowane na podstawie surowych mikrofotografii, gdy UF został użyty jako odczynnik barwienia ujemnego, postępując zgodnie z wcześniej opisaną metodą barwienia krio-dodatniego (cryo-PS) (Figura 8)⁶. W cryo-PS wybarwiona próbka została błyskawicznie zamrożona poprzez zastosowanie procedury przygotowania próbki cryo-EM zamiast procedury suszenia w protokole OpNS, co może spowodować wtórne zapadnięcie się struktury. Cryo-PS to metoda obrazowania małych białek o wysokim kontraście i wysokiej rozdzielczości⁷⁵. Ponieważ obrazy cryo-PS mają odwrócony kontrast w porównaniu z tymi z raportowanego protokołu cryo-NS ²², ale mają stały kontrast obrazu z tymi z konwencjonalnych obrazów cryo-EM, dlatego nazwano ją metodą cryo-PS. Obrazy cryo-PS pokazują, że odczynnik barwiący, mrówczan uranylu, wnika w powierzchnię molekularną, kwestionując konwencjonalny pogląd, że barwienie może uwidocznić tylko zewnętrzną strukturę powierzchni. Mechanizm przenikania mrówczanu uranylu do powierzchni molekularnej jest nieznany. Jedną z możliwości jest to, że kation Uranyl wiąże dostępne białkowe grupy karboksylowe, a zatem otaczający lód szklisty ma mniejszą gęstość niż barwienie białka i grup Uranyl, działając w ten sposób jako barwienie dodatnie. Metoda cryo-PS jest podobna do metody wielokrotnej wymiany izomorficznej (MIR), która była powszechnym podejściem do rozwiązania problemu fazowego w krystalografii rentgenowskiej ^76-78. W MIR próbki kryształów są nasączane roztworem ciężkich atomów, w tym uranu, aby uzyskać formę izomorficzną do formy natywnej. Dodanie ciężkiego atomu czasami nie wpływa na tworzenie się kryształów ani wymiary komórki elementarnej, ale dostarcza dodatkowych informacji na temat określania struktury krystalicznej^76-78. Korzystając z małego ziarna UF, cryo-PS może zapewnić obraz pojedynczego białka o wysokim kontraście i wysokiej rozdzielczości, co jest ważne dla badań struktury białka, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że prawie wszystkie białka są naturalnie dynamiczne i niejednorodne w roztworze. W celu walidacji tej metody cryo-PS otwieramy się na dowolny ślepy test z pola EM.

Wpływ stężenia soli na tworzenie rouleaux w lipoproteinach

Używając tradycyjnego odczynnika barwiącego PTA ujemnego, obserwowane tworzenie się rouleaux jest bardziej prawdopodobne związane z interakcjami lipidów niż z interakcją z białkami. Obrazując próbki pęcherzyków liposomowych POPC przygotowanych przy znacznym zasoleniu (0,5 M NaCl), umiarkowanym zasoleniu (0,25 M NaCl), stosunkowo słabym zasoleniu (0,1 M NaCl) i czystej wodzie (Figura 9), mikrofotografie elektronowe pokazują, że tworzenie rouleaux było skorelowane ze stężeniem soli (Figura 9A - D). Stosując UF jako ujemny odczynnik barwiący, nie zaobserwowano rouleaux w próbce pęcherzyków liposomowych POPC³⁰ (ryc. 2L), co sugeruje, że procedura mycia w celu szybkiego zmniejszenia stężenia soli tuż przed barwieniem jest koniecznym, ale nie wystarczającym samodzielnie krokiem do zapobiegania rouleaux w próbkach związanych z POPC.

Obrazowanie małego białka TEM wymaga warunku ogniskowego zbliżonego do scherzera.

Udane obrazowanie TEM małych białek w wyższej rozdzielczości wymaga dwóch krytycznych warunków: prawidłowego ustawienia wiązki i warunków akwizycji ostrości zbliżonej do Scherzera. i) Prawidłowe ustawienie wiązki można ocenić na podstawie liczby widocznych pierścieni Thona (widmo mocy) na transferze Fouriera obrazu filmu węglowego uzyskanego przy stosunkowo dużym rozogniskowaniu. Im lepszy stan wyrównania belki, tym więcej pierścieni Thon można zwizualizować i zmierzyć. ii) Uzyskanie obrazu w ognisku zbliżonym do Scherzera jest kolejnym krytycznym warunkiem. Tradycyjna standardowa strategia obrazowania próbek biologicznych zazwyczaj wykorzystuje wysokie rozogniskowanie (1 - 2 μm, a nawet więcej), co może zwiększyć kontrast obrazu próbki biologicznej ⁷⁹. Strategia ta znacznie różni się od typowej strategii obrazowania struktury rozdzielczości atomowej twardych materiałów, która często wykorzystuje ognisko bliskie Scherzerowi (rozogniskowanie ~50 nm). Chociaż większe rozogniskowanie mogłoby wzmocnić kontrast próbki biologicznej, sygnały o wysokiej rozdzielczości zostałyby częściowo wyeliminowane. W rezultacie, udział sygnału o wysokiej rozdzielczości byłby niższy w warunkach obrazowania z wyższym rozmyciem. Powodem jest to, że obraz TEM jest splotem struktury próbki i instrumentu CTF. CTF jest krzywą oscylacyjną w stosunku do częstotliwości, w której krzywa często oscylowała, przecinając zerową amplitudę przy wysokiej częstotliwości. Za każdym razem, gdy CTF przekroczy zero, próbkowany sygnał strukturalny o tej określonej częstotliwości zostanie wyeliminowany (zero razy dowolna liczba będzie równa zero). Wyeliminowany sygnał o tej częstotliwości nigdy nie może być odzyskany przez żaden algorytm korekcji CTF (zero podzielone przez zero może być dowolną liczbą losową zamiast oryginalnego sygnału strukturalnego). Przy obrazowaniu z wyższym rozogniskowaniem CTF będzie oscylował znacznie bardziej agresywnie, dzięki czemu CTF częściej przekracza zerową amplitudę, w wyniku czego sygnały strukturalne o większej liczbie określonych częstotliwości zostaną wyeliminowane. Im więcej sygnałów zostanie wyeliminowanych, tym mniejszy będzie współudział w obrazie. Warto zauważyć, że współudział obrazu nie może być odzyskany ani skorygowany przez żadną korektę CTF. Jednak pewna liczba nieukończonych obrazów uzyskanych przy różnych rozogniskowaniach może być wykorzystana do wypełnienia ich luk względem siebie, aby uzyskać kompletny sygnał strukturalny struktury próbki za pomocą metody uśredniania, w której można osiągnąć nawet rozdzielczość atomową ^9-12 .

Metoda uśredniania jest skutecznym podejściem do uzyskania struktury niektórych wysoce symetrycznych białek i strukturalnie powiązanych sztywnych białek. Jednak nadal pozostaje wyzwaniem w badaniach strukturalnych małych i asymetrycznych białek, zwłaszcza w przypadku dynamiki strukturalnej i elastycznych białek, takich jak przeciwciała i HDL. Uśrednianie opiera się na założeniu, że cząstki białka są identyczne pod względem struktury i konformacji, ale różnią się orientacją, jednak wiadomo, że wiele białek ulega wahaniom termodynamicznym w roztworze. Stosując metodę uśredniania bez wcześniejszej znajomości fluktuacji termodynamicznych białek, uśredniona struktura może często powodować brakujące domeny ^10,80 lub lokalną zmienność rozdzielczości ⁸¹ w rekonstrukcjach krio-EM.

Sukces w osiągnięciu rekonstrukcji 3D małego białka, takiego jak CETP 53 kDa, oraz struktury 3D pojedynczego białka, takiego jak przeciwciało IgG1 160 kDa, jest korzystny dzięki zastosowaniu warunków obrazowania ogniskowego zbliżonego do Scherzera w odpowiednich warunkach wyrównania. Chociaż kontrast obrazu wydaje się niski na obrazach o ostrości zbliżonej do Scherzera, kontrast można łatwo poprawić, po prostu stosując filtrowanie dolnoprzepustowe w celu zmniejszenia szumów o wysokiej częstotliwości w tle. Uważamy, że obrazy ostrości zbliżone do Scherzera przenoszą maksymalne sygnały strukturalne i mogą zwiększyć dokładność wyrównania cząstek oraz zwiększyć wydajność w rekonstrukcji 3D pojedynczych cząstek i rekonstrukcji tomografii elektronowej pojedynczych cząstek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Barwienie: Mrówczan uranylu	SPI Dział Dostaw Sondy Strukturalnej, Inc.	02545-AA	http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml
Strzykawka: 1 ml NORM-JECT	VWR	89174-491	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491
Filtr strzykawkowy: 0,2 μ m	VWR	28145-487	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487
Filtr strzykawkowy: 0,02 μ m filtr (Anotop 10)	Whatman	6809-1002	http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	SIGMA-Aldrich	D8537	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en®ion=US
Parafilm: 4 cale x 125 stóp	VWR	470152-246	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A
Siatka TEM pokryta folią węglową: 300 oczek	Pacific Grid-Tech	Cu-300CN	http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon
Siatka TEM pokryta folią węglową: 200 oczek	EMS (Electro Microscopy Sciences)	CF200-Cu	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx
Pęseta: Pęseta Dumont L5	EMS (Electro Microscopy Sciences)	72882-D	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5
Milli-Q Advantage A10 System oczyszczania wody ultraczystej	EMD Millipore	Milli-Q Advantage A10	http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117
Bibuła filtracyjna: koła klasy 1	Whatman	1001-090	http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx
Folia			Dowolny rodzaj
Końcówki filtrów: Końcówki filtrów aerozolowych o niskiej retencji do 10 i mikro; L Pipety	VWR	89174-520	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520
[nagłówek]
Jednostka wyładowcza jarzeniowa	Ted Pella	91000	http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm
Końcówki filtrów: Końcówki filtrów aerozolowych o niskiej retencji do 40 i mikro; L Pipety	VWR	89174-524	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524
Końcówki filtrów: VWR Signature 200 µ L Końcówki do pipet	VWR	37001-528	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528
Pipet	Pipetman	F161201 i F167300	http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx