Artykuł metodologiczny

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

18.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51088

⸱

7 stycznia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Henry Ford Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Streszczenie

Glejaki, najczęstsza i najbardziej agresywna forma gwiaździaka, są oporne na terapię i molekularnie niejednorodne. Zdolność do tworzenia kultur komórkowych, które zachowują profil genomowy nowotworów rodzicielskich, do stosowania w specyficznych dla pacjenta modelach in vitro i in vivo, może zrewolucjonizować przedkliniczny rozwój nowych metod leczenia glejaka dostosowanych do charakterystyki molekularnej każdego nowotworu.

Zaczynając od świeżych guzów gwiaździaka wysokiego stopnia zdysocjowanych na pojedyncze komórki, używamy testu neurosfery jako metody wzbogacania komórek prezentujących fenotyp rakowych komórek macierzystych, w tym ekspresję markerów nerwowych komórek macierzystych, długoterminową samoodnawialność in vitro i zdolność do tworzenia ortotopowych guzów ksenoprzeszczepu. Metoda ta została już wcześniej zaproponowana i jest obecnie stosowana przez kilku badaczy. Opierając się na naszym doświadczeniu w dysocjacji i hodowli 125 próbek glejaka, doszliśmy do szczegółowego protokołu, który tutaj prezentujemy, odpowiedniego do rutynowego hodowli neurosfery gwiaździaków o wysokim stopniu złośliwości i ekspansji komórek rakotwórczych na dużą skalę do badań przedklinicznych. Informujemy o skuteczności udanych hodowli długoterminowych przy użyciu tego protokołu i sugerujemy niedrogie alternatywy dla hodowli zdysocjowanych komórek glejaka, które nie rosną jako neurosfery. Opisujemy również szczegółowo protokół zachowania architektury 3D neurosfer dla immunohistochemii. Hodowle komórkowe wzbogacone w CSC, zdolne do generowania ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów, które zachowują sygnatury molekularne i heterogeniczność GBM, stają się coraz bardziej popularne w badaniach nad biologią GBM i w lepszym projektowaniu badań przedklinicznych potencjalnych terapii.

Wprowadzenie

Glejak wielopostaciowy (GBM), gwiaździak IV stopnia WHO, jest najbardziej rozpowszechnionym i agresywnym pierwotnym guzem mózgu. Różnorodne fenotypy rozwojowe są przyjmowane przez komórki nowotworowe GBM, w tym komórki wykazujące cechy "rakowych komórek macierzystych" (CSC), takie jak ekspresja markerów nerwowych komórek macierzystych (NSC), długotrwała samoodnowa i potencjał do powstania bardziej zróżnicowanych komórek wyrażających markery astrocytarne i tworzących większość guza1-3. Chociaż nadal potrzebne są wyjaśnienia dotyczące tożsamości molekularnej CSC i implikacji klinicznych, niniejsza praca koncentruje się na operacyjnej definicji CSC: długoterminowej samoodnowie in vitro oraz zdolności do różnicowania i reprodukcji pierwotnego guza po implantacji ortotopowej u gryzoni z obniżoną odpornością.

Komórki glejaka są hodowane od dziesięcioleci w tradycyjnej pożywce zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i kilka komercyjnie dostępnych linii komórkowych GBM o wysokiej pasażowości jest rakotwórczych u gryzoni z obniżoną odpornością, ale istnieje znaczna rozbieżność genomowa i molekularna w stosunku do pierwotnego nowotworu4, ograniczając ich wykorzystanie jako modeli istotnych klinicznie. Niedawno w GBM2 zidentyfikowano komórki o fenotypie macierzystym/progenitorowym reagującym na EGF i bFGF. Następnie zdysocjowane próbki guza GBM hodowano w pożywce wolnej od surowicy3, pierwotnie opracowanej do selekcji i ekspansji nerwowych komórek macierzystych z mózgu dorosłych ssaków5. Te warunki hodowli utrudniają wzrost większości nienowotworowych i bardziej zróżnicowanych populacji komórek nowotworowych, jednocześnie sprzyjając wzrostowi komórek macierzystych i progenitorowych jako pływających wielokomórkowych sferoid lub neurosfer3, naśladując zachowanie dorosłych nerwowych komórek macierzystych ssaków5. Kompleksowe porównanie pierwotnych komórek GBM hodowanych w pożywce neurosfery uzupełnionej czynnikami wzrostu (NMGF) lub w tradycyjnej pożywce wzrostowej uzupełnionej 10% FBS, ujawniło, że neurosfery GBM były rakotwórcze, wykazywały potencjał różnicowania wieloliniowego i zachowały genotyp pierwotnego guza, w przeciwieństwie do 10% kultur FBS, które nie były rakotwórcze w niskich pasażach i znacznie różniły się od pierwotnych guzów w późnych pasażachRozdział 4.

Izolacja CSC od zdysocjowanych guzów GBM poprzez sortowanie komórek na podstawie ekspresji domniemanego markera CSC CD133 również została zaproponowana 6,7, ale dalsze prace wykazały, że fenotyp CSC nie jest definitywnie związany z ekspresją takich markerów8-10, zmniejszając początkowy entuzjazm dla tej strategii, podczas gdy nowe markery są nadal testowane10. Dotychczasowa niedostępność zwalidowanego zestawu markerów definiujących CSC, wraz z celem amplifikacji tych komórek na dużą skalę do badań przedklinicznych, sprawia, że stosowanie sortowania komórek jest niepraktyczne w rutynowych hodowlach wzbogaconych CSC. Komórki GBM wyselekcjonowane przez zdolność do wzrostu jako neurosfery w NMGF niezmiennie wyrażają markery nerwowych komórek macierzystych. Zaobserwowaliśmy, że Sox2 i nestyna są wszechobecne w kulturach neurosfery, podczas gdy białko CD133 jest obecne w podzbiorze neurosfer GBM (dane niepublikowane i odniesienie11).

Kilka laboratoriów poszukuje kultur neurosfery z guzów glejaka, stosując to samo ogólne podejście dysocjacji enzymatycznej i hodowli w pożywce bez surowicy uzupełnionej czynnikami wzrostu 3,4,11-14, podczas gdy inni koledzy zgłaszali próby długoterminowego hodowania kultur neurosfery z próbek GBM bez powodzenia. Przedstawiona tutaj ogólna metoda dysocjacji enzymatycznej i hodowli neurosfery glejaków o wysokim stopniu złośliwości jest podobna do tej, która została przedstawiona w powyższych publikacjach. Zoptymalizowaliśmy protokół w oparciu o nasze doświadczenie w dysocjacji i hodowli ponad 100 GBM próbek. Skuteczność uzyskiwania długoterminowych kultur neurosfery ze świeżych próbek GBM przy zastosowaniu przedstawionego tutaj protokołu wynosi ponad 40%, podobnie jak w przypadku kilku raportów pokazujących dane dotyczące wydajności 3,15, co prowadzi do zbadania alternatywnych protokołów, takich jak hodowla komórek w sposób ciągły lub okresowy w pożywce wolnej od surowicy w obecności EGF i bFGF jako monowarstw na powierzchniach pokrytych białkiem ECM16, Rozdział 17. Hodowle neurosfery są nadal najbardziej zwalidowanym i coraz bardziej popularnym podejściem do zachowania cech molekularnych guzów GBM i potencjału rakotwórczego 3,4,11-14, dlatego nasze podejście polega na próbie najpierw kultur neurosferycznych, jednocześnie testując alternatywne metody hodowli komórek GBM, które nie tworzą długotrwałych, samoodnawiających się neurosfer (Figura 1), w celu zwiększenia reprezentacji nowotworów GBM, które można wykorzystać w modelach zwierzęcych. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli neurosfer z GBM. W przypadku komórek, które nie tworzą neurosfer, pokazujemy prostą modyfikację pożywki wzrostowej, jako pierwszą próbę hodowli komórek rakotwórczych z nieneurosfery tworzących GBM, z obiecującymi wynikami i nadal poddawanymi obszernej walidacji.

Protokół

1. Zawiesina pojedynczej komórki ze świeżej próbki glejaka chirurgicznego do hodowli neurosfery

  1. Za pisemną zgodą pacjentów i zgodnie z wytycznymi instytucji, natychmiast po operacji resekcji glejaka o wysokim stopniu złośliwości należy pobrać próbki guza do hodowli komórek.
  2. Potwierdź rozpoznanie próbki guza za pomocą histopatologii. Natychmiast przetransportuj próbkę z sali operacyjnej do okapu do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, w celu przetworzenia w ciągu 1 godziny od zabiegu.
    UWAGA: W przypadku operacji w odległym miejscu, pokrój próbkę guza na mniejsze fragmenty i umieść w probówce zawierającej DMEM/F12 (przechowywać na lodzie). Guz może być leczony kilka godzin po zabiegu.
  3. Zaczynając od 200-500 mg tkanki (optymalnie), zmiel próbkę guza za pomocą ostrza skalpela i przenieś do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pożywki DMEM/F12 bez surowicy. Wymieszaj, odwracając kilka razy, pozwól kawałkom guza osiadać grawitacyjnie, usuń pożywkę i powtórz w razie potrzeby.
  4. Przygotuj roztwór enzymatycznego do dysocjacji tkanek i zatrzymaj roztwór na świeżo.
    1. Enzymatyczny roztwór dysocjacyjny tkanek: 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA, 2,5 ml Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) bez wapnia i magnezu, 2,5 ml roztworu podstawowego kolagenazy IV (2,000 U/ml w HBSS z wapniem i magnezem).
    2. Roztwór zatrzymujący: 5 ml roztworu inhibitora trypsyny, 5 ml DMEM/F12, 2 μl 5,000 U/ml DNAzy I (wykonane z HBSS bez wapnia i magnezu).
  5. Usuń pożywkę i dodaj roztwór do dysocjacji enzymatycznej tkanki do zmielonej próbki guza, używając 2 ml na każde 0,5 g tkanki. Delikatnie wymieszaj, odwracając.
  6. Inkubować tkankę w roztworze w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych na zmianę przez 30 minut.
  7. Rozprowadzić pipetą o pojemności 2 ml i przerwać wytrawianie lub wrócić do inkubatora na kolejne 15-30 minut inkubacji, w zależności od poziomu wytrawienia.
  8. Przerwać trawienie, dodając 2 objętości roztworu Stop i rozcierać mechanicznie za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml.
  9. Odfiltrować niestrawiony materiał przez sitko o wielkości 40 μm. Granulować komórki w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 3x w 10 ml DMEM/F12.
  10. Zawiesić końcowy osad komórkowy w 5 ml DMEM/F12.
  11. Zawiesinę komórkową należy powoli nakładać na 5 ml Lympholyte-M i osadzać w roztworze 1 300 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Przenieść warstwę interfejsu zawierającą komórki jądrzaste do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml DMEM/F12.
  13. Granulować komórki w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz pranie z DMEM/F12 jeszcze 2x.
  14. Kriokonserwuj powstałe pojedyncze komórki do dalszego wykorzystania poprzez ponowne zawieszenie osadu w pożywce do zamrażania komórek regeneracyjnych, porcjowanie do kriowialiów, powolne zamrażanie i przechowywanie w ciekłym azocie.
  15. Aby wyhodować, ponownie zawieś komórki w pożywce neurosferycznej uzupełnionej czynnikami wzrostu (NMGF) i płytka o stosunkowo niskiej gęstości (<1 x 105 komórek/ml) w zwykłej kolbie do hodowli tkankowej T25 w standardowych warunkach, 5% CO2, 37 °C, wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych (Figura 1A).
    1. Przygotuj NMGF, korzystając z następującego przepisu
      Dla 500 ml DMEM/F12
      Roztwór podstawowygłośnośćStężenie końcowe
      Suplement N2 (10x)Pojemność 5 ml 1x
      250 mg/ml roztwór podstawowy BSA Pojemność 1 ml0,5 mg/ml
      10 mg/ml odczynnika gentamycynyPojemność 1,25 ml25 μg/ml
      100x antybiotyk/antybiotykPojemność 2,5 ml0,5 razy
      100 mg/ml bFGFPojemność 0,1 ml20 ng/ml
      100 mg/ml EGFPojemność 0,1 ml20 ng/ml
  16. Przenieś neurosfery, które tworzą się w ciągu 1-3 tygodni (ryc. 1B-E) do świeżych kolb, aby oddzielić je od przyczepionych komórek i szczątków. Wykonuj częściową wymianę nośnika co 3-4 dni.
    UWAGA: W przypadku dysocjacji ortotopowego guza ksenoprzeszczepu przy użyciu powyższego protokołu, kroki 1.11-1.13 można pominąć.

2. Utrzymanie hodowli neurosfery glejaka i dalsze zastosowania

  1. Dysocjacja: Monitoruj kultury neurosfery i wykonuj częściowe zmiany pożywki co 3-4 dni. Gdy większość neurosfer wielokomórkowych w kolbie osiągnie średnicę 100 μm, dysocjuje do zawiesiny pojedynczej komórki:
    1. Przenieść pożywkę zawierającą neurosfery do probówki o pojemności 15 ml, osadzać grawitacyjnie neurosfery przez około 5 minut, usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml DPBS bez wapnia i magnezu.
    2. Mieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, gdy komórki osadzają się grawitacyjnie.
    3. Usuń 7-8 ml DPBS, a następnie mechanicznie rozdziel neurosfery za pomocą wstępnie zwilżonej pipety serologicznej.
    4. Zdecydowane komórki osadzać w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Pasażowanie: Zawiesić zdysocjowane komórki (krok 2.1.) w NMGF i podzielić na niezbędną liczbę kolb (1:3) i inkubować w standardowych warunkach. Uformują się wtórne neurosfery, które następnie powinny zostać rozdzielone w celu uformowania sfer trzeciorzędowych.
  3. Ocena długoterminowej samoodnowy: Powtarzaj procedurę dysocjacji, aż kultura neurosfery osiągnie co najmniej 10 pasaży, co odpowiada minimum 2 miesiącom w hodowli.
  4. Zamrażanie: Aby kriokonserwować neurosfery, oddziel neurosfery (krok 2.1.) i ponownie zawieś osad komórkowy w pożywce do zamrażania komórek regeneracyjnych, podwielokrotności w kriowialach, powoli zamrażaj i przechowuj w ciekłym azocie.
    1. Aby wyhodować komórki neurosfery z zamrożonego bulionu: rozmrozić komórki w temperaturze 37 °C i natychmiast przenieść do 15 ml probówki zawierającej 10 ml DMEM/F12. Delikatnie wymieszać probówkę, a następnie wirować komórki w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie umyć osad komórkowy i ponownie zawiesić komórki w NMGF i przenieść do kolby do hodowli tkankowej T25.
  5. Zawiesina komórek do implantu wewnątrzczaszkowego u myszy z obniżoną odpornością:
    1. Rozdziel neurosfery (krok 2.1.) i ponownie zawieś osad komórkowy w DPBS wolnym od wapnia i magnezu. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru i wykluczenia błękitu trypanowego.
    2. Oblicz liczbę komórek potrzebnych do implantacji, zwykle 3 x 105 komórek / mysz, przenieś żądaną liczbę komórek do fiolki i opluj komórki w rozmiarze 1,000 x g.
    3. Zawiesić osad komórkowy w objętości odpowiedniej dla implantu (5 μl/mysz), delikatnie stukając w probówkę mikrowirówki. Umieść zawiesinę komórek na lodzie i zużyj w ciągu 2 godzin.

3. Alternatywny protokół hodowli nowotworowych komórek glejaka wielopostaciowego (dla przypadków, gdy hodowla neurosfery nie powiedzie się)

  1. Uzupełnij pożywkę NMGF płodową surowicą bydlęcą do końcowego stężenia 2% FBS/NMGF.
  2. Zaczynając od komórek w hodowli NMGF: Zbierz żywe komórki z kolby NMGF (ryc. 1F), ponownie zawieś w 2% FBS/NMGF i płytkuj w stosunkowo niskiej gęstości (<1 x 105 komórek/ml) w zwykłej kolbie do hodowli tkankowej T25 i poprowadź hodowlę w standardowych warunkach, 5% CO2, 37 °C, nawilżony inkubator do hodowli tkanek (ryc. 1G).
  3. Zaczynając od zamrożonych, nigdy nie hodowanych komórek (krok 1.14.): Rozmrozić komórki, przemyć w pożywce bez surowicy i płytce w 2% FBS/NMGF i posażać zgodnie z opisem w kroku 3.2. Hodowla w NMGF przez 3 dni przed przeniesieniem żywych komórek do 2% FBS/NMGF jest alternatywą dla wstępnej selekcji komórek zróżnicowanych.

4. Analiza morfologiczna i molekularna neurosfer za pomocą immunohistochemii

  1. Hoduj neurosfery, aż większość pływających sferoid wielokomórkowych osiągnie średnicę 100 μm.
  2. Wyjąć kolby hodowlane z inkubatora i natychmiast zdegranulować neurosfery, usunąć pożywkę i dodać 10 ml DPBS bez naruszania osadu. Usunąć DPBS, ponownie zawiesić w 10% neutralnej buforowanej formalinie i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Sferoidy zagnieździć w granulkach, ponownie zawiesić w 30% etanolu i inkubować przez 30-45 minut.
  4. Zastąp 30% etanol 50% etanolem, inkubuj przez 15 minut i zastąp świeżym 50% etanolem, inkubuj kolejne 30 minut.
  5. Powtórzyć (krok 4.4.) z 70% etanolem.
  6. Zastąp 95% etanolem dwie zmiany po 10-20 minut każda i powtórz z absolutnym etanolem, aż sferoidy staną się jasnobiałe i skondensowane.
  7. Zrób mały stożek z bibuły filtracyjnej z bibuły do soczewek i umieść go w małym lejku w zlewce. Zwilż papier do soczewek alkoholem bezustannym.
  8. Lekko poluzuj granulkę świeżym 100% etanolem, odlej nadmiar etanolu i przelej sferoidy przez papierowy stożek soczewki, upewniając się, że idą do końcówki stożka. Przepłucz probówkę dodatkowym absolutnym etanolem i przelej pozostałe sferoidy przez papierowy stożek soczewki.
  9. Wyjmij papierowy stożek z lejka i ostrożnie przesuń sferoidy na dno stożka. Złóż papier w kwadrat i upewnij się, że sferoidy są tak bezpiecznie zamknięte, jak to możliwe.
  10. Przenieś zapakowane neurosfery do kasety i przenieś do automatycznego procesora tkankowego.
  11. Zaprogramuj automatyczny procesor tkanek w następujący sposób: etanol absolutny, 10 min, ksylen, 15 min (2x), parafina, 10 min (4x).
  12. Wyjmij kasetę z procesora i umieść ją na rozgrzanej części systemu zatapiania parafiny . Upewnij się, że cała powierzchnia jest wolna od fragmentów, kurzu lub innych zanieczyszczeń i odsysaj całą parafinę z kleszczy do podgrzewania studzienek. Podgrzej czyste kleszcze bez parafiny i dodaj niewielką ilość parafiny do rozgrzanej formy bazowej.
  13. Otwórz kasetę, wyjmij opakowanie i umieść je na rozgrzanej części systemu zatapiania. Ostrożnie otwórz papierowy stożek, aż sferoidy będą widoczne. Zbierz jak najwięcej materiału za pomocą wstępnie podgrzanych kleszczy i przenieś do płynnej parafiny w formie podstawowej.
  14. Powtórz w razie potrzeby, aby pobrać jak najwięcej sferoid. Delikatnie zeskrob bibułkę rozgrzaną, czystą żyletką, która została przetarta etanolem, aby zebrać wszelkie resztki sferoid bez wkładania papieru do bloku.
  15. Ostrożnie rozbij wszelkie sferoidalne grudki ciepłymi kleszczami. Odsuń sferoidy od rogów do jednolitej warstwy środkowej. Przenieś formę podstawy do obszaru chłodzenia, aby zabezpieczyć sferoidy na miejscu, dodaj kasetę, powoli napełnij parafiną i dokładnie schłodź.
  16. Blok parafinowy neurosfery może być stosowany do prawidłowego cięcia i immunohistochemii.

Wyniki

Zastosowaliśmy opisany powyżej protokół do dysocjacji i hodowli 125 świeżych próbek chirurgicznych glejaka wielopostaciowego (Rycina 1), w tym 88 guzów nowo zdiagnozowanych i 37 guzów nawrotowych (Tabela 2), za zgodą pacjentów i zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Wydajność protokołu w zakresie tworzenia długoterminowych hodowli neurosfer wyniosła 41,6%, podobnie w przypadku guzów nowo zdiagnozowanych, jak i nawrotowych (Tabela 2). W niektórych próbkach GBM neurosfery tworzą się w ciągu pierwszych kilku dni (Ryciny 1B i 1C), podczas gdy w innych wymagany jest dłuższy czas hodowli (Ryciny 1D i 1E).

Wydajność tworzenia neurosfer nie zależała wyłącznie od stopnia martwicy w tkance, co obrazują wyniki uzyskane z nowo zdiagnozowanego guza o wysokiej gęstości komórkowej (GBM1) oraz guza nawrotowego z martwicą (GBM2) przetworzonych zgodnie z Protokółami 1 i 2, z których obu uzyskano kultury neurosfer (Rysunek 2).

Badanie potencjału nowotworowego każdej hodowli neurosfer u myszy z niedoborem odporności stanowi kluczową walidację tej metody wzbogacania CSC. Stosując protokół podobny do opisanego wcześniej18, neurosfery GBM1 i GBM2 wszczepiono do mózgów myszy z niedoborem odporności, zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi oraz wytycznymi IACUC dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Guzy ksenoprzeszczepione wykazują cechy morfologiczne charakterystyczne dla GBM, takie jak naciekanie miąższu mózgu i martwica (Rysunek 2).

GBM3 poddano dysocjacji (Ryc. 1A) i hodowano w medium do neurosfer (Ryc. 1D i 1E) oraz w 2% FBS/NMGF (Ryc. 1D, 1G, i 1H). Komórki w monowarstwie hodowane w 2% FBS/NMGF oraz komórki neurosferyczne hodowane w NMGF zostały poddane dysocjacji, a następnie taką samą liczbę komórek implantowano myszom nago-wykluczonym (nude), stosując procedurę opisaną na Ryc. 2. Nie zaobserwowano różnic w przeżywalności, dynamice wzrostu guza ani w morfologii pomiędzy obiema metodami hodowli przedimplantacyjnej (Ryc. 3A-C). Charakterystyka wzrostu guza nie uległa zmianie aż do ostatniego przetestowanego pasażu: P20 dla neurosfer oraz P10 dla 2% FBS/NMGF. Podczas gdy markery komórek macierzystych układu nerwowego, w tym Sox2, wykazują obniżoną ekspresję w większości pierwotnych komórek GBM hodowanych w 10% FBS 3,4,11, NMGF uzupełniony o 2% FBS pozwala na zachowanie ekspresji Sox2 (Ryc. 3D).

Neurosfery przetworzono zgodnie z Protokołem 4 i zabarwiono H&E (Rysunek 4A), przeciwciałem anty-Sox2, wykazując lokalizację jądrową (Rysunek 4B), oraz przeciwciałem EGFR, wykazując lokalizację w błonie komórkowej (Rysunek 4C). Protokół ten zastosowano w celu oceny zależnych od bodźców zmian w ekspresji nestyny, GFAP oraz markera proliferacji Ki6711.

Tabela 2. Wydajność uzyskiwania długoterminowych, samoodnawiających się kultur neurosfer z GBM.

PatologianProcent próbek, z których uzyskano długoterminowo samoodnawiające się neurosfery (n)
Glioblastoma – nieleczone, pierwsza operacja8842.0% (37)
Glioblastoma – nawrotowe3740.5% (15)
ŁĄCZNIE12541.6% (52)

Schemat procesu wzrostu hodowli komórkowej glejaka wielopostaciowego; tworzenie neurosfer w ciągu 14 dni; protokół NMGF.
Rysunek 1. Hodowla komórkowa ze świeżych preparatów chirurgicznych glejaka wielopostaciowego. Świeże guzy są rozdzielane enzymatycznie do pojedynczych komórek. Interfejs komórek jądrzastych z podłoża do separacji gęstościowej jest następnie wysiewany w NMGF. Rozdzielone neurosfery są wysiewane w NMGF; zazwyczaj 1 dzień po wysiewie obecne są martwe komórki, debris, przytwierdzone pojedyncze komórki oraz sporadycznie dzielące się komórki w zawiesinie (A). Tworzenie neurosfer przebiega szybciej w niektórych przypadkach (B,C), a wolniej w innych (D,E). Wszystkie neurosfery są rozdzielane i przesiewane przez co najmniej 10 pasaży; 41,6% GBM daje długoterminowe, samoodnawiające się neurosfery. Żywe, rozdzielone komórki GBM, które nie rosną jako neurosfery (F), mogą zostać przeniesione do alternatywnych warunków hodowli, np. 2% FBS/NMGF (G,H). Pasek skali (A), 100 μm, odnosi się do wszystkich obrazów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Histologia guza GBM i analiza modelu mysiego; barwienie H&E, ekspresja MHC I, hMit; schemat.
Rysunek 2. Generowanie neurosfer i ortotopowe ksenoprzeszczepy mysie z guzów GBM. Próbkę guza o wysokiej gęstości komórek (GBM1) oraz guza o wysokiej zawartości obszarów nekrotycznych (GBM2) poddano dysocjacji i hodowano neurosfery przez 10 pasażów zgodnie z Protokołami 1 i 2. Myszom z niedoborem odporności wszczepiono 3 x 105 zdysocjowanych komórek neurosfery, a następnie uśpiono je w stanie agonii. Mózgi myszy utrwalono w formalinie i zatopiono w parafinie w celu wykonania barwienia H&E oraz detekcji immunohistochemicznej markerów ludzkich, ludzkich mitochondriów (hMit) lub podjednostki głównego układu zgodności tkankowej klasy I HLA-A (MHC-I). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Wykres analizy przeżywalności, wzrost sygnału BLI, barwienie tkanek i ekspresja białek w badaniu nad leczeniem nowotworów.
Rycina 3. Podobny wzrost guza u myszy z dokonały implantacją wewnątrzczaszkowej komórek GBM3 hodowanych jako neurosfery w NMGF lub jako monowarstwy w 2% FBS/NMGF. (A) Krzywe przeżycia Kaplana-Meiera dla GBM3 hodowanych jako neurosfery w NMGF lub monowarstwy w 2% FBS/NMGF (obie grupy z pasażem <10) nie wykazują różnic w przeżywalności (n=10, p=0.7174, test log-rank). (B) Wzrost guza monitorowany za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo (BLI) nie wykazuje istotnych różnic w dynamice wzrostu guza między dwiema grupami. (C) Morfologia guza jest nieodróżnialna dla 4 ksenoprzeszczepów GBM3, z czego 2 hodowano w NMGF, a 2 w 2% FBS/NMGF. Barwienie MHC-I wykonane zgodnie z opisem dla Ryciny 2. Skala, 600 μm. (D) Western blot wykazujący zachowanie ekspresji markera komórek macierzystych Sox2 w kulturach 2% FBS/NMGF wykorzystanych do inicjacji guzów ksenoprzeszczepowych (A-C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Analiza histologiczna, barwienie H&E, immunohistochemia Sox2 i EGFR, porównanie próbek tkanek
Rysunek 4. Analiza ekspresji białek w przekrojach neurosfer metodą immunohistochemiczną. Kultury neurosfer utrwalono formaliną i zatopiono w parafinie zgodnie z opisem w Procedurze 4, a następnie zabarwiono H&E (A), przeciwciałem anty-Sox2 (B) oraz przeciwciałem anty-EGFR (C). Do wizualizacji (B,C) zastosowano substrat DAB. Pasek skali, 20 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dyskusja

Właściwa enzymatyczna dysocjacja komórek nowotworowych jest krytycznym krokiem w tym protokole. Tkanka musi być dobrze rozdrobniona przed inkubacją w roztworze do dysocjacji komórek w temperaturze 37 °C na zmianie, przez co najmniej 30 minut, podczas których tkanka musi zostać mechanicznie rozdrobniona, a przedłużenie dysocjacji sprawdzone. W zależności od stopnia spójności tkanki, inkubację można przedłużyć o dodatkowe 15-30 minut, w zależności od potrzeb do całkowitej dysocjacji na pojedyncze komórki. Nie zaleca się inkubacji w roztworze dysocjacyjnym dłużej niż 1 godzinę ze względu na zmniejszoną żywotność komórek. Chociaż optymalna ilość tkanki wyjściowej wynosi 200-500 mg, protokół ten doprowadził do udanych hodowli neurosfery już od 50 mg tkanki nowotworowej.

NMGF bez surowicy jest pożywką selektywną, a pewien odsetek komórek nowotworowych stanowiących większość guza, a także komórki gospodarza, nie przeżyje, podczas gdy inne przyłączą się do kolby poddanej hodowli tkankowej po posiewie. Bardzo ważne jest, aby neurosfery, które uformują się w ciągu 1-3 tygodni (ryc. 1B-E), zostały przeniesione do świeżych kolb, aby oddzielić je od zróżnicowanych komórek nowotworowych i szczątków.

Komórki GBM zdysocjowane enzymatycznie i nigdy nie hodowane (krok 1.10) mogą być kriokonserwowane jako zapasowe źródło komórek do hodowli w alternatywnych podłożach, w przypadku niepowodzenia hodowli neurosfery. Z takich zamrożonych zapasów udało nam się uzyskać kultury neurosferyczne, a także komórki jednowarstwowe rosnące w 2% FBS/NMGF.

Koncepcyjnie "rakowa komórka macierzysta" jest w toku, a ta rozwijająca się dziedzina skorzysta na dodatkowym wyjaśnieniu, ponieważ implikacje kliniczne są znaczące, szczególnie w zakresie generowania niejednorodności, plastyczności i oporności guzana terapię 1 9,20. Oprócz tego, że są niezbędne do generowania specyficznych dla pacjenta modeli zwierzęcych GBM, kultury neurosfery są również cenne dla badań in vitro, takich jak zmiany w sygnalizacji komórkowej i ekspresji genów w odpowiedzi na czynniki wzrostu, niedotlenienie i środki farmakologiczne11,21. Zdecydowaliśmy się na wykorzystanie przekrojów neurosfer utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, zachowując architekturę 3D, do badania ekspresji białek i modyfikacji potranslacyjnych za pomocą immunohistochemii11, ze względu na lepszą lokalizację subkomórkową w stosunku do bardziej powszechnej metody znakowania i obrazowania całej sfery.

Wykazano, że nie wszystkie komórki w neurosferach pochodzące z mózgu dorosłego ssaka są komórkami macierzystymi22. Podobnie, neurosfery wyhodowane z guzów GBM prawdopodobnie nie są klonalne, ze względu na obecność bardziej zróżnicowanych komórek progenitorowych raka i samoagregację, o której wiadomo, że występuje przy dużej gęstości komórek23, co przez niektórych uważa się za ograniczenie tej metody. Aby sprzyjać wzbogacaniu długoterminowych, samoodnawiających się komórek macierzystych, w przeciwieństwie do tylko progenitorów, które mogą przejściowo rosnąć jako neurosfery22, pierwotne neurosfery są dysocjowane w celu utworzenia wtórnej neurosfery i dalej pasażowane przez co najmniej 10 pasażów, co w przybliżeniu odpowiada 2 miesiącom w ciągłej hodowli, co wskazuje na populację wzbogaconą w komórki macierzyste22. Z naszego doświadczenia wynika, że kultury neurosfery GBM, które osiągają ten znak, mogą być nadal rozwijane jako neurosfery w nieskończoność. Stopień nowotworu ma znaczenie, ponieważ uzyskaliśmy udane posiewy z GBM i gwiaździaków anaplastycznych, odpowiednio IV i III stopnia WHO, ale nie z glejaków niższego stopnia.

Najbardziej rozpowszechniona metoda hodowli komórek glejaka, w tradycyjnej pożywce wzbogaconej 10% FBS, prowadzi do znacznej rozbieżności genomowej i fenotypowej w stosunku do pierwotnych nowotworów 4. Z drugiej strony, kultury neurosfery są stabilnym i długoterminowym źródłem komórek prezentujących fenotyp4 nowotworowych komórek macierzystych. Metoda neurosfery staje się coraz bardziej popularna w celu wzbogacenia CSC w długoterminowych hodowlach dla ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów myszy, mimo że nie jest skuteczna w przypadku wszystkich próbek gwiaździaków o wysokim stopniu złośliwości, co stanowi główną słabość tej metody. Trwają badania mające na celu zrozumienie, w jaki sposób charakterystyka molekularna guzów rodzicielskich może wpływać na tworzenie neurosfery. Badanie praktycznych alternatywnych metod hodowli glejaków o wysokim stopniu złośliwości, a następnie obszerna walidacja są przyznawane, biorąc pod uwagę doniosłe korzyści płynące z posiadania specyficznych dla pacjenta modeli GBM, w miarę jak wkraczamy w erę medycyny spersonalizowanej, napędzanej dostępnością informacji "omicznych" i zwiększoną liczbą potencjalnych terapii celowanych.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM/F12Life Technologies11330-032
Trypsyna - EDTA 0.05%Life Technologies25300-054
Hank' s Zrównoważony roztwór soli, wolny od wapnia i magnezuLife Technologies14170-120
Hank' s Zrównoważony roztwór soli z wapniem i magnezem Life Technologies24020-117
Kolagenaza typu 4Inhibitor5004188
SigmaT7659
DNase ISigmaD4527
Suplement N2 (100x)Life Technologies17502-048
Albumina z surowicy bydlęcej, klasa hodowli komórkowychSigmaA4919
Roztwór odczynnika gentamycynyLife Technologies15710-064
Antybiotyk/AntybiotykTechnologie życia15240-062
Rekombinowany ludzki FGF-zasadowyPeproTech100-18B
Rekombinowany ludzki EGFPeproTechAF-100-15
Limffolit-myszCedarlane Laboratories Ltd.CL5031
Odzyskiwanie kultur komórkowych Zamrażanie Technologie średniejżywotności12648-010
Sterylne sitko do komórek, 40 μ mFisher22363547
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS), bez wapnia i magnezuLife Technologies14190-144
Surowica bydlęcaLife Technologies26140-079
Barwienie błękitem trypanowym, 0,4%Life Technologies15250-061
Neutralny buforowany protokół formaliny245-684
Kasety tkankowe HistoplexThermo Scientific22-146-426
RotatorMiltenyi BioTec130-090-753
GlutaMAX  SuplementLife Technologies35050-061
KnockOut D-MEM/F12Life Technologies12660-012
Suplement neuronowy Stem Pro Technologie życioweA1058-01
trypsyny Worthington płodu

Bibliografia

  1. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).
  2. Ignatova, T. N., et al. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
  3. Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
  4. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
  5. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  6. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756-760 (2006).
  7. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  8. Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).
  9. Joo, K. M., et al. Clinical and biological implications of CD133-positive and CD133-negative cells in glioblastomas. Lab. Invest. 88, 808-815 (2008).
  10. Son, M. J., Woolard, K., Nam, D. H., Lee, J., Fine, H. A. SSEA-1 is an enrichment marker for tumor-initiating cells in human glioblastoma. Cell Stem cell. 4, 440-452 (2009).
  11. deCarvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28, 181-190 (2010).
  12. Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. , (2011).
  13. Laks, D. R., et al. Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma. Stem Cells. 27, 980-987 (2009).
  14. Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nat. Rev. Cancer. 6, 425-436 (2006).
  15. Gunther, H. S., et al. Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).
  16. Fael Al-Mayhani, T. M., et al. An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours. J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).
  17. Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).
  18. Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
  19. Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype. PLoS One. 5, (2010).
  20. Pietras, A. Cancer stem cells in tumor heterogeneity. Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).
  21. Lomonaco, S. L., et al. The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells. Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).
  22. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).
  23. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla neurosferdysocjacja guzaksenoprzeszczep ortotopowyrakowe komórki macierzysteimmunohistochemiazatapianie w parafinieseparacja limfocytówmodele glejaka wielopostaciowegoekspansja hodowli komórkowych
Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.