Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowane barwienie ujemne: wysokoprzepustowy protokół do badania małej i asymetrycznej struktury białka za pomocą mikroskopii elektronowej

45.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51087

⸱

15 sierpnia 2014

 ,  , 
1Lawrence Berkeley National Laboratory, The Molecular Foundry

W tym artykule

Podsumowanie

Ponad połowa białek to małe białka (masa cząsteczkowa <200 kDa), które stanowią wyzwanie zarówno dla obrazowania mikroskopem elektronowym, jak i dla trójwymiarowych rekonstrukcji. Zoptymalizowane barwienie negatywowe to solidny i wysokoprzepustowy protokół umożliwiający uzyskanie obrazów o wysokim kontraście i stosunkowo wysokiej rozdzielczości (~1 nm) małych asymetrycznych białek lub kompleksów w różnych warunkach fizjologicznych.

Streszczenie

Strukturalne określanie białek jest dość trudne dla białek o masach cząsteczkowych między 40 - 200 kDa. Biorąc pod uwagę, że ponad połowa naturalnych białek ma masę cząsteczkową między 40 a 200 kDa1,2, potrzebna jest solidna i wysokoprzepustowa metoda o rozdzielczości nanometrowej. Barwienie ujemne (NS) Mikroskopia elektronowa (EM) jest łatwym, szybkim i jakościowym podejściem, które często jest stosowane w laboratoriach badawczych do badania struktury białka i interakcji białko-białko. Niestety, konwencjonalne protokoły NS często generują artefakty strukturalne na białkach, zwłaszcza w przypadku lipoprotein, które zwykle tworzą artefakty rouleaux. Wykorzystując obrazy lipoprotein z mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) jako standardu, kluczowe parametry w warunkach przygotowania próbek NS zostały niedawno przebadane i przedstawione jako zoptymalizowany protokół NS (OpNS), zmodyfikowany konwencjonalny protokół NS 3 . Artefakty takie jak rouleaux mogą być znacznie ograniczone przez OpNS, dodatkowo zapewniając wysoki kontrast wraz z obrazami o dość wysokiej rozdzielczości (blisko 1 nm) małych i asymetrycznych białek. Te obrazy o wysokiej rozdzielczości i wysokim kontraście są korzystne nawet dla pojedynczej rekonstrukcji 3D białka (pojedynczego obiektu, bez średniej), takiej jak przeciwciało 160 kDa, za pomocą metody tomografii elektronowej4,5. Co więcej, OpNS może być wysokowydajnym narzędziem do badania setek próbek małych białek. Na przykład wcześniej opublikowany mechanizm przenoszenia estru cholesterolu o masie 53 kDa (CETP) obejmował badania przesiewowe i obrazowanie setek próbek 6. Biorąc pod uwagę, że cryo-EM rzadko z powodzeniem obrazuje białka mniejsze niż 200 kDa, nie opublikowano jeszcze żadnego badania obejmującego badanie przesiewowe ponad stu warunków próbki, można śmiało nazwać OpNS wysokoprzepustową metodą badania małych białek. Miejmy nadzieję, że zaprezentowany tutaj protokół OpNS może być użytecznym narzędziem do przesuwania granic EM i przyspieszania badań EM nad strukturą, dynamiką i mechanizmami małych białek.

Wprowadzenie

Zrozumienie funkcji białka wymaga znajomości struktury białka. Określenie strukturalne jest wyzwaniem w przypadku białek, których masy cząsteczkowe mieszczą się w zakresie 40 - 200 kDa. Krystalografia rentgenowska jest ograniczona przez krystalizację białek; Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest ograniczona do mas cząsteczkowych mniejszych niż 40 KDa, podczas gdy mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) ma trudności zarówno w akwizycji obrazu, jak i trójwymiarowych (3D) rekonstrukcjach małych białek, których masy cząsteczkowe są mniejsze niż 200 kDa. Warto zauważyć, że ponad 50% białek ma masę cząsteczkową w zakresie 40 - 200 kDa1,2, ponieważ obecne metody stanowią wyzwanie w badaniu białek tej wielkości, potrzebna jest nowa metoda.

Chociaż większość transmisyjnych mikroskopów elektronowych (TEM) jest zdolna do rozdzielczości atomowej, tj. lepszej niż 3 A, osiągnięcie nawet zbliżonej do nanometrowej rozdzielczości struktury z próbek biologicznych jest raczejtrudne7. Uszkodzenia spowodowane promieniowaniem, niski kontrast, odchylenia strukturalne, a także artefakty, takie jak odwodnienie, utrudniają obrazowanie TEM w wysokiej rozdzielczości3,8.

Wśród różnych podejść TEM, cryo-EM jest zaawansowaną i najnowocześniejszą metodą osiągania struktur o rozdzielczości atomowej wysoce symetrycznych dużych makrocząsteczek w warunkach zbliżonych do fizjologicznych9-12. Próbka cryo-EM jest przygotowywana w wyniku błyskawicznego zamrażania roztworu próbki, osadzania makrocząsteczek w szklistym lodzie, który jest następnie obrazowany w temperaturach kriogenicznych, takich jak temperatury ciekłego azotu lub helu13. Zaletą Cryo-EM jest to, że próbki nie wykazują żadnych artefaktów i są prawie natywne w strukturze8-12. Cryo-EM ma swoje wady: i) wymagane jest zainstalowanie lub zakupienie dodatkowych urządzeń w celu ulepszenia standardowego instrumentu TEM do funkcji cryo-EM. Do urządzeń zalicza się: anty-concyminator, kriouchwyt, oprogramowanie w trybie niskiej dawki i kamerę CCD o niskiej dawce, chociaż ceny tych urządzeń są znacznie niższe niż cena samego instrumentu TEM; ii) operacja cryo-EM wymaga dłuższego czasu niż operacja NS. Badanie próbki cryo-EM często wymaga więcej czasu na przygotowanie próbek i obsługę przyrządu TEM niż w przypadku NS, ponieważ cryo-EM wymaga rozwiązania dodatkowych trudności, w tym: działania temperatury ciekłego azotu, ładowania próbki, dryftu obrazowania, gradientów temperatury, pracy modelu niskiej dawki, wrażliwości próbki na promieniowanie i ograniczeń dawkowania. Te dodatkowe kroki spowolnią szybkość pozyskiwania użytecznych danych w porównaniu z akwizycją danych NS, chociaż kilka obrazów krio-EM z pewnością może zostać uzyskanych w ciągu 1 godziny lub krócej przez ekspertów krio-EM z instrumentem przygotowanym ze zrównoważonym gradientem temperatury; iii) użytkownicy wymagają dodatkowego szkolenia, takiego jak obchodzenie się z ciekłym azotem, zamrażanie siatek krioelektromagnetycznych, obsługa niskich dawek, pomiar dawki, obsługa ładowania, dryfowanie i wiedza w zakresie przetwarzania obrazu; iv) brak powtarzalnego obrazowania dla tej samej próbki krio podczas różnych sesji TEM. Próbki Cryo-EM łatwo ulegają uszkodzeniu przez zanieczyszczenie lodem podczas załadunku i rozładunku próbek do/z przyrządu TEM. Uszkodzenie to jest szczególnie niepokojące, gdy próbki są trudne do wyizolowania/oczyszczenia14; v) małe białka (masa cząsteczkowa <200 kDa) są trudne do zobrazowania ze względu na niski kontrast; vi) niski kontrast i wysoki szum obrazów krio-EM zmniejszają wartość korelacji krzyżowej między obrazami, zmniejszając w ten sposób ogólną dokładność w określaniu orientacji, konformacji i klasyfikacji białek, szczególnie w przypadku białek, które są strukturalnie elastyczne i naturalnie ulegają wahaniom w roztworze4,5.

Barwienie ujemne (NS) jest stosunkowo "starożytną" i historyczną metodą, którą każde laboratorium, z dowolnym typem EM, może wykorzystać do zbadania struktury białka. Brenner i Horne po raz pierwszy opracowali koncepcję barwienia negatywnego pół wieku temu do badania wirusów15. NS uzyskuje się poprzez pokrycie próbki naładowanymi solami metali ciężkich. Koncepcja ta wywodzi się z mikroskopii świetlnej i praktyki osadzania bakterii w roztworze barwienia, zapewniając ciemność wokół próbek, umożliwiając wyższy kontrast obrazu podczas oglądania obrazu negatywowego16. Ponieważ jony metali ciężkich mają większą zdolność do rozpraszania elektronów w porównaniu z mniej gęstymi atomami w białkach17-20, a powlekanie barwnikiem metali ciężkich pozwala na większe ograniczenie dawki przy lepszym kontraście. Próbka NS może dostarczać obrazy o wysokim kontraście8 w celu łatwiejszego określenia orientacji cząstek i rekonstrukcji 3D niż obrazy z cryo-EM.

Tradycyjny NS, niestety, może wytwarzać artefakty wywołane przez interakcje barwnik-białko, takie jak ogólna agregacja, dysocjacja molekularna, spłaszczanie i układanie8,21,22. W przypadku białek związanych z lipidami, takich jak lipoproteiny16,23-30, powszechnym artefaktem są cząsteczki, które są ułożone w stos i upakowane razem w ruleaux (ryc. 1) 31-36. Wiele badań lipoprotein, takich jak niedenaturująca elektroforeza w żelu gradientowym poliakrylamidowym, badania krio-EM13,29,37-40, spektrometria mas39,41 i dane dyfrakcji rentgenowskiej pod małym kątem42 pokazują, że cząstki lipoprotein są izolowanymi cząstkami, a nie naturalnie ułożonymi razem, tworząc rouleaux 21,29,30,35,42-45. Obserwacja powstawania rouleaux przez konwencjonalny NS jest prawdopodobnie spowodowana dynamicznymi oddziaływaniami między lipoproteinami złożonymi z apolipoprotein (apo) i fosfolipidów, które są strukturalnie elastyczne w roztworze 13,29,30,46-49 i wrażliwością na standardowy protokół NS. Aby zidentyfikować ten artefakt, jako próbkę testową wykorzystano próbkę lipoproteiny (HDL) apolipoproteiny E4 (apoE4) palmitoilo-oleoilofosfatydylocholiny (POPC) o wysokiej gęstości jako próbki testowej i obrazy krio-EM dla wolnego od artefaktów standardu 29, przesiewając próbki NS przygotowane w szeregu warunków. Porównując rozmiary i kształty cząstek uzyskanych z NS i cryo-EM, stwierdzono, że specyficzny rodzaj odczynnika barwiącego i stężenie soli są dwoma kluczowymi parametrami powodującymi dobrze znane zjawiska rouleaux. W związku z tym zgłoszono zoptymalizowany protokół barwienia ujemnego (OpNS).

Przez OpNS, dobrze znane zjawisko rouleaux apoE4 HDL zostało wyeliminowane przez OpNS (Rysunek 2A). Analiza statystyczna wykazała, że OpNS daje bardzo podobne obrazy (mniej niż 5% odchylenia) pod względem wielkości i kształtu w porównaniu do tych z cryo-EM, jednak kontrast został wyeliminowany. Walidacje OpNS przeprowadzono poprzez zbadanie eliminacji artefaktu rouleaux prawie wszystkich klas lub podklas próbek lipoprotein 6,29,30,50,51, w tym apoA-I 7,8 nm (figura 2B), 8,4 nm (figura 2C), dyskoidalnie odtworzona HDL (ryc. 2D), sferyczny rHDL 9,3 nm (figura 2E), HDL ludzkiego osocza (figura 2F), apoA-I wolny od lipidów (rysunek 2G), HDL osocza (Figura 2H), lipoproteina o niskiej gęstości (LDL) (Figura 2I), lipoproteina o średniej gęstości (IDL) (Figura 2J), lipoproteina o bardzo niskiej gęstości (VLDL) (Figura 2K) i liposom POPC (Figura 2L) 30. Dodatkowe walidacje przeprowadzono poprzez obrazowanie małych i asymetrycznych białek, w tym białka przenoszącego estry cholesterolu cholesterolu o masie 53 kDa (CETP) (Figura 3A - C)6,29 i wysoce elastycznego przeciwciała IgG 160 kDa (Figura 4A i B)4,5,29,52 oraz dwóch dobrze znanych strukturalnie białek, GroEL i proteasom (Figura 2M i N). W celu wymagania dodatkowej walidacji od współpracowników, jesteśmy otwarci na wszelkie ślepe testy tej metody OpNS.

OpNS jako protokół o wysokiej przepustowości został również wykorzystany do badania mechanizmu białkowego poprzez badanie setek próbek małych białek, takich jak CETP, które wiązały się z różnymi białkami w warunkach serii (w tym CETP oddziałujące z 4 klasami lipoprotein, rekombinowanym HDL, HDL w osoczu, LDL i VLDL, z/bez 2 przeciwciał, H300 i N13, poniżej 9 czasów inkubacji, w tym 3 min, 20 min, 1 godz., 2 godz., 4 godz., 8 godz., 24 godz., 48 godz. i 72 godz., w 4 proporcjach molowych, tj. 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4 i 3 rozcieńczeniach, tj. 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml i 0,001 mg/ml, plus dodatkowe próbki kontrolne, w tym sam CETP, sam LDL, i sam VLDL, z potrójnymi testami powyższych eksperymentów przeprowadzonymi przez różne osoby)6,29. Obrazy CETP wykonane przez OpNS dostarczyły obrazów o wysokim kontraście z dość drobnymi szczegółami strukturalnymi; co pozwoliło nam z powodzeniem zrekonstruować mapę gęstości 3D małego białka CETP o masie 53 kDa (Rysunek 3D - F) poprzez rekonstrukcję pojedynczej cząstki. Co więcej, obrazy OpNS o wysokim kontraście dostarczają nam wystarczającego sygnału z pojedynczego białka (Figura 4A - C), co pozwoliło nam osiągnąć pośrednią rozdzielczość (~1,5 nm) pojedynczej (jeden obiekt, brak średniej) struktury 3D przeciwciała IgG za pomocą metody tomografii elektronowej pojedynczych cząstek (IPET) (Figura 4E - J)5. Szczegółowy opis strategii rekonstrukcji IPET, metodologii, procesów krok po kroku i analizy zmienności strukturalnej został wcześniej przedstawiony4. Film o procedurach rekonstrukcji przeciwciał IPET, w tym surowe obrazy i wyniki pośrednie, mapa gęstości 3D i dokowanie strukturalne, był również dostępny publicznie po umieszczeniu na YouTube5. Porównanie rekonstrukcji 3D z różnych pojedynczych cząstek przeciwciał może ujawnić dynamikę białek i zmiany konformacyjne podczas reakcji chemicznych4,5.

Biorąc pod uwagę, że ponad 50% białek ma masę cząsteczkową w zakresie od 40 do 200 kDa1,2, sukces w obrazowaniu tych małych białek dowodzi, że metoda OpNS jest użytecznym narzędziem do przesuwania konwencjonalnej granicy EM w kierunku małych i asymetrycznych oznaczeń strukturalnych i odkryć mechanizmów. W związku z tym szczegółowy protokół jest dostarczony jak poniżej.

Protokół

1. Przygotowanie świeżego roztworu do barwienia negatywnego o stężeniu 1% (w/v)

  1. Umieść 1 mg proszku mrówczanu uranylu (UF) w szklanej butelce zawierającej 100 ml wody dejonizowanej w ciemnym pomieszczeniu lub pudełku.
  2. Wymieszaj roztwór O/N w temperaturze RT w ciemnym pomieszczeniu/pudełku. Owiń butelkę z roztworem folią aluminiową, aby zapobiec wpadaniu światła do roztworu.
  3. Delikatnie przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 μm (wielkość porów) zamontowany na strzykawce o pojemności 5 ml. Przefiltrowany roztwór zebrano do kilku rurek Falcon pokrytych folią aluminiową. Strzykawka z filtrem musi być również owinięta folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
  4. Przefiltrować roztwór ponownie przez filtr 0,02 μm (wielkość porów) zamontowany na strzykawce o pojemności 1 ml. Przefiltrowany roztwór zebrano i podwielokrotniono do fiolek o pojemności 2 ml. Strzykawki i fiolki należy przykryć folią aluminiową przed użyciem.
  5. Zamrozić podwielokrotne fiolki za pomocą kleszczy o długich uchwytach, zanurzając fiolki w pojemniku wypełnionym ciekłym azotem natychmiast po przefiltrowaniu roztworu.
  6. Przenieść zamrożone fiolki do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu przechowywania i wykorzystania w przyszłości.

2. Przygotowanie stanowiska do barwienia negatywnego i stanowiska do inkubacji

  1. Rozmrozić fiolkę z 1% roztworem UF w łaźni wodnej ustawionej na suchą temperaturę (RT). Upewnij się, że folia aluminiowa pozostaje owinięta wokół fiolki, aby zapobiec ekspozycji na światło.
  2. Przefiltruj roztwór po całkowitym rozmrożeniu za pomocą owiniętej folią aluminiową strzykawki o pojemności 1 ml z filtrem 0,02 μm. Zbierz przefiltrowany roztwór do nowej fiolki owiniętej folią aluminiową i umieść go na lodzie w pojemniku na lód pokrytym nakrętką, czekając na użycie.
  3. Przygotuj płytki roztworu, naciskając palcem arkusz Parafilmu o długości ~ 8 cali na powierzchnię pustej płytki krystalizacyjnej białka. Wygeneruje rzędy okrągłych płytek o średnicy ~5 mm. Wykonaj 6 płytek w każdym rzędzie, umieść płytki Parafilm na powierzchni spłaszczonego lodu w pokrywie pojemnika na lód, jako stację roboczą do barwienia.
  4. Odpipetować ~35 μl wody dejonizowanej na każdą z trzech lewych płytek w każdym rzędzie, a pipetą ~35 μl przefiltrowanego roztworu UF na prawe trzy płytki w każdym rzędzie. Przykryj stację roboczą barwienia pokrywką, aby zapobiec ekspozycji na światło przed barwieniem białek.
  5. Przygotuj stację inkubacyjną z siatką EM, wypełniając puste pudełko do połowy lodem i przyklejając obok wieszaka, który można zamontować na podstawie nośnej. Umieść pęsetę do próbek w wieszaku, w którym końcówki pęsety znajdują się blisko powierzchni lodu. Zakryj do połowy końcówki pęsety na wysokości krawędzi pudełka. Idealnym pojemnikiem na lód do wykonania stacji inkubacyjnej jest użycie pustego pojemnika na końcówki do pipet.

3. Operacja OpNS

  1. Wyładowanie jarzeniowe cienkich siatek miedzianych EM o oczkach 300 pokrytych folią węglową przez 10 sekund.
  2. Podnieś siatkę za pomocą pęsety i zaczep pęsetę o wieszak, trzymając siatkę pod kątem 45° i 1 cal nad powierzchnią lodu wewnątrz stacji inkubacyjnej.
  3. Rozcieńczyć próbkę białka solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (DBPS) firmy Dulbecco przy końcowym stężeniu białka od ~0,01 do ~0,005 mg/ml. Natychmiast po rozcieńczeniu rozcieńczyć ~4 μl rozcieńczonej próbki po stronie węglowej siatki EM. (DPBS może zostać zamieniony na inny bufor, jeśli białko jest wrażliwe na DPBS)
  4. Inkubować próbkę na siatkach EM przez ~1 minutę w stacji inkubacji.
  5. Usuń nadmiar roztworu, szybko dotykając krawędzi siatki bibułą filtracyjną.
  6. Szybko przyłóż siatkę do pierwszej kropli (~35 μl) powierzchni czystej wody na powierzchni arkusza Parafilm zaraz po usunięciu nadmiaru roztworu z siatki EM. A następnie natychmiast usuń nadmiar wody za pomocą bibuły filtracyjnej.
  7. Powtórzyć krok 3.6 przez kolejne dwa razy, myjąc siatkę EM na pozostałych dwóch kropelkach wody na Parafilm (kroki 3.6 i 3.7 można pominąć, jeśli próbka jest bardzo wrażliwa na wodę).
  8. Umieść siatkę EM natychmiast na powierzchni pierwszej kropli roztworu UF zaraz po usunięciu nadmiaru wody z siatki EM. A następnie inkubować przez 10 sekund. Upewnij się, że procedury mycia wodą zostały zakończone w ciągu 3 sekund przed uniesieniem siatki na powierzchni roztworu UF. Im krótszy czas prania, tym lepsza będzie jakość.
  9. Wyczyść pęsetę, wbijając końcówki w bibułę filtracyjną ~2 - 3 razy.
  10. Usuń nadmiar roztworu z siatki, stykając krawędź siatki z bibułą filtracyjną, a następnie unieś siatkę na drugiej kropli UF.
  11. Kontynuuj powyżej kroku 3.10 na drugiej kropli.
  12. Spławić siatkę na trzeciej kropli roztworu UF i przykryć stację barwienia na ~1 min.
  13. Opcjonalny krok: szybko umyć ruszt na powierzchni wody, jak opisano w ppkt 3.6. Ten dodatkowy krok będzie korzystny dla próbek zawierających nadmiernie załadowane wolne cząstki złota lub plamy tła.
  14. Usuń nadmiar roztworu, dotykając bibuły filtracyjnej do całego tyłu siatki (po przeciwnej stronie węglowej). Wysuszyć siatkę pod delikatnym strumieniem azotu gazowego o temperaturze pokojowej zaraz po zaobserwowaniu, jak roztwór wchłania się do bibuły filtracyjnej.
  15. Umieść siatkę na arkuszu bibuły filtracyjnej wewnątrz szalki Petriego i częściowo przykryj naczynie nakrętką, aby wyschło przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. W przypadku niektórych próbek umieść siatkę w inkubatorze o temperaturze 40 °C i piecz przez godzinę.
  16. Przechowuj siatkę w skrzynce siatki EM do przyszłego badania EM.

4. Egzamin EM

  1. Prawidłowo wyrównaj TEM przed badaniem EM małych białek na siatce.
    1. Sprawdź rozdzielczość najwyższego widocznego pierścienia Thona, który jest widmem mocy amorficznej warstwy węglowej, aby określić, czy TEM został prawidłowo wyrównany. Ponieważ TEM jest współdzielony przez wielu różnych użytkowników, TEM często nie był odpowiednio wyrównany.
    2. Dokładnie sprawdź widmo mocy w obszarze folii węglowej próbki, aby dostosować warunki wyrównania maszyny. Najwyższe widoczne pierścienie Thon są lepsze niż rozdzielczość docelowa.
      UWAGA: Jako przykład prawidłowego ustawienia TEM filamentu LaB6 pracującego pod wysokim napięciem 120 kV, można zwizualizować ponad 20 pierścieni Thon, w których odpowiednia rozdzielczość może być lepsza niż 5,0 A. Ten pierścień Thona został osiągnięty przez transfer Fouriera amorficznej warstwy węgla zobrazowanej pod rozogniskowaniem ~1,6 μm i dawką 20,4 e-/Å2 (Ryc. 5).
      UWAGA: Obserwacja pierścienia Thon-ring o wysokiej rozdzielczości jest warunkiem koniecznym, ale niewystarczającym do prawidłowego ustawienia. Aby faktycznie uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości, ważnych jest również wiele innych parametrów, takich jak jakość próbki, uszkodzenia spowodowane promieniowaniem, ładowanie i dryfowanie, a także szybkość dawki oświetlenia.
  2. Ustaw ostrość z powrotem na ogniskową bliską Scherzerowi, aby zobrazować małe białka na idealnie wybarwionym obszarze.
  3. Wyszukaj "zachmurzony" obszar do zobrazowania. Idealnie zabarwiony obszar znajduje się zwykle w pobliżu krawędzi grubszego obszaru plamy, który wygląda jak "mętny" obszar na siatce, ponieważ grubość plamy zwykle nie jest równomiernie rozłożona na siatce pokrytej węglem (rysunek 6). Zazwyczaj małe powiększenie (<100x) miało pomóc w znalezieniu tych mętnych obszarów przed zbliżeniem w celu zobrazowania.

Wyniki

Zastosowania OpNS obejmują badania strukturalne i morfologiczne różnych gatunków lipoprotein, takich jak: nowotwórcze rekombinowane HDL (rHDL), sferyczne rekombinowane HDL, HDL z osocza, LDL, IDL i VLDL (Rysunek 2)30; a także małe białka, takie jak CETP o masie 53 kDa (jedno z najmniejszych białek pomyślnie zobrazowanych za pomocą EM) (Rysunek 3)6 i przeciwciała IgG o masie 160 kDa (jedno z najbardziej dynamicznych i heterogennych białek) (Rysunek 4)4,5,29,52, a nawet wolną od lipidów apolipoproteinę A-1 o masie 28 kDa (Rysunek 2L) oraz GroEL i proteasomy (Rysunek 2M i N).

Innymi przykładami OpNS jako metody wysokoprzepustowej są badania oddziaływań białko-białko w celu odkrycia mechanizmów białkowych, takich jak w przypadku 53 kDa CETP. Jak opisano we wstępie, badano sposób, w jaki CETP oddziałuje z różnymi podklasami lipoprotein, analizując ponad 400 preparatów EM6. O ile nam wiadomo, nie odnotowano wcześniej przypadku badania cryo-EM, które obejmowałoby przesiewowe badanie prawie stu różnych warunków.

OpNS może rozszerzyć granice EM w celu badania małych i asymetrycznych struktur 3D białek, a nawet umożliwić uzyskanie struktury 3D z pojedynczego, indywidualnego białka (bez uśredniania). Na przykład przeciwciało IgG jest cząsteczką o masie 160 kDa o bardzo elastycznej strukturze, w której uzyskanie rekonstrukcji 3D o średniej rozdzielczości jest trudne. Metody OpNS użyto do obrazowania pojedynczego przeciwciała IgG z serii kątów nachylenia (Rysunek 4E i H). Obrazy białek o stosunkowo wysokiej rozdzielczości i wysokim kontraście uzyskane za pomocą OpNS pozwoliły na pomyślną rekonstrukcję pojedynczego białka za pomocą tomografii elektronowej pojedynczych cząsteczek (IPET) (Rysunek 4E - J)4,5. W rekonstrukcji 3D IPET4 serie nachyleń 2D docelowego przeciwciała były stopniowo dopasowywane do ich obliczonego centrum globalnego poprzez następujące po sobie iteracyjne rekonstrukcje, aby uzyskać gęstość 3D o rozdzielczości ~14,1 Å (Rysunek 4F i G)4. Stosując to samo podejście, zrekonstruowano pojedynczy kompleks przeciwciało-peptyd, co pozwoliło odkryć indukowaną przez peptyd zmianę konformacyjną domeny wewnętrznej pojedynczej cząsteczki przeciwciała (Rysunek 4I i J, rozdzielczość ~16,6 Å)4,5. Porównując rekonstrukcje 3D różnych pojedynczych cząsteczek, analiza strukturalna może pozwolić na ujawnienie fluktuacji termodynamicznych białek, a nawet uchwycenie „migawkowych” etapów pośrednich reakcji chemicznej4,5,29,53,54.

Podsumowując, białka o masie cząsteczkowej od 40 kDa do 200 kDa stanowią wyzwanie dla standardowych badań strukturalnych i rekonstrukcji metodą EM. Biorąc pod uwagę, że ponad 50% białek ma masę cząsteczkową w zakresie 40 – 200 kDa1,2, przedstawiamy metodę OpNS jako solidne i wysokoprzepływowe narzędzie pozwalające przesunąć konwencjonalne granice EM w kierunku wyznaczania struktur małych i asymetrycznych, a nawet prowadzenia badań mechanistycznych.

Obserwacja morfologii lipoprotein za pomocą mikroskopii elektronowej; ApoE4 rHDL, ApoA-I rHDL, ApoB LDL, POPC.
Rysunek 1. Artefakt typu rouleaux lipoprotein w konwencjonalnej mikroskopii elektronowej (EM) z barwieniem negatywnym (NS). Mikrografie elektronowe (panele górne) i wybrane cząsteczki (panele dolne) przedstawiają różne lipoproteiny tworzące rouleaux po barwieniu NS kwasem fosfotungstowym (PTA) przy zastosowaniu standardowej procedury mieszania. (A) Rekonstytuowana HDL (rHDL) z ApoE4, (B) dyskoidalna rHDL o rozmiarze 9,6 nm zawierająca apoA-I, (C) plazmatyczna LDL zawierająca apoB, (D) liposomy POPC niezawierające apolipoprotein. Paski skali: 50 nm. Rozmiar okna: A i C, 20 nm; B, 30 nm. Praca ta została pierwotnie opublikowana w The Journal of Lipid Research29,30. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie cząsteczek lipoprotein w mikroskopii elektronowej; schemat apoE4 rHDL, HDL, LDL, IDL, VLDL.
Rysunek 2. Struktura białek w mikroskopii elektronowej (EM) z zastosowaniem zoptymalizowanego barwienia negatywowego (OpNS). Mikrografie elektronowe przedstawiają różne lipoprotein i liposomy bez artefaktów w postaci stosów (rouleaux) otrzymane metodą OpNS. (A) rHDL zawierające apoE4; (B) rHDL 7,8 nm; (C) rHDL 8,4 nm; (D) rHDL 9,6 nm; (E) sferyczne rHDL 9,3 nm; (F) α-HDL z ludzkiej osocza; (G) HDL z osocza; (H) LDL z ludzkiej osocza; (I) IDL z ludzkiej osocza; (J) VLDL z ludzkiej osocza; (K) liposom POPC; (L) apoA-I wolne od lipidów. Dodatkowa weryfikacja została przeprowadzona z użyciem próbek (M) GroEL oraz (N) proteasomu. Mikrografie (panele górne) i wybrane cząsteczki (panele dolne). Paski skali: 50 nm. Wielkość okna: A - D, 20 nm; E i F, 25 nm; G, 20 nm; H, 25 nm; I, 50 nm; J i K, 100 nm; L, 80 nm. Z wyjątkiem apoA-I wolnego od lipidów, GroEL i proteasomu, badanie to zostało pierwotnie opublikowane w Journal of Lipid Research29,30. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schematy analizy Cryo-EM modeli struktury białek i wizualizacja, szczegółowo przedstawiające dopasowania strukturalne.
Rysunek 3. Mikrografie elektronowe OpNS białka CETP. (A) Mikrograf z widokiem ogólnym z cząsteczkami CETP w kształcie banana (przerywane okręgi). (B) Wybrane surowe cząsteczki w oknach. (C) Trzy obrazy pojedynczych surowych cząsteczek CETP wyraźnie pokazujące większy, cięższy i obszerniejszy koniec globularny wraz z drugim mniejszym, lżejszym i węższym końcem (panel lewy), widok z góry pokazujący podobne regiony terminalne z mniejszą ogólną krzywizną (panel środkowy) oraz widok końcowy wzdłuż długiej osi CETP (panel prawy). (D) Nałożenie struktury krystalicznej (PDB: 2OBD) na te surowe obrazy cząsteczek CETP; widoczna jest dobra zgodność zarówno pod względem kształtu strukturalnego, jak i wielkości domen, co pokazuje, że orientacja może być zdefiniowana niemal bezpośrednio, nawet bez komputerowego wspomagania (panele odpowiadające punktowi (C)). (E) Bezreferencyjne średnie klas 2D (proces ab initio obliczania podobieństwa (obliczenia korelacji wzajemnej) tych losowo zorientowanych cząsteczek; cząsteczki wykazujące wysokie podobieństwo zostały pogrupowane, wyrównane, a następnie uśrednione w celu redukcji szumu tła i poprawy kontrastu obrazu cząsteczek. Bezreferencyjne średnie klas 2D zostały obliczone za pomocą oprogramowania refine2D.py w pakiecie EMAN, w którym do uzyskania średniej klasy nie wykorzystano żadnego stworzonego przez człowieka modelu początkowego. Bezreferencyjne średnie klas mogą służyć jako niezależna metoda walidacji rekonstrukcji 3D z rekonstrukcji pojedynczych cząsteczek). (F) Wybrane bezreferencyjne średnie klas 2D pokazują większy koniec dystalny w porównaniu do drugiego. (G) Porównanie nałożonej struktury krystalicznej (PDB: 2OBD) z bezreferencyjnymi średnimi; obrazy nałożone pokazują niemal idealną zgodność między strukturą krystaliczną a bezreferencyjną średnią klasy, zarówno pod względem kształtu struktury, jak i wielkości domen (panel dolny). (F) Mapa gęstości 3D białka CETP o rozdzielczości 13 Å została zrekonstruowana z 8 879 cząsteczek zobrazowanych metodą OpNS i rekonstrukcją pojedynczych cząsteczek (panel górny) oraz sztywne dopasowanie struktury krystalicznej do tej rekonstrukcji pojedynczej cząsteczki (panel dolny). Szczegółowe informacje dotyczące rekonstrukcji pojedynczych cząsteczek, w tym wstępne przetwarzanie obrazów, model początkowy, procedury rafinacji, rozkład kątów i korelację powłoki Fouriera (FSC), zostały opublikowane w sekcji metodycznej i informacjach uzupełniających oryginalnego artykułu (H) Końcowe porównanie rekonstrukcji pojedynczej cząsteczki (panel górny) i dodatkowe porównanie dopasowania PDB (panel dolny) 6. Paski skali: A, 50 nm; B - D, 10 nm; F, 3 nm. Niektóre z tych rycin zostały wcześniej opublikowane w Nature Chemical Biology6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza struktury białek; OpNS-EM, obrazowanie rentgenowskie, rekonstrukcja 3D, wykres wizualizacji molekularnej.
Rycina 4. Obrazy OpNS i rekonstrukcje cząsteczek przeciwciała ludzkiego IgG1. (A) Przegląd obrazów OpNS przeciwciała ludzkiego IgG1. Cząsteczki zaznaczone białymi okręgami wyraźnie wykazują obecność 3 poddomen. (B) Wybrane surowe obrazy o wysokiej rozdzielczości pięciu pojedynczych, niekonjugowanych cząsteczek przeciwciał oraz (C) odpowiadające im obrazy z redukcją szumów, uzyskane poprzez ręczne zmniejszenie szumu wokół krawędzi surowych cząsteczek (bez ingerencji w gęstość wewnątrz cząsteczek) w celu ułatwienia wizualizacji. (D) Struktura krystaliczna (wpis PDB 1IGT) przeciwciała IgG1, zorientowana w sposób zbliżony do obrazów EM. Porównanie odpowiadających sobie obrazów wykazuje wiele cech wspólnych między obrazem EM a strukturą krystaliczną, w tym pozycje i kształty domen. (E) Procedura krok po kroku rekonstrukcji 3D ab initio pojedynczego egzemplarza przeciwciała IgG1 (bez uśredniania, jeden indywidualny obiekt) przy użyciu metody tomografii elektronowej pojedynczych cząsteczek (IPET). (F) Końcowa rekonstrukcja 3D pojedynczej cząsteczki przeciwciała przy rozdzielczości 14,1 Å wykazała trzy domeny w kształcie pączka, tworzące kształt litery „Y”. (G) Dokowanie struktur krystalicznych domen do odpowiadających im map gęstości domen oraz ręczne dopasowanie pętli pomiędzy domenami. (H) Procedura krok po kroku rekonstrukcji 3D pojedynczego kompleksu IgG-peptyd (bez uśredniania, jeden indywidualny obiekt) metodą IPET. (I) Końcowa rekonstrukcja 3D kompleksu IgG-peptyd wyświetlona przy rozdzielczości 16,6 Å wykazała trzy domeny w kształcie pręta, tworzące kształt litery „Y”. (J) Odpowiednio, dokowanie struktury krystalicznej poszczególnych domen przeciwciała IgG (wpis PDB: 1IGT) do poszczególnych gęstości w kształcie pręta wykazało słabe dopasowanie do struktur krystalicznych domen, co sugeruje zmianę konformacyjną wewnątrz domeny po konjugacji z peptydem. Szczegółowa procedura, analiza rozdzielczości i statystyki zostały opisane w oryginalnej pracy 5. Paski skali: A, 50 nm; B - D, 10 nm. Praca ta została pierwotnie opublikowana w PLoS ONE4 i Scientific Reports5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Pierścienie dyfrakcji elektronów z odpowiadającym im wykresem intensywności CTF w funkcji częstotliwości; analiza mikroskopowa.
Rysunek 5. Widmo mocy filmu z amorficznego węgla obrazowanego przy defokusie 1.6 µm za pomocą TEM Zeiss Libra 120 LaB6. Obrazowanie wysokiej rozdzielczości wymaga dostarczenia wystarczających dowodów potwierdzających prawidłowe ustawienie mikroskopu elektronowego (EM) oraz jego zdolność do obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Analiza widma mocy pobliskiego obszaru węglowego na siatce jest wydajną metodą sprawdzania warunków koherencji wiązki przed rozpoczęciem akwizycji danych. Transformata Fouriera obrazu obszaru amorficznego węgla ukazuje związaną z instrumentem funkcję przenoszenia kontrastu (CTF), tzw. pierścienie Thona. Prawidłowe ustawienie i koherencja mogą być odzwierciedlone przez liczbę widocznych pierścieni Thona oraz najwyższą rozdzielczość widocznych pierścieni Thona przy stosunkowo wysokim defokusie. Jako przykład niemal prawidłowego ustawienia TEM wyposażonego w włókno LaB6, z filmu węglowego obrazowanego przy defokusie 1.6 µm i dawce 20.4 e-/Å2 można uzyskać ponad ~20 pierścieni Thona (~5 Å). Pierścienie Thona uzyskane z podstawowego TEM są podobne do tych z zaawansowanego TEM, takiego jak TEM z emiterem polowym (FEG) pracujący w warunkach prawidłowego ustawienia. Praca ta została pierwotnie opublikowana w Scientific Reports5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie mikroskopowe materiałów przy powiększeniach 80x, 4Kx, 80Kx, ukazujące szczegóły powierzchni i strukturę.
Rycina 6. Przykładowe mikrografie „idealnych” obszarów do obrazowania OpNS. Jako przykłady do zademonstrowania idealnych warunków OpNS dla obrazowania wykorzystano trzy próbki białek: (A) GroEL, (B) proteasom, (C) sferyczny HDL. Ponieważ barwniki są nierównomiernie rozłożone w preparacie, obraz próbki przy niskim powiększeniu zazwyczaj wydaje się „zachmurzony” (panel skrajnie lewy). Idealne obszary do obrazowania znajdują się zazwyczaj na granicach tych „chmur”. Przykład stopniowego przybliżania jednego „zachmurzonego” regionu barwnika (panel środkowy lewy) przedstawia obrazy przy wysokim powiększeniu, charakteryzujące się wysoką rozdzielczością i wysokim kontrastem cząsteczek (panel środkowy prawy). Wybrane obrazy cząsteczek ukazują szczegóły struktury białek (panel skrajnie prawy). Paski skali: 30nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat barwienia siatki do mikroskopii elektronowej; obejmuje układ inkubacji, pęsetę, proces odsączania.
Rycina 7. Schemat procedur OpNS. (A) Stacja inkubacji siatek EM, prosta stacja do inkubacji roztworu próbki na siatce poddanej wyładowaniom koronowym (glow-discharge). (B) Stanowisko barwienia, zaprojektowane w celu utrzymania kropli wody do płukania oraz kropli barwnika nad łożem lodowym, przy jednoczesnym zminimalizowaniu ekspozycji barwnika na światło. (C) Przegląd procedury barwienia, ilustrujący: kierunek odsączania, 3-krotne płukanie wodą, 3-krotną ekspozycję na barwnik UF, inkubację barwiącą z odwróconą siatką próbki na kroplach barwnika oraz końcowe odsączanie próbki od strony tylnej, aby zapewnić cienką warstwę roztworu barwiącego próbkę przed suszeniem strumieniem azotu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cryo-EM: filtrowanie dolnoprzepustowe, cryo-PS, obrazy z maską, struktury krystaliczne do badania białek.
Rysunek 8. Obrazy wysokiej-rozdzielczości małego białka CETP o masie 53kDa uzyskane za pomocą zmodyfikowanej metody OpNS, kriobarwienia pozytywnego (cryo-PS). Pięć wybranych surowych obrazów cząsteczek CETP o wysokiej rozdzielczości z okrągłą maską miękką (z odwróconym kontrastem) oraz surowe obrazy cząsteczek z maską kształtu cząsteczki (z ręcznie zredukowanym szumem wokół krawędzi surowych obrazów cząsteczek, ale bez modyfikacji gęstości wewnątrz cząsteczek) w celu łatwiejszej wizualizacji. Porównanie pełnoatomowej i wstążkowej struktury krystalicznej z zamaskowanymi surowymi cząsteczkami wyrównanymi do podobnych orientacji każdej cząsteczki względem obrazów EM. Szczegóły wysokiej rozdzielczości w obszarach surowego obrazu wykazują pewne podobieństwo do struktury krystalicznej, choć nie wszystkie cechy struktury krystalicznej można rozdzielić z danych surowych. Co znaczące, surowe obrazy wykazują podobieństwo w obu końcach terminalnych, gdzie w obrazach z ręcznie zredukowanym szumem widoczne są małe okrągłe otwory (trójkąty); ponadto nici w regionach C-terminalnych w obrazach cząsteczek uzupełniają arkusze β struktury krystalicznej (strzałki), a wreszcie wystające pętle w regionie C-terminalnym CETP są zbliżone do tych w strukturze krystalicznej (rombry). (A) Pięć wybranych surowych obrazów cząsteczek CETP o wysokiej rozdzielczości z okrągłą maską miękką (z odwróconym kontrastem). (B) Filtrowanie dolnoprzepustowe do 10Å. (C) Wyższe filtrowanie dolnoprzepustowe do 20Å. (D) Obrazy z ręcznie zredukowanym szumem i maską. (E) Porównanie struktury krystalicznej za pomocą modelu wstążkowego. (F) Porównanie struktury krystalicznej za pomocą reprezentacji pełnoatomowej. Pasek skali: 5nm. Część tej pracy została opublikowana w Nature Chemical Biology6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza TEM miceli kwasu fosfotungstowego przy różnych stężeniach soli; obrazowanie naukowe.
Rycina 9. Mikrografie elektronowe liposomów wykazujące tworzenie się struktur typu rouleau przy zastosowaniu konwencjonalnego protokołu NS (barwienie PTA) przy różnym zasoleniu. (A) Wysokie zasolenie (~0.5 M NaCl). (B) Średnie zasolenie (~0.25 M NaCl). (C) Niskie zasolenie (~0.1 M NaCl). (D) Czysta woda. Przedstawiono mikrografie (górny panel) oraz wybrane cząsteczki w oknach powiększenia (dolny panel). Paski skali: 100 nm. Rozmiar okna: 80 nm. Praca ta została pierwotnie opublikowana w The Journal of Lipid Research30. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

W porównaniu z konwencjonalnymi technikami NS, OpNS może zapobiegać artefaktom rouleaux (ryc. 1 i 9), zapewniając wiarygodne i rozsądne szczegóły strukturalne małych białek o wysokiej rozdzielczości (~1 nm) (ryc. 2). W porównaniu z cryo-EM, OpNS zapewnia metodę o wysokiej przepustowości i może badać szeroką gamę białek i interakcji białko-białko6. Jednak OpNS nadal ma swoje wady. W porównaniu z konwencjonalnym NS, OpNS pociąga za sobą: i) bardziej skomplikowane etapy przygotowania próbki; ii) przy użyciu substancji promieniotwórczej, UF; iii) utrzymanie świeżości plamy ze względu na krótszą siłę działania plamy UF ze względu na jej wrażliwość na światło; iv) w celu zapobieżenia wytrącaniu się osadów, roztwór UF musi być przechowywany w temperaturze -80 °C i wymaga rozmrożenia przed użyciem; v) i wreszcie wszystkie UF muszą być traktowane jako odpady niebezpieczne. W porównaniu do cryo-EM, OpNS zapewnia obrazy o stosunkowo niższej rozdzielczości i nie ma gwarancji na jakikolwiek jeszcze nie odkryty artefakt w przyszłości.

Działanie NS Wpływ proceduralny na tworzenie lipoprotein rouleaux

Protokoły NS przygotowania białek do badania16,29-36,55 można podzielić na trzy główne grupy metod50: mieszanie55, kropla po kropli16 i procedury płukania29. i) Protokół mieszania wymaga wstępnego wymieszania próbki barwienia i białka w określonym stosunku, a następnie nałożenia zmieszanego roztworu na folię węglową pokrytą na siatce, ostatecznie usuwając nadmiar roztworu bibułą filtracyjną przed wysuszeniem na powietrzu w celu badania EM55. ii) Protokół kropla po kropli polega na nałożeniu kropli próbki (~ 4 μl) bezpośrednio na siatkę EM pokrytą węglem, pozostawiając na ~ 1 minutę, a następnie usuwając nadmiar roztworu próbki przed nałożeniem kropli (~ 4 μl) roztworu barwie po tej samej stronie siatki. Po ~1 min inkubacji usunąć nadmiar plamy poprzez kontakt z czystą bibułą filtracyjną, ostatecznie poddając do suszenia na powietrzu16,56-58. iii) Protokół płukania (rysunek 7) wymagający nałożenia roztworu próbki na siatkę EM pokrytą węglem przez 1 minutę, a następnie trzykrotne przemycie wodą dejonizowaną zaraz po usunięciu nadmiaru roztworu za każdym razem za pomocą bibuły filtracyjnej3,29,30. Protokół OpNS został zmodyfikowany w stosunku do tej procedury mycia.

Rodzaje barwienia NS i wpływ na tworzenie lipoprotein rouleaux

W NS silniejsze rozpraszanie elektronów spowodowane barwieniem metalami ciężkimi zapewnia kontrast z białkami17-20,59. Próbki NS mogą dodatkowo cierpieć na większe dawki promieniowania i wzmacniać cechy białka poprzez ostrzejszy kontrast ujemny8,9,60. Barwniki metali ciężkich można podzielić na: anionowe, w tym kwas fosfowolframowy (PTA)16, wolframian metyloaminy14 i wolfracian krzemu61; i kationowe, takie jak octan uranylu (UA)62, UF3,29,30 i azotan uranylu (UN)63. Jednym z najczęściej stosowanych anionowych barwników NS jest PTA33,64-67. PTA to kwas heteropoli, który jest zwykle stosowany o pH około 7,0 - 7,5. PTA może być również stosowany do barwienia dodatniego3,16,68. Ujemne ładunki PTA mogą pośredniczyć w oddziaływaniach elektrostatycznych z nienasyconymi lipidami dodatnio naładowanymi grupami głowy, takimi jak POPC, zarówno na powierzchniach lipoprotein, jak i liposomów. PTA może powodować tworzenie się ruleaux poprzez tę interakcję 29,30 nawet przy regularnym zasoleniu buforu29,30 (ryc. 1). Barwienia uranylowe, takie jak UA, UF i UN, są alternatywnym wyborem dla kationowych barwników metali ciężkich, a w szczególności UA jest często stosowany do NS różnych próbek biologicznych62,69,70. Eksperymenty wykazały, że UF nie powoduje ruleaux lipoprotein zawierających nienasycone lipidy kwasów tłuszczowych, takich jak POPC. Jednak UF może nadal indukować tworzenie rouleaux na lipoproteinach, które zawierają nasycone lipidy kwasów tłuszczowych, takie jak dimyrystoylfosfatydylocholina (DMPC) i 1-heksadekanoilo-2-oktadekanoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (PSPC). Szczegółowy mechanizm tej interakcji nie jest znany. UA/UF/UN mogą pracować przy niższych wartościach pH w zakresie od 3,5 do 4,6. Tak niższe wartości pH mogą nie być odpowiednie dla niektórych makrocząsteczek biologicznych, które są wrażliwe na pH14,71. Co ciekawe, UA/UF może naprawić strukturę białka w ciągu kilku milisekund za pomocą nieznanego mechanizmu72. W przeciwieństwie do PTA, UA/UF jest bardziej podobny do soli niż kwasu.

UF podobno może zapewnić lepsze wyniki niż UA73, w którym plamy UF i UN mają mniejsze rozmiary ziaren niż UA (UF: 0,3 nm, UN: ~0,5 nm)3,74. Interesującym przykładem są drugorzędowe szczegóły przypominające strukturę małego białka (53 kDa CETP) bezpośrednio wizualizowane na podstawie surowych mikrofotografii, gdy UF został użyty jako odczynnik barwienia ujemnego, postępując zgodnie z wcześniej opisaną metodą barwienia krio-dodatniego (cryo-PS) (Figura 8)6. W cryo-PS wybarwiona próbka została błyskawicznie zamrożona poprzez zastosowanie procedury przygotowania próbki cryo-EM zamiast procedury suszenia w protokole OpNS, co może spowodować wtórne zapadnięcie się struktury. Cryo-PS to metoda obrazowania małych białek o wysokim kontraście i wysokiej rozdzielczości75. Ponieważ obrazy cryo-PS mają odwrócony kontrast w porównaniu z tymi z raportowanego protokołu cryo-NS 22, ale mają stały kontrast obrazu z tymi z konwencjonalnych obrazów cryo-EM, dlatego nazwano ją metodą cryo-PS. Obrazy cryo-PS pokazują, że odczynnik barwiący, mrówczan uranylu, wnika w powierzchnię molekularną, kwestionując konwencjonalny pogląd, że barwienie może uwidocznić tylko zewnętrzną strukturę powierzchni. Mechanizm przenikania mrówczanu uranylu do powierzchni molekularnej jest nieznany. Jedną z możliwości jest to, że kation Uranyl wiąże dostępne białkowe grupy karboksylowe, a zatem otaczający lód szklisty ma mniejszą gęstość niż barwienie białka i grup Uranyl, działając w ten sposób jako barwienie dodatnie. Metoda cryo-PS jest podobna do metody wielokrotnej wymiany izomorficznej (MIR), która była powszechnym podejściem do rozwiązania problemu fazowego w krystalografii rentgenowskiej 76-78. W MIR próbki kryształów są nasączane roztworem ciężkich atomów, w tym uranu, aby uzyskać formę izomorficzną do formy natywnej. Dodanie ciężkiego atomu czasami nie wpływa na tworzenie się kryształów ani wymiary komórki elementarnej, ale dostarcza dodatkowych informacji na temat określania struktury krystalicznej76-78. Korzystając z małego ziarna UF, cryo-PS może zapewnić obraz pojedynczego białka o wysokim kontraście i wysokiej rozdzielczości, co jest ważne dla badań struktury białka, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że prawie wszystkie białka są naturalnie dynamiczne i niejednorodne w roztworze. W celu walidacji tej metody cryo-PS otwieramy się na dowolny ślepy test z pola EM.

Wpływ stężenia soli na tworzenie rouleaux w lipoproteinach

Używając tradycyjnego odczynnika barwiącego PTA ujemnego, obserwowane tworzenie się rouleaux jest bardziej prawdopodobne związane z interakcjami lipidów niż z interakcją z białkami. Obrazując próbki pęcherzyków liposomowych POPC przygotowanych przy znacznym zasoleniu (0,5 M NaCl), umiarkowanym zasoleniu (0,25 M NaCl), stosunkowo słabym zasoleniu (0,1 M NaCl) i czystej wodzie (Figura 9), mikrofotografie elektronowe pokazują, że tworzenie rouleaux było skorelowane ze stężeniem soli (Figura 9A - D). Stosując UF jako ujemny odczynnik barwiący, nie zaobserwowano rouleaux w próbce pęcherzyków liposomowych POPC30 (ryc. 2L), co sugeruje, że procedura mycia w celu szybkiego zmniejszenia stężenia soli tuż przed barwieniem jest koniecznym, ale nie wystarczającym samodzielnie krokiem do zapobiegania rouleaux w próbkach związanych z POPC.

Obrazowanie małego białka TEM wymaga warunku ogniskowego zbliżonego do scherzera.

Udane obrazowanie TEM małych białek w wyższej rozdzielczości wymaga dwóch krytycznych warunków: prawidłowego ustawienia wiązki i warunków akwizycji ostrości zbliżonej do Scherzera. i) Prawidłowe ustawienie wiązki można ocenić na podstawie liczby widocznych pierścieni Thona (widmo mocy) na transferze Fouriera obrazu filmu węglowego uzyskanego przy stosunkowo dużym rozogniskowaniu. Im lepszy stan wyrównania belki, tym więcej pierścieni Thon można zwizualizować i zmierzyć. ii) Uzyskanie obrazu w ognisku zbliżonym do Scherzera jest kolejnym krytycznym warunkiem. Tradycyjna standardowa strategia obrazowania próbek biologicznych zazwyczaj wykorzystuje wysokie rozogniskowanie (1 - 2 μm, a nawet więcej), co może zwiększyć kontrast obrazu próbki biologicznej 79. Strategia ta znacznie różni się od typowej strategii obrazowania struktury rozdzielczości atomowej twardych materiałów, która często wykorzystuje ognisko bliskie Scherzerowi (rozogniskowanie ~50 nm). Chociaż większe rozogniskowanie mogłoby wzmocnić kontrast próbki biologicznej, sygnały o wysokiej rozdzielczości zostałyby częściowo wyeliminowane. W rezultacie, udział sygnału o wysokiej rozdzielczości byłby niższy w warunkach obrazowania z wyższym rozmyciem. Powodem jest to, że obraz TEM jest splotem struktury próbki i instrumentu CTF. CTF jest krzywą oscylacyjną w stosunku do częstotliwości, w której krzywa często oscylowała, przecinając zerową amplitudę przy wysokiej częstotliwości. Za każdym razem, gdy CTF przekroczy zero, próbkowany sygnał strukturalny o tej określonej częstotliwości zostanie wyeliminowany (zero razy dowolna liczba będzie równa zero). Wyeliminowany sygnał o tej częstotliwości nigdy nie może być odzyskany przez żaden algorytm korekcji CTF (zero podzielone przez zero może być dowolną liczbą losową zamiast oryginalnego sygnału strukturalnego). Przy obrazowaniu z wyższym rozogniskowaniem CTF będzie oscylował znacznie bardziej agresywnie, dzięki czemu CTF częściej przekracza zerową amplitudę, w wyniku czego sygnały strukturalne o większej liczbie określonych częstotliwości zostaną wyeliminowane. Im więcej sygnałów zostanie wyeliminowanych, tym mniejszy będzie współudział w obrazie. Warto zauważyć, że współudział obrazu nie może być odzyskany ani skorygowany przez żadną korektę CTF. Jednak pewna liczba nieukończonych obrazów uzyskanych przy różnych rozogniskowaniach może być wykorzystana do wypełnienia ich luk względem siebie, aby uzyskać kompletny sygnał strukturalny struktury próbki za pomocą metody uśredniania, w której można osiągnąć nawet rozdzielczość atomową 9-12 .

Metoda uśredniania jest skutecznym podejściem do uzyskania struktury niektórych wysoce symetrycznych białek i strukturalnie powiązanych sztywnych białek. Jednak nadal pozostaje wyzwaniem w badaniach strukturalnych małych i asymetrycznych białek, zwłaszcza w przypadku dynamiki strukturalnej i elastycznych białek, takich jak przeciwciała i HDL. Uśrednianie opiera się na założeniu, że cząstki białka są identyczne pod względem struktury i konformacji, ale różnią się orientacją, jednak wiadomo, że wiele białek ulega wahaniom termodynamicznym w roztworze. Stosując metodę uśredniania bez wcześniejszej znajomości fluktuacji termodynamicznych białek, uśredniona struktura może często powodować brakujące domeny 10,80 lub lokalną zmienność rozdzielczości 81 w rekonstrukcjach krio-EM.

Sukces w osiągnięciu rekonstrukcji 3D małego białka, takiego jak CETP 53 kDa, oraz struktury 3D pojedynczego białka, takiego jak przeciwciało IgG1 160 kDa, jest korzystny dzięki zastosowaniu warunków obrazowania ogniskowego zbliżonego do Scherzera w odpowiednich warunkach wyrównania. Chociaż kontrast obrazu wydaje się niski na obrazach o ostrości zbliżonej do Scherzera, kontrast można łatwo poprawić, po prostu stosując filtrowanie dolnoprzepustowe w celu zmniejszenia szumów o wysokiej częstotliwości w tle. Uważamy, że obrazy ostrości zbliżone do Scherzera przenoszą maksymalne sygnały strukturalne i mogą zwiększyć dokładność wyrównania cząstek oraz zwiększyć wydajność w rekonstrukcji 3D pojedynczych cząstek i rekonstrukcji tomografii elektronowej pojedynczych cząstek.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Mickey'emu Yangowi za edycję i komentarze, a Dr. Lei Zhang i Bo Peng za pomoc. Prace te były wspierane przez Biuro Nauki, Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych (kontrakt nr. DE-AC02-05CH11231), Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi Narodowych Instytutów Zdrowia (nr R01HL115153) oraz Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia (nr R01GM104427).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Barwienie: Mrówczan uranyluSPI Dział Dostaw Sondy Strukturalnej, Inc.02545-AAhttp://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml
Strzykawka: 1 ml NORM-JECTVWR89174-491https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491
Filtr strzykawkowy: 0,2 μ m VWR28145-487https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487
Filtr strzykawkowy: 0,02 μ m filtr (Anotop 10)Whatman6809-1002http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSIGMA-AldrichD8537http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en®ion=US
Parafilm: 4 cale x 125 stópVWR470152-246https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A
Siatka TEM pokryta folią węglową: 300 oczekPacific Grid-TechCu-300CNhttp://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon
Siatka TEM pokryta folią węglową: 200 oczekEMS (Electro Microscopy Sciences)CF200-Cuhttp://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx
Pęseta: Pęseta Dumont L5EMS (Electro Microscopy Sciences)72882-Dhttp://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5
Milli-Q Advantage A10 System oczyszczania wody ultraczystejEMD MilliporeMilli-Q Advantage A10http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117
Bibuła filtracyjna: koła klasy 1Whatman1001-090http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx
FoliaDowolny rodzaj
Końcówki filtrów: Końcówki filtrów aerozolowych o niskiej retencji do 10 i mikro; L PipetyVWR89174-520https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520
[nagłówek]
Jednostka wyładowcza jarzeniowaTed Pella91000http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm
Końcówki filtrów: Końcówki filtrów aerozolowych o niskiej retencji do 40 i mikro; L PipetyVWR89174-524https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524
Końcówki filtrów: VWR Signature 200 µ L Końcówki do pipetVWR37001-528https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528
PipetPipetmanF161201 i F167300http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx
aluminiowa

Bibliografia

  1. Lipman, D. J., Souvorov, A., Koonin, E. V., Panchenko, A. R., Tatusova, T. A. The relationship of protein conservation and sequence length. BMC Evol Biol. 2, (2002).
  2. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).
  3. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  4. Zhang, L., Ren, G. IPET and FETR: experimental approach for studying molecular structure dynamics by cryo-electron tomography of a single-molecule structure. PLoS ONE. 7, e30249(2012).
  5. Tong, H., et al. Peptide-conjugation induced conformational changes in human IgG1 observed by optimized negative-staining and individual-particle electron tomography. Sci Rep. 3, 1089(2013).
  6. Zhang, L., et al. Structural basis of transfer between lipoproteins by cholesteryl ester transfer protein. Nat Chem Biol. 8, 342-349 (2012).
  7. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q Rev Biophys. 37, 3-13 (2004).
  8. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc Res Tech. 74, 642-663 (2011).
  9. Liu, H., et al. Atomic structure of human adenovirus by cryo-EM reveals interactions among protein networks. Science. 329, 1038-1043 (2010).
  10. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
  11. Baker, M. L., et al. Validated near-atomic resolution structure of bacteriophage epsilon15 derived from cryo-EM and modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 12301-12306 (2013).
  12. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, e00461(2013).
  13. Ren, G., et al. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1059-1064 (2010).
  14. Bremer, A., Henn, C., Engel, A., Baumeister, W., Aebi, U. Has negative staining still a place in biomacromolecular electron microscopy. Ultramicroscopy. 46, 85-111 (1992).
  15. Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
  16. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods in enzymology. 128, 442-457 (1986).
  17. Colliex, C., et al. International Tables For Crystallography. Prince, E., et al. , Kluwer Academic Publishers. Vol. C 259-429 (2006).
  18. Ren, G., Zuo, J. M., Peng, L. -M. Accurate Measurements of Crystal Structure Factors Using a FEG Electron Microscope Using Digital Micrographs. Micron. 28, 459-467 (1997).
  19. Peng, L. M., Ren, G., Dudarev, S. L., Whelan, M. J. Robust parameterization of elastic and absorptive electron atomic scattering factors. Acta Crystallographica Section A. 52, 257-276 (1996).
  20. Peng, L. M., Ren, G., Dudarev, S. L., Whelan, M. J. Debye-Waller factors and absorptive scattering factors of elemental crystals. Acta Crystallographica Section A. 52, 456-470 (1996).
  21. Melchior, V., Hollingshead, C. J., Cahoon, M. E. Stacking in Lipid Vesicle Tubulin Mixtures Is an Artifact of Negative Staining. Journal of Cell Biology. 86, 881-884 (1980).
  22. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42, 117-131 (2011).
  23. Allan, V., Vale, R. Movement of Membrane Tubules Along Microtubules In - Evidence for Specialized Sites of Motor Attachment. Journal of Cell Science. 107, 1885-1897 (1994).
  24. Catte, A., et al. Novel changes in discoidal high density lipoprotein morphology: a molecular dynamics study. Biophys J. 90, 4345-4360 (2006).
  25. Forester, G. P., Tall, A. R., Bisgaier, C. L., Glickman, R. M. Rat intestine secretes spherical high density lipoproteins. J Biol Chem. 258, 5938-5943 (1983).
  26. Gantz, D. L., Walsh, M. T., Small, D. M. Morphology of sodium deoxycholate-solubilized apolipoprotein B-100 using negative stain and vitreous ice electron microscopy. Journal of Lipid Research. 41, 1464-1472 (2000).
  27. Pentikainen, M. O., Lehtonen, E. M., Kovanen, P. T. Aggregation and fusion of modified low density lipoprotein. J Lipid Res. 37, 2638-2649 (1996).
  28. Tall, A. R., Green, P. H., Glickman, R. M., Riley, J. W. Metabolic fate of chylomicron phospholipids and apoproteins in the rat. J Clin Invest. 64, 977-989 (1979).
  29. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51, 1228-1236 (2010).
  30. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52, 175-184 (2011).
  31. Gong, E. L., et al. Discoidal complexes containing apolipoprotein E and their transformation by lecithin-cholesterol acyltransferase. Biochim Biophys Acta. 1006, 317-328 (1989).
  32. Schneeweis, L. A., Koppaka, V., Lund-Katz, S., Phillips, M. C., Axelsen, P. H. Structural analysis of lipoprotein E particles. Biochemistry. 44, 12525-12534 (2005).
  33. Raussens, V., et al. Orientation and mode of lipid-binding interaction of human apolipoprotein E C-terminal domain. Biochem J. 387, 747-754 (2005).
  34. Li, X., Kan, H. Y., Lavrentiadou, S., Krieger, M., Zannis, V. Reconstituted discoidal ApoE-phospholipid particles are ligands for the scavenger receptor BI. The amino-terminal 1-165 domain of ApoE suffices for receptor binding. J Biol Chem. 277, 21149-21157 (2002).
  35. Innerarity, T. L., Pitas, R. E., Mahley, R. W. Binding of arginine-rich (E) apoprotein after recombination with phospholipid vesicles to the low density lipoprotein receptors of fibroblasts. J Biol Chem. 254, 4186-4190 (1979).
  36. Lu, B., Morrow, J. A., Weisgraber, K. H. Conformational reorganization of the four-helix bundle of human apolipoprotein E in binding to phospholipid. J Biol Chem. 275, 20775-20781 (2000).
  37. van Antwerpen, R., La Belle, M., Navratilova, E., Krauss, R. M. Structural heterogeneity of apoB-containing serum lipoproteins visualized using cryo-electron microscopy. J Lipid Res. 40, 1827-1836 (1999).
  38. van Antwerpen, R., et al. Cryo-electron microscopy of low density lipoprotein and reconstituted discoidal high density lipoprotein: imaging of the apolipoprotein moiety. J Lipid Res. 38, 659-669 (1997).
  39. Silva, R. A., et al. Structure of apolipoprotein A-I in spherical high density lipoproteins of different sizes. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12176-12181 (2008).
  40. van Antwerpen, R. Preferred orientations of LDL in vitreous ice indicate a discoid shape of the lipoprotein particle. Arch Biochem Biophys. 432, 122-127 (2004).
  41. Davidson, W. S., Silva, R. A. Apolipoprotein structural organization in high density lipoproteins: belts, bundles, hinges and hairpins. Curr Opin Lipidol. 16, 295-300 (2005).
  42. Peters-Libeu, C. A., Newhouse, Y., Hatters, D. M., Weisgraber, K. H. Model of biologically active apolipoprotein E bound to dipalmitoylphosphatidylcholine. J Biol Chem. 281, 1073-1079 (2006).
  43. Peng, D. C., Song, C., Reardon, C. A., Liao, S. S., Getz, G. S. Lipoproteins produced by ApoE-/- astrocytes infected with adenovirus expressing human ApoE. Journal of Neurochemistry. 86, 1391-1402 (2003).
  44. Peters-Libeu, C. A., Newhouse, Y., Hall, S. C., Witkowska, H. E., Weisgraber, K. H. Apolipoprotein E*dipalmitoylphosphatidylcholine particles are ellipsoidal in solution. J Lipid Res. 48, 1035-1044 (2007).
  45. Jones, M. K., et al. Assessment of the validity of the double superhelix model for reconstituted high density lipoproteins: a combined computational-experimental approach. J Biol Chem. 285, 41161-41171 (2010).
  46. Carnemolla, R., et al. The specific amino acid sequence between helices 7 and 8 influences the binding specificity of human apolipoprotein A-I for high density lipoprotein (HDL) subclasses: a potential for HDL preferential generation. J Biol Chem. 283, 15779-15788 (2008).
  47. Sivashanmugam, A., et al. Structural basis of human high-density lipoprotein formation and assembly at sub nanometer resolution. Methods Cell Biol. 90, 327-364 (2008).
  48. Cavigiolio, G., et al. The interplay between size, morphology, stability, and functionality of high-density lipoprotein subclasses. Biochemistry. 47, 4770-4779 (2008).
  49. Chen, B., et al. Apolipoprotein AI tertiary structures determine stability and phospholipid-binding activity of discoidal high-density lipoprotein particles of different sizes. Protein Sci. 18, 921-935 (2009).
  50. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830, 2150-2159 (2013).
  51. Tong, H. M., Zhang, L., Huang, L. Q., Ren, G. Optimized negative-staining protocol for electron microscopy study of lipoprotein structure. Progress in Biochemistry and Biophysics. 39, 972-978, doi:Doi 10.3724/Sp.J.1206.2012.00224. 39, 972-978 (2012).
  52. Zhang, L., Kaspar, A., Woodnutt, G., Ren, G. Monitoring the Structural Changes of Conjugated Antibodies by High-Resolution Electron Microscopy and Individual-Particle Electron Tomography. Biophysical Journal. 98, 440-441 (2010).
  53. Ren, G., Zhang, L. Asymmetric Small Protein Structure Determination by Individual Particle Electron Tomography. Biophysical journal. 102, 394a(2012).
  54. Zhang, L., Ren, G. Structural Determination of Heterogeneous Protein by Individual-Particle Electron Tomography - Combination of Electron Tomography and Local Refinement Reconstruction Method for High-Resolution Structural Determination of Each Individual Protein Particle. Biophysical journal. 98, 441a(2010).
  55. Forte, T., Norum, K. R., Glomset, J. A., Nichols, A. V. Plasma lipoproteins in familial lecithin: cholesterol acyltransferase deficiency: structure of low and high density lipoproteins as revealed by elctron microscopy. J Clin Invest. 50, 1141-1148 (1971).
  56. Fang, Y., Gursky, O., Atkinson, D. Lipid-binding studies of human apolipoprotein A-I and its terminally truncated mutants. Biochemistry. 42, 13260-13268 (2003).
  57. Gursky, O., Ranjana,, Gantz, D. L. Complex of human apolipoprotein C-1 with phospholipid: thermodynamic or kinetic stability. Biochemistry. 41, 7373-7384 (2002).
  58. Jayaraman, S., Gantz, D. L., Gursky, O. Effects of protein oxidation on the structure and stability of model discoidal high-density lipoproteins. Biochemistry. 47, 3875-3882 (2008).
  59. Ren, G., Peng, L. M. The Analytic Doyle-Turner Representation of High Energy Electron Absorptive Structure Factors. Acta Physica Sinica. 45, 1344-1349 (1996).
  60. Ren, G., Reddy, V. S., Cheng, A., Melnyk, P., Mitra, A. K. Visualization of a water-selective pore by electron crystallography in vitreous ice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1398-1403 (2001).
  61. Camejo, G., Suarez, Z. M., Munoz, V. The apo-lipoproteins of human plasma high density lipoprotein: a study of their lipid binding capacity and interaction with lipid monolayers. Biochim Biophys Acta. 218, 155-166 (1970).
  62. Kondo, A., Muranaka, Y., Ohta, I., Kanno, T. Dynamic reaction in a homogeneous HDL-cholesterol assay visualized by electron microscopy. Clin Chem. 45, 1974-1980 (1999).
  63. Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. J Pharm Sci. 97, 4425-4432 (2008).
  64. Clay, M. A., Pyle, D. H., Rye, K. A., Barter, P. J. Formation of spherical, reconstituted high density lipoproteins containing both apolipoproteins A-I and A-II is mediated by lecithin : cholesterol acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 275, 9019-9025 (2000).
  65. Desilva, H. V., Masoliva, J., Taylor, J. M., Mahley, R. W. Identification of Apolipoprotein B-100 Low-Density Lipoproteins, Apolipoprotein B-48 Remnants, and Apolipoprotein E-Rich High-Density-Lipoproteins in the Mouse. Journal of Lipid Research. 35, 1297-1310 (1994).
  66. Fagan, A. M., et al. Unique lipoproteins secreted by primary astrocytes from wild type, apoE (-/-), and human apoE transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274, 30001-30007 (1999).
  67. Musliner, T. A., et al. Dissociation of high density lipoprotein precursors from apolipoprotein B-containing lipoproteins in the presence of unesterified fatty acids and a source of apolipoprotein A-I. J Lipid Res. 32, 917-933 (1991).
  68. Silverman, L., Glick, D. The reactivity and staining of tissue proteins with phosphotungstic acid. J Cell Biol. 40, 761-767 (1969).
  69. Hamilton, R. L., Williams, M. C., Fielding, C. J., Havel, R. J. Discoidal bilayer structure of nascent high density lipoproteins from perfused rat liver. J Clin Invest. 58, 667-680 (1976).
  70. Pollard, H., Scanu, A. M., Taylor, E. W. On the geometrical arrangement of the protein subunits of human serum low-density lipoprotein: evidence for a dodecahedral model. Proc Natl Acad Sci U S A. 64, 304-310 (1969).
  71. Frasca, J. M., Parks, V. R. A Routine Technique for Double-Staining Ultrathin Sections Using Uranyl and Lead Salts. J Cell Biol. 25, 157-161 (1965).
  72. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. Journal of structural biology. 141, 43-52 (2003).
  73. Knight, D. P. Negative staining of rat tail tendon collagen fibrils with uranyl formate. Tissue Cell. 7, 651-654 (1975).
  74. Dash, S., et al. Temperature programmed decomposition of uranyl nitrate hexahydrate. Journal of Nuclear Materials. 264, 271-282 (1999).
  75. Zhang, L., et al. Structural basis of transfer between lipoproteins by cholesteryl ester transfer protein. Nature Chemical Biology. 8, 342-349 (2012).
  76. Kartha, G. Combination of multiple isomorphous replacement and anomalous dispersion data for protein structure determination. 3. Refinement of heavy atom positions by the least-squares method. Acta crystallographica. 19, 883-885 (1965).
  77. Kartha, G., Parthasarathy, R. Combination of Multiple Isomorphous Replacement and Anomalous Dispersion Data for Protein Structure Determination. I. Determination of Heavy-Atom Positions in Protein Derivatives. Acta crystallographica. 18, 745-749 (1965).
  78. Kartha, G., Parthasarathy, R. Combination of Multiple Isomorphous Replacement and Anomalous Dispersion Data for Protein Structure Determination. Ii. Correlation of the Heavy-Atom Positions in Different Isomorphous Protein Crystals. Acta crystallographica. 18, 749-753 (1965).
  79. Taylor, K. A., Glaeser, R. M. Electron microscopy of frozen hydrated biological specimens. Journal of ultrastructure research. 55, 448-456 (1976).
  80. Correia, I., et al. The structure of dual-variable-domain immunoglobulin molecules alone and bound to antigen. mAbs. 5, (2013).
  81. Cardone, G., Heymann, J. B., Steven, A. C. One number does not fit all: mapping local variations in resolution in cryo-EM reconstructions. Journal of structural biology. 184, 226-236 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zoptymalizowany protokobrazowanie TEMprzygotowanie siatekprocedura barwieniap ukanie wodsuszenie azotem
Zoptymalizowane barwienie ujemne: wysokoprzepustowy protokół do badania małej i asymetrycznej struktury białka za pomocą mikroskopii elektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.