Artykuł metodologiczny

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

DOI:

10.3791/51091

⸱

23 stycznia 2014

 ,  ,  , 
1Virus and Centromere Team, Centre de Génétique et Physiologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS UMR 5534, 2Université de Lyon 1, 3Laboratoire d'excellence, LabEX DEVweCAN, 4Institut de Virologie Moléculaire et Structurale, CNRS UPR 3296, 5Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR 5286

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kodetekcja pojedynczej komórki genu, jego produktu RNA i komórkowych białek regulatorowych jest kluczowa dla badania regulacji ekspresji genów. Jest to wyzwanie w dziedzinie wirusologii; w szczególności w odniesieniu do trwałych wirusów DNA replikujących się jądrowo, które wykorzystują do swoich badań modele zwierzęce. Wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) powoduje trwającą całe życie utajoną infekcję w neuronach obwodowych. Utajony wirus służy jako rezerwuar, z którego reaktywuje się i indukuje nowy epizod opryszczkowy. Biologia komórki związana z latencją HSV-1 pozostaje słabo poznana, częściowo z powodu braku metod wykrywania genomów HSV-1 in situ w modelach zwierzęcych. Opisujemy podejście do hybrydyzacji DNA i fluorescencji in situ (FISH), skutecznie wykrywające genomy wirusowe o niskiej liczbie kopii w sekcjach tkanek neuronalnych z zakażonych modeli zwierzęcych. Metoda opiera się na demaskowaniu antygenu na bazie ciepła i bezpośrednio znakowanych sondach DNA domowej roboty lub sondach dostępnych na rynku. Opracowaliśmy podejście do potrójnego barwienia, łącząc DNA-FISH z RNA-FISH i immunofluorescencją, wykorzystując wzmocnienie sygnału oparte na peroksydazie, aby spełnić każde wymaganie barwienia. Dużym ulepszeniem jest możliwość uzyskania, w obrębie skrawków tkanek o wielkości 10 μm, sygnałów o niskim tle, które można zobrazować w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii konfokalnej i konwencjonalnej epifluorescencji szerokokątnej. Dodatkowo, potrójne barwienie działało z szerokim zakresem przeciwciał skierowanych przeciwko białkom komórkowym i wirusowym. Pełny protokół trwa 2,5 dnia, aby dostosować się do penetracji przeciwciał i sondy w tkance.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) jest trwałym ludzkim wirusem neurotropowym, ustanawiającym długotrwałą utajoną infekcję w neuronach zwojów nerwu trójdzielnego (TG) obwodowego układu nerwowego, z których okresowo reaktywuje się, aby się replikować i rozprzestrzeniać. Genom HSV-1 to 150 kb dsDNA zlokalizowany w jądrze neuronu gospodarza, gdzie pozostaje jako wielokopijne chromatynowe plazmidy, które nie integrują się z genomem komórki gospodarza1,2. Podczas latencji program genetyczny cyklu replikacyjnego HSV-1 jest silnie stłumiony, a ekspresja genów jest ograniczona do locus transkryptu związanego z latencją (LAT), od ustanowienia latencji do zainicjowania reaktywacji3. LAT wytwarza długie, niekodujące RNA o długości 8,5 kb przetworzone na główny stabilny lariat o wielkości 2 kb i kilka miRNA4-7. Latencja HSV-1 charakteryzuje się zatem obecnością wirusowego genomowego DNA, RNA LAT i brakiem wykrywalnych białek cyklu replikacyjnego.

Modele zwierzęce, głównie myszy i króliki, są eksperymentalnymi modelami podsumowującymi kilka cech latencji u człowieka. Jedną z głównych zalet tych modeli jest to, że pozwalają one badać fizjologiczne aspekty latencji HSV-1 u immunokompetentnych gospodarzy. W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano wiele narzędzi eksperymentalnych, takich jak genetycznie zmodyfikowane wirusy i myszy, do badania fizjologii, genetyki i biologii komórkowej latencji HSV-1 z tkanek zwierzęcych. Do tej pory genomowe DNA wirusa wykrywano i oznaczano ilościowo za pomocą Southern blot i qPCR ze zdysocjowanych TG. Jednak obecnie nie ma dostępnej metody wykrywania genomu HSV-1 poprzez hybrydyzację in situ na odcinkach tkanek8. W związku z tym latencja jest rutynowo oceniana na odcinkach histologicznych poprzez wykrywanie LAT RNA przez hybrydyzację RNA in situ, a nie wykrywanie genomu wirusa. Ponieważ niemożliwe było scharakteryzowanie zakażonych komórek na podstawie obecności genomów wirusa, to techniczne ograniczenie było główną wadą analizy wielu aspektów interakcji gospodarz-wirus, takich jak związek między genomem wirusa a ekspresją genów komórkowych i wirusowych lub odpowiedź immunologiczna za pośrednictwem komórki gospodarza9,10.

Najważniejsze, niejednorodność między komórkami utajonej infekcji pozostaje stosunkowo niezbadana i okazała się kluczową cechą latencji u myszy i ludzkich neuronów zwojowych czuciowych wszczepionych myszomSCID 11-17. Zazwyczaj za pomocą qPCR wykazano, że liczba kopii genomu HSV-1 na komórkę waha się od 5 do kilkuset. Chociaż LAT wydaje się być kluczowym regulatorem latencji i reaktywacji, dane qPCR dotyczące izolowanych neuronów i PCR in situ wykazały, że tylko podzbiór utajonych zainfekowanych neuronów, zaledwie 30%, wyraża locus LAT11,12,18-21. Nie jest jasne, w jaki sposób komórka gospodarza i środowisko komórkowe w tkance wpływają na tworzenie się latencji wirusa i ekspresję genów wirusa. W tym miejscu opisujemy solidną metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do skutecznego wykrywania genomowego DNA HSV-1 o niskiej kopii w skrawkach tkanki neuronalnej zwierząt. Metoda ta została zaprojektowana i wykorzystana przez nas w celu uzyskania dostępu do obrazowania mikroskopowego o wysokiej rozdzielczości, które jest niezbędne do badania interakcji genomu wirusa ze składnikami wewnątrzjądrowymi komórki gospodarza22. Dodatkowo opisujemy metodę wielokrotnego barwienia do jednoczesnego wykrywania DNA wirusa z RNA i białkami, co jest unikalnym narzędziem do opisu interakcji wirus-gospodarz, które regulują ekspresję genów wirusa. Metoda ta może być również stosowana w szerokim zakresie analiz wymagających wykrycia utajonego genomu HSV-1, takich jak ilościowe określanie zakażonych neuronów w dużej liczbie odcinków. Kluczowym krokiem jest zastosowanie leczenia polegającego na odzyskiwaniu antygenu, aby DNA wirusa było dostępne do hybrydyzacji. W związku z tym protokół ten może być również skuteczny w wykrywaniu innych wirusów dsDNA, które obecnie nie są wykrywalne za pomocą konwencjonalnych metod DNA-FISH w tkankach zwierzęcych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda została użyta w badaniu opublikowanym wcześniej 22. W celu zapoznania się z ogólnym tłem i opisem konwencjonalnych manipulacji na ISH, IF i FISH, sugerujemy skorzystanie z następującej dostępnej literatury 23.

1. Zakażenie zwierząt

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt doświadczalnych były zgodne z kwestiami etycznymi z Oświadczenia Stowarzyszenia Badań nad Widzeniem i Okulistyką (ARVO) dotyczącego wykorzystywania zwierząt w badaniach, i zostały zatwierdzone przez lokalny Komitet Etyczny UPR-3296-CNRS, zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnoty Europejskiej 86/609/EWG. Wszystkie zwierzęta otrzymały nieograniczony dostęp do pożywienia i wody.

Metoda zakażenia myszy HSV-1 opisana poniżej została wykorzystana w badaniach opublikowanych wcześniej24-26.

  1. Przygotuj następujące roztwory do przygotowania przed rozpoczęciem:

    Wirus HSV-1 roztwór podstawowy
    Roztwór znieczulający - Ketamina-100 mg/kg i Ksylazyna-10 mg/kg
     
  2. Pobrać 1 μl wirusa (106 pfu) do szklanej mikrostrzykawki o pojemności 5 μl podłączonej do pompy mikrostrzykawkowej o wydajności 0,1 μl/s. Uwaga: Zawiesić zapas wirusa w pożywce wolnej od czerwieni fenolowej, aby zobaczyć granicę między czerwonym olejem obecnym w kapilarze a roztworem wirusa i aby uniknąć wstrzykiwania powietrza w miejsce inokulacji wirusa.
  3. Połóż znieczuloną mysz (ketamina-100 mg/kg i ksylazyna-10 mg/kg) na plecach do góry.
  4. Umieść znieczuloną głowę myszy pod dwuokularowym stereomikroskopem i wprowadź igłę w warstwę podnabłonkową lewej górnej wargi na granicy śluzówkowo-skórnej. Roztwór wirusa należy wstrzykiwać w dwóch etapach (dwukrotnie po 0,5 μl) z prędkością 0,5 μl na 5 sekund. Uwaga: Należy zachować 10-sekundową przerwę między dwoma wstrzyknięciami po 0,5 μl, aby umożliwić wchłonięcie zawiesiny wirusa w miejscu wstrzyknięcia.
  5. Umieść mysz w inkubatorze o temperaturze 37 °C do momentu wybudzenia.
  6. Pozostaw mysz w pomieszczeniach dla zwierząt, aby mogła dojść do siebie przez wymagany czas. nuta: W modelu mysim HSV-1 indukuje pierwotne zakażenie, zwane ostrym zakażeniem, które trwa krócej niż 10 dni w miejscu inokulacji i w kilku tkankach nerwowych, w tym TG, górnych zwojach szyjnych (SCG) i zwojach korzenia grzbietowego (DRG) w zależności od miejsca inokulacji. Objawy pierwotnej infekcji stopniowo zanikają, a latencję uważa się za w pełni utrwaloną po około 28-30 dniach od infekcji (dpi). Tkanki neuronalne można pobrać zwykle od 4 dpi w przypadku badań nad ostrą infekcją i od 28 dpi w przypadku badań nad opóźnieniem.

2. Naprawa perfuzji myszy

  1. Przed rozpoczęciem przygotuj następujące roztwory: 50 ml buforu soli fizjologicznej

    60 ml 1x PBS
    150 ml świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu w 1x PBS
    60 ml 20% sacharozy w 1x PBS.
     
  2. Przygotuj rurkę perfuzyjną: podłącz igłę do kapilary, która jest podłączona do pompy perystaltycznej.
  3. Znieczulij mysz zgodnie z powyższym opisem (srep 1.2) i połóż ją na plecach na tacy sekcyjnej, przymocowanej za cztery nogi za pomocą szpilek.
  4. Za pomocą nożyczek przetnij skórę od brzucha aż do gardła*. Oderwij cienką warstwę tkanki pokrywającą narządy. Otwórz klatkę piersiową, przecinając żebra po jednej stronie mostka. Usuń skórę, odrywając. Odsuń od siebie prawą i lewą część klatki piersiowej, aby odsłonić serce. nuta: Należy zwrócić uwagę, aby nie nacinać jelit, płuc i dużych naczyń krwionośnych (tętnic szyjnych i żył szyjnych), co uniemożliwi utrwalenie perfuzji.
  5. Wprowadzić igłę do lewej komory*. Naciąć prawy przedsionek nożyczkami. Kontynuuj wykrwawianie, wstrzykując 20 ml soli fizjologicznej do naczyń krwionośnych przez serce. Pozwól krwi płynąć w tacy. nuta: Podczas tego zabiegu należy zwrócić uwagę, aby nie przebić się przez drugą stronę serca.
  6. Uzdatnić do perfuzji ze 150 ml 4% PFA w 1x PBS przez 15 min* (Uwaga: PFA jest toksyczny, manipuluj pod wyciągiem). Wprowadzić 60 ml 20% sacharozy w 1x PBS przez 6 min. Na tym etapie mysz jest gotowa do zbioru TG. nuta: Ustawić pompę na 10 ml/min. Dobra perfuzja jest zauważalna, gdy ogon myszy sztywnieje, podnosi się, a następnie ponownie opada.

3. Żniwa TG

  1. Przed rozpoczęciem przygotuj następujące rozwiązanie:

    20% sacharozy w 1x PBS
     
  2. Wytnij głowę na poziomie szyi. Przetnij czubek nosa tuż za siekaczami, aby odsłonić jamę nosową. Naciąć podniebienie nożyczkami na dwie części i odsunąć każdą stronę podniebienia. nuta: TGs pojawia się tuż pod podniebieniem, jako dwie białe i podłużne masy o długości 2-3 mm znajdujące się po prawej i lewej stronie i połączone z nerwem trójdzielnym.
  3. Przetnij gałęzie nerwu trójdzielnego po każdej stronie TG, aby uwolnić TG z pnia mózgu. Usuń TG za pomocą szczypiec chirurgicznych i przechowuj je w sterylnym roztworze 20% sacharozy przez 24 godziny. Uwaga: Użyj dwóch różnych biorców dla lewej i prawej TG, aby uniknąć pomylenia lewego TG (zakażony) i prawego TG (nie zakażony lub słabo zainfekowany). Inkubować TG w 20% sacharozie w 1x PBS przez 24 godziny przed zasadzeniem.
  4. Zanurzyć TG w jednym bloku w podłożu do zatapiania do kriosekcji i zamrozić w temperaturze -80 °C.
  5. Przechowywać bloki w temperaturze -80 °C do momentu ich podziału.

4. Przygotowanie kriosekcji

  1. Pokrój TG wzdłuż jako odcinki 10 μm na kriostacie o temperaturze -20 °C i umieść je na lekko podgrzanych (30° C) szkiełkach Superfrost. Pozostaw plastry do wyschnięcia na 5-10 minut, a następnie zamroź i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu użycia. nuta: Na jednym slajdzie można umieścić do 4-5 sekcji, jeśli jednocześnie ma być obrabiana duża liczba sekcji. Postępujemy w następujący sposób: sekcje szeregowe są umieszczane na 3 seriach slajdów oznaczonych A1, B1 i C1, a następnie A2, B2, C2 i tak dalej. W związku z tym każda seria szkiełek (A, B i C) może być przetwarzana pod kątem innego barwienia (hybrydyzacja in situ, FISH, in situ PCR, LCM), a dane uzyskane przy użyciu różnych technik można porównać, wiedząc, że szkiełka o tym samym numerze odpowiadają temu samemu regionowi TG.

5. Etykietowanie sondy HSV-1

Opisany poniżej protokół wykrywania genomu HSV-1 przez DNA FISH został z powodzeniem zastosowany z dwoma typami sond. Pierwszą z nich jest domowej roboty sonda fluorescencyjna znakowana Cy3, która jest odpowiednia do dokładnej analizy organizacji jądrowej w poszczególnych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o dużym powiększeniu. Druga to dostępna na rynku sonda biotynylowana, którą można połączyć ze wzmocnieniem sygnału na bazie peroksydazy, aby zapewnić jasny sygnał. Ten ostatni jest odpowiedni do identyfikacji i kwantyfikacji neuronów zawierających wirusa w małym powiększeniu w całym przekroju oraz do analizy wzorców genomu HSV-1. Użytkownicy końcowi powinni ocenić, które podejście najlepiej odpowiada celowi ich badania. Dostępna na rynku sonda jest wymieniona w sekcji odczynników, a przygotowanie sondy domowej roboty opisano poniżej.

  1. Przed rozpoczęciem przygotuj następujące roztwory:

    Genom HSV-1 zawierający wektory (patrz krok 1)
    70% etanol, klasa biologii molekularnej.
     
  2. Przygotować kosmidy zawierające 30 kb porcje genomów HSV-1 (kosmidy o numerach 14, 28 i 56 opisane w odnośniku20, używając kolumn oczyszczających przeznaczonych dla dużych wektorów. nuta: Inne typy bibliotek zawierających genomy HSV-1, takie jak sztuczne chromosomy bakteryjne, powinny również działać, o ile sonda obejmuje dużą część genomu HSV-1, aby wytworzyć wystarczającą ilość sygnału27-29. W naszych rękach sondy wykonane ze szkieletu wektora kosmidowego nie wytwarzały żadnego sygnału i były używane jako kontrola negatywna. W związku z tym w naszym badaniu wykorzystano całe wektory kosmidowe zawierające sekwencję HSV-1. Możliwe jest również wycięcie sekwencji HSV-1 i wykorzystanie jej do przygotowania sondy.
  3. Oznacz 2 μg każdego kosmidu za pomocą Cy3-dCTP za pomocą zestawu do translacji nicków zgodnie z wytycznymi producenta. nuta: Znakowanie należy wykonać mieszaniną reakcyjną zawierającą tylko Cy3-dCTP i brak nieznakowanego dCTP.
  4. Zatrzymać reakcję, dodając 3 μl 0,5 M EDTA do mieszaniny i ogrzewając w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Schłodzić na lodzie.
  5. Oczyść sondę na minikolumnie wykluczającej żel G50. Dodać 150 μg DNA plemników łososia do sondy i wytrącić sondę przez wytrącanie etanolu. Osad DNA powinien być różowy ze względu na włączenie Cy3. Umyj granulat 70% etanolem i usuń jak najwięcej etanolu za pomocą pipety. Nie pozwól, aby granulka wyschła.
  6. Rozpuść osad w 100 μl dejonizowanego formamidu (Uwaga: formamid jest toksyczny. Manipulować pod wyciągiem). W tym momencie nie można wiarygodnie zmierzyć stężenia sondy. Ilości sondy wymienione w tekście odnoszą się do ilości matrycy DNA użytej do wykonania sondy. Protokół oparty jest na 2 μg matrycy DNA i 100 μl formamidu, przyjmuje się, że jest to 20 ng/μl. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Oznakowaną sondę można przygotować w dużej ilości i przechowywać w stanie zamrożonym przez kilka miesięcy.

6. DNA-RYBA

Rysunek 1 pokazuje przegląd głównych etapów protokołu DNA-FISH oraz sposób przeprowadzenia DNA-FISH jako części eksperymentu wielokrotnego barwienia w celu jednoczesnego wykrycia RNA i białka, zgodnie z opisem w Protokołach 7-9.

  1. Przed rozpoczęciem przygotuj następujące roztwory:

    0,5% Triton X-100 w 1x PBS
    2x bufor SSC i 0,2x SSC
    100 mM bufor cytrynianu pH 6,0 (10x roztwór podstawowy) i 10 mM bufor cytrynianu pH 6,0 (roztwór roboczy)
    2x bufor hybrydyzacyjny (patrz Protokół 4)
     
  2. Pierwszego dnia umieść szkiełka na uchwycie na szkiełku w temperaturze pokojowej i pozostaw sekcje do wyschnięcia na 10 minut. Zakreśl sekcje hydrofobowym pisakiem. Nawadniaj sekcje w 1x PBS przez 10 minut. Inkubować skrawki przez 20 minut z 0,5% Triton X-100 w 1x PBS, aby przeniknąć tkankę. Myć 3x 10 min 2x SSC i trzymać w 2x SSC, aż bufor demaskujący zostanie podgrzany (patrz poniżej).
  3. Do demaskowania należy przygotować szklaną tackę na szkiełka podstawowe (o pojemności 20 szkiełek) wypełnioną 200 ml 10 mM buforu cytrynianu sodu (pH 6,0). Umieść tackę w większym pojemniku wypełnionym 500 ml wody destylowanej. Takie ustawienie pozwala na lepszą kontrolę impulsów grzewczych. Przed umieszczeniem szkiełek w tacce należy podgrzać bufor w kuchence mikrofalowej, aż bufor osiągnie wrzenie (około 8 min przy 800 W).
  4. Umieścić szkiełka w podgrzanej tacce zawierającej bufor cytrynianu i sprawdzić, czy są całkowicie pokryte buforem. Podgrzewaj przez około 20 sekund, aż bufor się zagotuje. Uwaga, NIE pozwól, aby bufor się przegotował, ponieważ może to uszkodzić tkankę. Schłodzić w temperaturze pokojowej przez 2 min. Powtórz cykl ogrzewania 6x (łącznie 7 cykli grzania)*. Schłodzić 2 minuty i przenieść szkiełka w 2x SSC przez 5 min.
    nuta*: Jest to jeden z najważniejszych kroków. Optymalna liczba i czas trwania cykli ogrzewania powinny być określone empirycznie i mogą się różnić w zależności od rodzaju tkanki lub rodzaju użytej sondy. Kuchenka mikrofalowa, tacka, pojemnik i objętość buforu w tacce oraz woda w pojemniku powinny być identyczne w celu zapewnienia powtarzalności demaskowania. Nadmierne gotowanie może spowodować utratę tkanek i uszkodzenie komórek. Dla każdego impulsu grzewczego uważnie obserwuje się pojawienie się wrzenia, a ogrzewanie należy przerwać przy pierwszych oznakach wrzenia. Po skonfigurowaniu demaskowanie wydaje się solidne i powtarzalne. Rysunek 2A pokazuje, że genom HSV-1 można wykryć poprzez demaskowanie za pomocą różnych, co wskazuje, że warunki demaskowania mogą być dalej badane. Stwierdzono, że demaskowanie na podstawie cytrynianu konsekwentnie zapewnia dobry sygnał FISH i zachowanie tkanek, z sekcjami z różnych modeli laboratoryjnych i zwierzęcych.
  5. Inkubować szkiełka w mieszaninie metanol:kwas octowy:PBS (3:1:4) przez 15 minut, a następnie w mieszaninie metanol:kwas octowy (3:1) przez 15 minut (Uwaga: kwas octowy jest. Manipulować pod wyciągiem i stosować odpowiednią ochronę. Przygotuj ten roztwór tuż przed użyciem).
  6. Odwodnić sekcję przez kolejne 10 minut inkubacji w 70%, a następnie 2x 10 minut w 100% etanolu. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 10 minut. Przechowywać w suchym miejscu do czasu sondowania.
  7. Przygotować roztwór sondujący w następujący sposób: przygotować wcześniej 20 ml zapasu 2x buforu hybrydyzacyjnego zawierającego 20% siarczanu dekstranu (MW 500 000), 2x roztwór Denhardta, 4x SSC*. Roztwór rozdzielić na 500 μl w mikroprobówkach i przechowywać w temperaturze -20 °C. Dla 1 szkiełka (szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 50 mm) zmieszać 90 ng sondy znakowanej HSV-1 Cy3 (30 ng sondy na każdy kosmid) i uzupełnić objętość do 40 μl formamidem. Dodać 40 μl 2x buforu hybrydyzacyjnego. Dobrze wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
    nuta*: Aby przygotować 2x bufor hybrydyzacyjny, wymieszaj 4 g siarczanu dekstranu MW 500 000 w 10 ml wody destylowanej. Tworzy lepką mieszankę, która rozpuszcza się po 3-4 godzinach w temperaturze 70 °C. Mieszaj regularnie, aby ułatwić rozpuszczenie. Dodać 4 ml 20x SSC, 400 μl 100x roztworu Denhardta. Uzupełnić do 20 ml i dobrze wymieszać za pomocą wiru.
  8. Upuść 80 μl roztworu sondującego na wysuszone sekcje. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 mm x 50 mm i sprawdź, czy roztwór pomiarowy rozprowadza się po całej powierzchni szkiełka nakrywkowego. Uwaga: nie powinno być żadnych bąbelków. Obecność pęcherzyków zmniejsza wydajność hybrydyzacji. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe za pomocą cementu gumowego i pozostaw do wyschnięcia. Trzymaj szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny, aby uzyskać optymalny sygnał hybrydyzacji w całym slajdzie.
    nuta: Cement kauczukowy jest wygodny, ponieważ szybko schnie, jest wodoodporny i chroni próbkę przed wysuszeniem podczas hybrydyzacji. Jest również łatwy do odklejenia, aby usunąć szkiełko nakrywkowe po hybrydyzacji. Lakier do paznokci to alternatywna wydajna, ale mniej wygodna opcja.
  9. Kontynuuj denaturację, umieszczając szkiełka w inkubatorze do szkiełek o temperaturze 80 °C na 5 minut. Alternatywnie umieść szkiełka na metalowej tacy i umieść tacę w łaźni wodnej o temperaturze 80 °C (tacka powinna unosić się na wodzie). Następnie szybko przenieś szkiełka na metalową tackę umieszczoną na lodzie. Pozostaw na 5 minut. Przenieść szkiełka w temperaturze 37 °C (podgrzewacz szkiełkowy lub inkubator) do hybrydyzacji przez noc.
    nuta: Nie zalecamy krótszej hybrydyzacji, która skutkuje słabym sygnałem lub jego brakiem.
  10. W dniu 2 usuń cement gumowy za pomocą kleszczy, trzymając szkiełko na grzejniku, aby utrzymać sekcję w temperaturze 37 °C. Delikatnie usuń szkiełko nakrywkowe końcówką ostrza skalpela.
  11. Przemyć 3x 2x SSC w temperaturze 37 °C przez 5 minut, a następnie trzy razy 0,2x SSC w temperaturze 37 °C przez 5 min. Przemyć raz 2x SSC w temperaturze pokojowej przez 5 minut i kontynuować barwienie DNA i montaż (patrz Protokół 10 poniżej).
    nuta: Metoda ta pozwala na wykrycie komórkowych celów genomowych poprzez zastosowanie odpowiednich sond w roztworze sondującym wraz z sondami specyficznymi dla HSV-1, jak opublikowano dla sekwencji centromerowych i pericentromerowych22.

7. Ryba z podwójnym RNA-DNA

Zobacz Rysunek 1, zielone pola dla przeglądu.

Dla wielu procedur barwienia, w tym etapu RNA-FISH, zazwyczaj zaleca się najpierw wykrycie RNA, ponieważ taki cel jest wrażliwy na degradację przez RNAzę i chemikalia. Dodatkowo procedura DNA-FISH obejmuje zabiegi, które zmniejszają skuteczność innych barwień. W przypadku RNA-FISH wybraliśmy podejście do wykrywania oparte na enzymach (wzmocnienie sygnału tyramidu (TSA) przy użyciu biotynylowanych sond i streptawidyny sprzężonej z peroksydazą (HRP). TSA opiera się na fluorescencyjnym substracie tyramidu (szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli odczynników), który jest kowalencyjnie połączony z tkanką w reakcji enzymatycznej peroksydazy. Sygnał RNA-FISH jest zatem zachowany podczas DNA-FISH.

  1. Przed rozpoczęciem przygotuj następujące roztwory:

    Wektor do transkrypcji in vitro locus LAT (pSLAT-2)
    1x PBS zawierający 2 mM RVC
    0,5% Triton X-100 w 1x PBS zawierający 2 mM RVC
    3% H20 2 w wodzie destylowanej.
    70%, 80%, 95% etanol, klasa biologii molekularnej.
    4x roztwór hybrydyzacyjny RNA (patrz Protokół 4)
     
  2. Co najmniej jeden dzień przed eksperymentem RNA-FISH przygotuj sondę RNA FISH. Aby wykryć transkrypt związany z opóźnieniem HSV-1 (LAT), przygotuj biotynylowaną sondę rybo-sondy z wektora pSLAT-230 lub innego wektora do transkrypcji in vitro locus LAT, jak opisano wcześniej w odnośniku26. W skrócie: Linearyzuj 10 μg pSLAT-2 za pomocą HindIII i oczyść strawiony wektor za pomocą zestawu do oczyszczania DNA. Zsyntetyzować jednoniciową sondę rybo-sondy z 2 μg strawionego pSLAT-2 za pomocą zestawu do transkrypcji T7 in vitro w obecności biotyny-16-UTP*. Oczyścić sondę za pomocą minikolumny RNA i oznaczyć ilościowo przy 260 nm za pomocą spektrofotometru. Rozcieńczyć sondę przy 50 ng/μl w wodzie wolnej od DNAzy/RNAzy i przechowywać w temperaturze -80 °C, w małych porcjach, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania.
    nuta*: Stosunek biotyny-16-UTP do UTP musi być określony empirycznie. Znaleźliśmy proporcje 40:60, aby zapewnić sondy skutecznie wykrywające LAT przez RNA-FISH.
  3. Pierwszego dnia umieść szkiełka na uchwycie na szkiełku w temperaturze pokojowej i pozostaw sekcje do wyschnięcia na 10 minut. Zakreśl sekcje hydrofobowym pisakiem. Nawadniaj skrawki w 1x PBS zawierającym 2 mM kompleks rybonukleozydu wanadylu (RVC)* przez 10 minut. Inkubować skrawki przez 20 minut z 0,5% Triton X-100 w 1x PBS zawierającym 2 mM RVC w celu przepuszczalności tkanki. Mycie 3x 10 min z 1x PBS, 2 mM RVC. Aby wygasić jakąkolwiek aktywność endogennej peroksydazy, inkubować sekcję w 3% H2O2 przez 2x 10 min, a następnie przemyć raz 1x PBS, 2 mM RVC.
    nuta*: W trakcie procedury RNA-FISH kompleks rybonukleozydowo-wanadylowy (RVC) jest dodawany do i roztworów, aby zapobiec degradacji RNA.
  4. Inkubować 2x 10 min w 70% etanolu. Na tym etapie sekcje mogą być przechowywane w 70% etanolu w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni. Odwodnić skrawki przez inkubację w 80%, 95% i 100% etanolu, po 5 minut każda. Pozostaw sekcję do wyschnięcia na co najmniej 10 minut.
    nuta: W niektórych przypadkach leczenie etanolem może być szkodliwe dla wykrywania innych celów. Można zastosować alternatywny protokół wykorzystujący etap prehybrydyzacji w 50% formamidzie - 2x SSC (szczegóły dotyczące potrójnego barwienia znajdują się poniżej w Protokole 9). Jednak leczenie etanolem jest najbardziej wszechstronnym podejściem do RNA-FISH i zapewnia najniższe tło.
  5. Przygotować roztwór sondujący w następujący sposób: przygotować wcześniej 10 ml zapasu 4x roztworu hybrydyzacji RNA zawierającego 8x SSC, 20x roztwór Denhardta, 4 mM EDTA, 40% dekstranu*. Roztwór rozdzielić na 500 μl w mikroprobówkach i przechowywać w temperaturze -20 °C. Na 1 szkiełko przygotować 80 μl roztworu (szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 50 mm), mieszając 20 ng biotynylowanej rybosondy LAT, 40 ng tRNA drożdży, 2 mM RVC i uzupełnić wodą do 20 μl. Dodać 20 μl 4x roztworu hybrydyzacyjnego RNA i 40 μl formamidu (50% stężenie końcowe). W celu łatwiejszego pipetowania i mieszania zaleca się wstępne podgrzanie roztworu do hybrydyzacji 4x RNA w temperaturze 75 °C. Dobrze wymieszać, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół.
    nuta*: Aby przygotować roztwór hybrydyzacyjny 4x RNA, wymieszaj 4 g siarczanu dekstranu (MW 500 000) w 3 ml wody destylowanej i 4 ml 20x SSC. Tworzy lepką mieszankę, która rozpuszcza się po 3-4 godzinach w temperaturze 70 °C. Mieszaj regularnie, aby ułatwić rozpuszczenie. Dodać 2 ml 100x roztworu Denhardta i 80 μl 0,5 M roztworu EDTA. Uzupełnij do 10 ml wodą i dobrze wymieszaj za pomocą wiru. Uwaga: używaj tylko produktów wolnych od RNAz/DNaz.
  6. denaturacja sondy 10 minut w temperaturze 75 °C. W międzyczasie umieść szkiełka w inkubatorze do szkiełek podstawowych ustawionym na 65 °C. Upuść 80 μl roztworu sondy na sekcje i szybko umieść szkiełko nakrywkowe na kropli. Uwaga: nie powinno być bąbelków. Obecność pęcherzyków zmniejsza wydajność hybrydyzacji. Inkubacja musi odbywać się w wilgotnej komorze, ponieważ szkiełko nakrywkowe nie jest szczelnie zamknięte. Użyj inkubatora szkiełkowego, który może zatrzymać wodę (patrz tabela materiałów) lub przygotuj wilgotną komorę w szczelnie zamkniętym pudełku i umieść ją w piecu do hybrydyzacji o temperaturze 65 °C.
  7. Inkubować przez noc w temperaturze 65 °C. Uwaga: LAT RNA-FISH przeprowadza się w temperaturze 65 °C, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu sondy, które obserwuje się w temperaturze 37 °C. Wiele innych sond RNA-FISH powinno dać dobry sygnał w temperaturze 37 °C.
  8. W dniu 2, przed rozpoczęciem mycia, należy przygotować odczynniki wykrywające zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do wykrywania TSA. Wykrywanie odbywa się za pomocą komercyjnego zestawu detekcyjnego TSA zawierającego streptawidynę sprzężoną z peroksydazą chrzanową (HRP) i zielony lub niebieski substrat fluorescencyjny.
  9. Utrzymać szkiełka na podgrzewaczu szkiełka w temperaturze 65 °C. Ostrożnie zdjąć szkiełko nakrywkowe i szybko dodać 1 ml 50% formamidu do 2x SSC, wstępnie podgrzanego w temperaturze 65 °C. Uwaga, nie dopuścić do wyschnięcia sekcji. Umyć dwukrotnie 10 min w 65 °C w 50% formamidzie w 2x SSC i 2x 10 min w 2x SSC w 65 °C. Przemyć jeszcze raz 2x SSC i umieścić szkiełko na grzałce szkiełka o temperaturze 37 °C.
  10. Postępuj zgodnie z instrukcją producenta zestawu detekcji TSA. Stężenie HRP-streptawidyny, stężenie substratu fluorescencyjnego i czas reakcji muszą być określone empirycznie*. Do wykrywania RNA LAT rutynowo stosowaliśmy następujący warunek: HRP-streptawidyna rozcieńczona w 1/500, odczynnik fluorescencyjny w 1/100 dla niebieskiej fluorescencji i 1/500 dla zielonej fluorescencji oraz czas reakcji 10 min. Sygnał można szybko sprawdzić za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego bez montażu, przed przystąpieniem do DNA-FISH.
    nuta*: Protokół amplifikacji zostanie zaprojektowany zgodnie z głównymi celami eksperymentu. Na przykład, aby dokładnie zlokalizować docelowe RNA, zaleca się stosowanie krótkiego czasu reakcji. W przeciwieństwie do tego, aby szybko zidentyfikować i policzyć dodatnie komórki przy małym powiększeniu, czas reakcji można wydłużyć, aby wygenerować jasny sygnał.
  11. W przypadku DNA-FISH postępuj zgodnie z procedurą wskazaną powyżej, zaczynając od etapu demaskowania (krok 6.2).

8. Ryba Immuno-DNA

Zobacz Rysunek 1, fioletowe pola dla przeglądu.

Podobnie jak w przypadku RNA-DNA-FISH, zaleca się najpierw przeprowadzenie immunofluorescencji, ponieważ DNA-FISH prawdopodobnie zdenaturuje białka i uniemożliwi ich wykrycie przez przeciwciała. Jakość sygnału immunofluorescencyjnego jest w dużym stopniu zależna od charakterystyki przeciwciał i w miarę możliwości należy badać kilka przeciwciał. Demaskowanie epitopów wykonuje się raz przed immunofluorescencją, aby poprawić zarówno wykrywanie białek, jak i DNA-FISH. Aby zachować sygnał immunofluorescencyjny na próbce podczas procedury DNA-FISH, konieczne jest kowalencyjne połączenie jej z tkanką. Przedstawiamy tutaj dwa podejścia, które przyniosły dobre wyniki w naszych rękach, przeciwciała po utrwaleniu i wykrywanie oparte na tyramidzie (patrz krok 8.5). Wybór powinien być podyktowany wstępnymi testami dla każdej pary cel/przeciwciało.

  1. Przed rozpoczęciem przygotuj następujące roztwory:

    1x PBS zawierający 3% normalnej surowicy koziej (NGS).
    2% PFA w 1x PBS (rozcieńczenie z 4% roztworu podstawowego)
     
  2. W pierwszym dniu pierwsze kroki są identyczne jak w DNA-FISH, aż do etapu demaskowania (kroki 6.1-6.2 ).
  3. Po zdemaskowaniu inkubować skrawki z 1x PBS zawierającym 3% NGS przez 1 godzinę.
  4. Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w 1x PBS zawierającym 3% NGS przez 24 godziny. Krótszy czas inkubacji można wykorzystać do skrócenia protokołu, chociaż stwierdziliśmy, że inkubacja przez noc zwykle skutkuje silniejszym sygnałem. W przypadku przeciwciał pierwszorzędowych o niskim powinowactwie, takich jak IgM, może być wymagane do 48-72 godzin inkubacji.
  5. W dniu 2 umyj 3x 10 min z 1x PBS.
  6. Protokół z przeciwciałem po utrwaleniu: inkubować przez 1 godzinę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z zielonym barwnikiem fluorescencyjnym, w 1/200 w 1x PBS zawierającym 3% NGS. Umyj trzy razy po 10 minut 1x PBS. Utrwalanie końcowe wykonuje się z użyciem 2% PFA w 1x PBS przez 10 min*. Mycie 3x 10 min z 1x PBS.
    Protokół z wykrywaniem TSA: inkubować 1 godzinę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP w 1/250 w 1x PBS zawierającym 3% NGS. Umyj trzy razy po 10 minut 1x PBS. Kontynuuj wykrywanie tyramidu zgodnie z instrukcjami producenta. Jak wskazano powyżej (krok 7.9), rozcieńczenie odczynnika i czas reakcji muszą być określone empirycznie. W większości przypadków nasz protokół opierał się na rozcieńczeniu substratu fluorescencyjnego w skali 1/500 i czasie reakcji wynoszącym 10 minut. Mycie 3x 10 min z 1x PBS.
    nuta*: Utrwalenie po utrwaleniu jest krytycznym etapem w immuno-FISH i wymaga starannej konfiguracji. Im silniejsza fiksacja, tym lepszy sygnał IF i tym niższa wydajność DNA-FISH.
  7. Postępuj z DNA-FISH od etapu metanol-kwas octowy (krok 6.3). Czas trwania immuno-DNA-FISH wynosi zazwyczaj 3 dni, przy czym pierwsze przeciwciało inkubuje się przez noc.

9. Podwójne DNA-RNA RYBA sprzężona z immunofluorescencją

Zobacz Rysunek 1, pomarańczowe pola dla przeglądu.

RNA-FISH jest wykonywane najpierw, następnie immunofluorescencja, a na końcu DNA-FISH. Jeśli immunofluorescencja zostanie wykryta w reakcji tyramidowej, kluczowe jest całkowite wygaszenie aktywności HRP z etapu RNA-FISH za pomocąH2O2 i sprawdzenie, czy wygaszanie jest skuteczne. Odbywa się to poprzez użycie jednego szkiełka jako kontroli "bez przeciwciał pierwotnych".

Ponieważ odwodnienie na bazie etanolu jest szkodliwe dla niektórych białek wrażliwych na rozpuszczalniki, ten etap RNA-FISH może hamować immunofluorescencję. Jeśli tak, RNA-FISH można wykonać z alternatywnym protokołem, jak opisano poniżej w stpe 9.3.

  1. Przed rozpoczęciem przygotuj następujące rozwiązanie:

    50% formamidu w 1x PBS zawierającym 2 mM RVC
     
  2. W dniu 1 należy przygotować sondę RNA-FISH i postępować jak w przypadku podwójnej RNA-FISH, aż do etapu hartowaniaH2O2 (krok 7.2).
  3. Przypadek 1, barwienie immunofluorescencyjne działa po odwodnieniu etanolu: postępuj z RNA-FISH, jak wskazano powyżej w krokach 7.3-7.9. Następnie przejdź do kroku 9.6 poniżej.
  4. Przypadek 2, barwieniu immunofluorescencyjnemu zapobiega leczenie etanolem: Umieść szkiełka w wilgotnej komorze na podgrzewaczu szkiełka ustawionym na 65 °C i inkubuj przez 1,5 godziny w roztworze prehybrydyzacyjnym zawierającym 50% formamidu, 1x PBS i 2 mM RVC. Odcedzić roztwór do hybrydyzacji i wlać 80 μl roztworu do hybrydyzacji, jak wskazano w krokach 7.4 i 7.5. Następnie kontynuuj hybrydyzację i wykrywanie RNA-FISH, jak wskazano powyżej w krokach 7.6-7.9 (dzień 2 i 3).
  5. W 2 dniu, po zakończeniu RNA-FISH, kontynuuj immuno-DNA-FISH, zaczynając od etapu demaskowania (patrz krok 6.2). Następnie postępuj zgodnie z protokołem immuno-DNA-FISH, jak wskazano powyżej w krokach 8.2-8.6.

10. Montaż szkiełek i obrazowanie

  1. Przed rozpoczęciem przygotuj następujące rozwiązanie:

    Hoechst 33342 w stężeniu 0,5 μg/ml w 1x PBS
     
  2. Barwienie jąder przez 10 min za pomocą DAPI lub Hoechst 33342* przy 0,5 μg/ml w 1x PBS przez 10 min. Mycie 3x 10 min 1x PBS.
    Uwaga *:Uwaga. Jeśli jeden z systemów detekcji wykorzystuje niebieski barwnik fluorescencyjny, nie należy używać DAPI ani Hoechst. Zamiast tego użyj fluorescencyjnych barwników DNA o widmach emisyjnych w zakresie dalekiej czerwieni, takich jak Topro3.
  3. Spuść jak najwięcej płynu ze szkiełka. Upuść 80 μl podłoża montażowego zawierającego środek zapobiegający blaknięciu na jeden koniec szkiełka. Przykryj sekcje szkiełkiem nakrywkowym o wysokiej jakości optycznej (szkło nr 1,5). Pozwól, aby szkiełko nakrywkowe schodziło powoli, przytrzymując je na jednym końcu kleszczami, aby medium mocujące rozprowadziło się po sekcji bez pęcherzyków.
  4. Uszczelnić lakierem do paznokci i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemnym pudełku na szkiełka.
  5. Bezpośrednia obserwacja sygnału DNA-FISH utajonych genomów HSV-1 wymaga obiektywu immersyjnego z olejkiem o powiększeniu 40X lub większym, z dużą aperturą numeryczną (na przykład 40X N.A 1,1, 60X-63X N.A 1,4, 100X N.A 1,3) i wzbudzającego źródła światła co najmniej równoważnego lampie rtęciowej o mocy 100 W. Zalecamy stosowanie mikroskopu transmisyjnego o wysokiej wydajności, takiego jak te, które producenci dostarczyli w ciągu ostatnich 5 lat (patrz tabela wyposażenia). Mikroskopia konfokalna zapewnia narzędzia do zbierania obrazów z niższym tłem ze względu na autofluorescencję tkanki, taką jak cienkie przekroje lub obrazowanie spektralne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po kilku miesiącach intensywnych testów, odkryliśmy, że chemiczne demaskowanie oparte na cieple umożliwiło utajony genom HSV-1 do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. W trakcie tego procesu próbowaliśmy różnych procedur demaskowania i tylko zabiegi oparte na cieple (tj. podgrzewanie sekcji do temperatury poniżej wrzenia w kuchence mikrofalowej) okazały się skuteczne. Następnie przetestowaliśmy kilka soli, które są rutynowo stosowane w immunohistochemii (IHC) i mikroskopii elektronowej w celu pobrania ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół pozwala na wykrycie utajonego genomu HSV-1 w neuronach wycinków tkanki neuronalnej myszy. Nasza wiedza na temat szlaków regulujących ekspresję genów wirusa była ograniczona przez brak metody wykrywania genomowego DNA HSV-1 in situ w tkankach neuronalnych. Informacje na temat liczby kopii genomu i odsetka zakażonych neuronów pochodziły głównie z analizy PCR na zdysocjowanych neuronach11,12. Wyjaśniając rolę architektury jądrowej komórki gospodarza w latencji HSV-1, postanowiliśmy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy N. Sawtellowi (Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio, USA), S. Efstathiou (University of Cambridge, Wielka Brytania) i Jamesowi Hillowi (LSU Health Sciences Center, Nowy Orlean, USA) za dostarczenie próbek od myszy i królików zakażonych HSV-1 oraz za odczynniki; H. Masumoto (Kazusa DNA Research Institute, Chiba, Japonia) i S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, Francja) w celu pomocnych dyskusji.

Ta praca została sfinansowana z grantów Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (program ATIP, dla PL, http://www.cnrs.fr), Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej (ANR) (ANR-05-MIIM-008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr), Fundacji FINOVI (http://www.finovi.org/:fr:start), LabEX DEVweCAN (ANR-10-LABX-61) Uniwersytetu w Lyonie, w ramach programu "Investissements d'Avenir" (ANR-11-IDEX-0007) prowadzonego przez ANR (http://www.agence-nationale-recherche.fr), l'Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC-7979 i ARC-4910, http://www.arc-cancer.net), la Ligue Nationale Contre le Cancer (LNCC, http://www.ligue-cancer.net) i INCa (program EPIPRO, http://www.e-cancer.fr). FC i PL są badaczami CNRS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy Balb/cJanvier, Francja6-tygodniowe samice
Szczepy HSV-1Szczep SC16 (typ dziki)Patrz Labetoule, M. et al. Invest. Oftalmol. Vis. Sci 44, 217– 225 (2003) w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat przygotowania szczepu HSV-1 i wirusa.
Chlorowodorek ketaminySigmaK2753Dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu zawierającego ketaminę (100 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg)
Chlorowodorek ksylazynySigmaX1251
Paraformaldehyd (PFA)Sigma158127Zawiesić 4 g PFA w 90 ml wody. Dodaj 50 &mikro; l 1N NaOH i ogrzewać w temperaturze 60 & stopni; C w łaźni wodnej z mieszaniem. PFA rozpuszcza się w ciągu około 30 minut. Dodać 10 ml 10x PBS. Roztwór ten można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C w probówkach o pojemności 5 ml. Ostrożność. Manipuluj pod wyciągiem.
Sól fizjologicznaSigma07982-100TAB-F
1x PBS, pH 7,4 (sterylna)Life Technologies10010-015 
SacharozaSigma84100Przygotuj 20% roztwór sacharozy w 1x PBS.
Podłoże do zatapiania do kriosekcji - Tissue-Tek OCT CompoundSAKURA4583 
Zestaw do oczyszczania DNA z dużym wektoremQiagen12462Do oczyszczania wektora Cosmid lub BAC zawierającego genom HSV-1 i przechowywania w temperaturze -20 & stopni; C
Nick zestaw tłumaczeniowyRoche Applied Sciences10 976 776 001 
Cy3-dCTPGE HealthcarePA53021Ochrona przed światłem
0,5 M EDTASigmaE6758 
G50 Mini kolumna obrotowaGE Healthcare27-5330-01 
DNA nasienia łososia 10 mg/mlInvitrogen Life Technologies15632-011 
Etanol biologia molekularna klasaSigma87047Przygotuj 70% roztwór
DNA plemnika łososiaInvitrogen Life Technologies15632-011 
Formamid Biologia molekularna klasaSigmaF9037Uwaga. Manipulować pod wyciągiem.
Biotynylowana sonda komercyjna HSV-1 Enzo Nauki PrzyrodniczeENZ-40838 
Długopis hydrofobowy ImmEdgeVector LaboratoriesH-4000 
20x Sól fizjologiczna Cytrynian Sodu (SSC)SigmaS6639Przygotuj 2x roztwór SSC w ddH20.
Triton X-100SigmaT8787Przygotować 10% roztwór podstawowy w wodzie i przechowywać w temperaturze +4 stopni Celsjusza. Przygotować 0,5% roztwór w 1x PBS bezpośrednio przed użyciem.
10 mM Cytrynian sodu pH 6,0SigmaS1804Przygotować 100 mM roztwór podstawowy (10x). Odważyć 10,5 g kwasu cytrynowego (MW 210,14). Uwaga, drażniący i toksyczny, nosić odpowiednią maskę i rękawiczki) i rozpuścić w 400 ml wody. Dostosuj pH na 6,0 za pomocą 1 N NaOH (uwaga, drażniące, nosić rękawiczki). Dodać do 500 ml z wodą destylowaną. Przed użyciem rozcieńczyć 10x w wodzie destylowanej.
Kwas octowySigma320099 
Metanol, klasa biologii molekularnejSigma322415 
Siarczan dekstranu - MW 500,000EuromedexEU0606-A 
Rozwiązanie firmy Denhardt (100x)Euromedex1020-A 
Cement kauczukowy "FixoGum"Marabut290110000 
Zestaw do oczyszczania DNA  - Zestaw do oczyszczania Qiaquick PCRQiagen28104 
Zestaw do transkrypcji T7 in vitroAmbion Life TechnologiesAM1314 
Biotin-16-UTPRoche Nauki Stosowane11388908910 
Minikolumna oczyszczania RNAQiagen73404 
Kompleks rybonukleozydów wanadylowych NewEngland BiolabsS1402S 
H2O2SigmaH3410Przygotować 3% roztwór w wodzie destylowanej. Przechowywać w temperaturze +4 & deg; C i chronić przed światłem.
Drożdże tRNAInvitrogen15401011przygotować roztwór 10 mg/ml w wodzie wolnej od RNAzy
Normalna surowica koziaInvitrogenPCN5000 
Przeciwciała pierwszorzędowedowolny dostawcaW sekcji wyników zastosowano następujące przeciwciała pierwszorzędowe: anty-mysie CENP-A (mAb królika C51A7, Cell Signaling Technologies) i anty-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Przeciwciała drugorzędoweInvitrogen Life TechnologieFluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe rutynowo stosowane w naszym protokole to przeciwciała kozie znakowane Alexa Fluor (IgG, H+L). Przeciwciało użyte w sekcji wyników to przeciwciało przeciwko kozi królikowi z powłoką Alexa Fluor 488 (odniesienie A11001)
Zestaw do wzmacniania sygnału tyramidu (TSA) - Streptawidyna + Alexa Fluor 350 (niebieska fluorescencja)Invitrogen Life Technologies#T20937Zestawy TSA są również dostępne w zestawie Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) - Streptawidyna + Alexa Fluor 488 (zielona fluorescencja)Invitrogen Life Technologies#T20932
Hoechst 33342Invitrogen Life TechnologiesH3570Przygotuj 0,5 i mikro; g/ml roztworu w 1x PBS bezpośrednio przed użyciem. Wyrzuć pozostały roztwór.
Szkiełko nakrywkowe 22 mm x 50 mm. n° 1.5 szkłoMikroskopia elektronowa Nauki72204-04 
Podłoże montażowe ze środkiem zapobiegającym blaknięciu - VECASHIELDVector LaboratoriesH-1000Innym konwencjonalnym produktem jest Fluoromount G firmy Electron Microscopy Science
Szkiełka szklane SuperfrostFisherScientific12-550-15 
Sprzęt/materiałNota referencyjnafirmy
Igła do infekcjiSzklana mikropipeta ciągniona na gorąco. Wykonane na zamówienie.
Sprzęt do preparacjiMoria, FrancjaNożyczki i kleszcze mikrochirurgiczne
Pompa perystaltycznaCole Palmer InstrumentsEasyload Masterflex
Pompa mikrostrzykawkowa (Nano Pump)kdScientificKDS310 
KriostatLeica FrancjaCM 1510-1 
-80 stopni Celsjusza; C zamrażarkaSanyoUltra Low -80 ° C
Domowa kuchenka 
Suchy blok grzewczyEppendorf022670204 
Inkubator Fosa ślizgowaBoekel Scientific240000 
Słoik z kopinemDominique Dutscher68512 
Pojemnik na witrażDominique Dutscher68506 
Mikroskop fluorescencyjnyZeissObrazy przedstawione w sekcji wyników zostały zebrane za pomocą Zeiss AxioObserver z obiektywem 40X LD NeoFluor N.A 0.6 i 100X PlanApochromat N.A 1.3. Zestaw filtrów #38, #43 i #43. Fluorescencyjne źródło światła HXP 120. Fotometryczna kamera CCD CoolSNAP HQ2. Sygnał będzie łatwiej zaobserwowany na najnowszych mikroskopach o wysokiej wydajności, takich jak seria Zeiss AxioImager/AxioObserver, seria Nikon Ti-E/Ni-E lub seria Leica DM/DMI6000
mikrofalowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knipe, D. M., Cliffe, A. Chromatin control of herpes simplex virus lytic and latent infection. Nat. Rev. Microbiol. 6 (3), 211-221 (2008).
  2. Bloom, D. C., Giordani, N. V., Kwiatkowski, D. L. Epigenetic regulation of latent HSV-1 gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 3-4 (2010).
  3. Stevens, J. G., Wagner, E. K., Devi-Rao, G. B., Cook, M. L., Feldman, L. T. RNA complementary to a herpesvirus alpha gene mRNA is prominent in latently infected neurons. Science. 235 (4792), 1056-1059 (1987).
  4. Zwaagstra, J., Ghiasi, H., Nesburn, A. B., Wechsler, S. L. In vitro promoter activity associated with the latency-associated transcript gene of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 70, 2163-2169 (1989).
  5. Farrell, M. J., Dobson, A. T., Feldman, L. T. Herpes simplex virus latency-associated transcript is a stable intron. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (3), 790-794 (1991).
  6. Umbach, J. L., Kramer, M. F., Jurak, I., Karnowski, H. W., Coen, D. M., Cullen, B. R. MicroRNAs expressed by herpes simplex virus 1 during latent infection regulate viral mRNAs. Nature. 454 (7205), 780-783 (2008).
  7. Jurak, I., Kramer, M. F., et al. Numerous conserved and divergent microRNAs expressed by herpes simplex viruses 1 and 2. J. Virol. 84 (9), 4659-4672 (2010).
  8. Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10 (3), 419-443 (1997).
  9. Held, K., Junker, A., et al. Expression of herpes simplex virus 1-encoded microRNAs in human trigeminal ganglia and their relation to local T-cell infiltrates. J. Virol. 85 (19), 9680-9685 (2011).
  10. Held, K., Eiglmeier, I., et al. Clonal expansions of CD8⁺ T cells in latently HSV-1-infected human trigeminal ganglia. J. Neurovirol. 18 (1), 62-68 (2012).
  11. Sawtell, N. M. Comprehensive quantification of herpes simplex virus latency at the single-cell level. J. Virol. 71 (7), 5423-5431 (1997).
  12. Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72 (7), 5343-5350 (1998).
  13. Bertke, A. S., Swanson, S. M., Chen, J., Imai, Y., Kinchington, P. R., Margolis, T. P. A5-positive primary sensory neurons are nonpermissive for productive infection with herpes simplex virus 1 in vitro. J. Virol. 85 (13), 6669-6677 (2011).
  14. Bertke, A. S., Ma, A., Margolis, M. S., Margolis, T. P. Different mechanisms regulate productive herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 infections in adult trigeminal neurons. J. Virol. 87 (11), 6512-6516 (2013).
  15. Kobayashi, M., Kim, J. Y., et al. A primary neuron culture system for the study of herpes simplex virus latency and reactivation. J. Vis. Exp. (62), (2012).
  16. Kim, J. Y., Mandarino, A., Chao, M. V., Mohr, I., Wilson, A. C. Transient reversal of episome silencing precedes VP16-dependent transcription during reactivation of latent HSV-1 in neurons. PLoS Pathog. 8 (2), (2012).
  17. Zerboni, L., Che, X., Reichelt, M., Qiao, Y., Gu, H., Arvin, A. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J. Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
  18. Mehta, A., Maggioncalda, J., et al. In situ DNA PCR and RNA hybridization detection of herpes simplex virus sequences in trigeminal ganglia of latently infected mice. Virology. 206 (1), 633-640 (1995).
  19. Chen, X. -P., Mata, M., Kelley, M., Glorioso, J. C., Fink, D. J. The relationship of herpes simplex virus latency associated transcript expression to genome copy number: a quantitative study using laser capture microdissection. J. Neurovirol. 8 (3), 204-210 (2002).
  20. Proenca, J. T., Coleman, H. M., Connor, V., Winton, D. J., Efstathiou, S. A historical analysis of herpes simplex virus promoter activation in vivo reveals distinct populations of latently infected neurones. J. Gen. Virol. 89, 2965-2974 (2008).
  21. Nicoll, M. P., Proença, J. T., Connor, V., Efstathiou, S. Influence of herpes simplex virus 1 latency-associated transcripts on the establishment and maintenance of latency in the ROSA26R reporter mouse model. J. Virol. 86 (16), 8848-8858 (2012).
  22. Catez, F., Picard, C., et al. HSV-1 Genome Subnuclear Positioning and Associations with Host-Cell PML-NBs and Centromeres Regulate LAT Locus Transcription during Latency in Neurons. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
  23. Solovei, I., Grasser, F., Lanctôt, C. FISH on Histological Sections. CSH Protoc. , (2007).
  24. Labetoulle, M., Kucera, P., et al. Neuronal propagation of HSV1 from the oral mucosa to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (9), 2600-2606 (2000).
  25. Labetoulle, M., Maillet, S., Efstathiou, S., Dezelee, S., Frau, E., Lafay, F. HSV1 latency sites after inoculation in the lip: assessment of their localization and connections to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (1), 217-225 (2003).
  26. Maillet, S., Naas, T., et al. Herpes simplex virus type 1 latently infected neurons differentially express latency-associated and ICP0 transcripts. J. Virol. 80 (18), 9310-9321 (2006).
  27. Tanaka, M., Kagawa, H., Yamanashi, Y., Sata, T., Kawaguchi, Y. Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo. J. Virol. 77 (2), 1382-1391 (2003).
  28. Gierasch, W. W., Zimmerman, D. L., Ward, S. L., Vanheyningen, T. K., Romine, J. D., Leib, D. A. Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-1 strains 17 and KOS. J. Virol. Methods. 135 (2), 197-206 (2006).
  29. Nagel, C. -H., Döhner, K., et al. Nuclear egress and envelopment of herpes simplex virus capsids analyzed with dual-color fluorescence HSV1(17). J. Virol. 82 (6), 3109-3124 (2008).
  30. Arthur, J., Efstathiou, S., Simmons, A. Intranuclear foci containing low abundance herpes simplex virus latency-associated transcripts visualized by non-isotopic in situ hybridization. J. Gen. Virol. 74, 1363-1370 (1993).
  31. Pileri, S. A., Roncador, G., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J. Pathol. 183, 116-123 (1997).
  32. Saito, N., Konishi, K., Takeda, H., Kato, M., Sugiyama, T., Asaka, M. Antigen retrieval trial for post-embedding immunoelectron microscopy by heating with several unmasking solutions. J. Histochem. Cytochem. 51 (8), 989-994 (2003).
  33. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J. Cell Biol. 134 (4), 815-826 (1996).
  34. Sourvinos, G., Everett, R. D. Visualization of parental HSV-1 genomes and replication compartments in association with ND10 in live infected cells. EMBO J. 21 (18), 4989-4997 (2002).
  35. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J. Virol. 81 (20), 10991-11004 (2007).
  36. Margolis, T. P., Imai, Y., Yang, L., Vallas, V., Krause, P. R. Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) establishes latent infection in a different population of ganglionic neurons than HSV-1: role of latency-associated transcripts. J. Virol. 81 (4), 1872-1878 (2007).
  37. Imai, Y., Apakupakul, K., Krause, P. R., Halford, W. P., Margolis, T. P. Investigation of the mechanism by which herpes simplex virus type 1 LAT sequences modulate preferential establishment of latent infection in mouse trigeminal ganglia. J. Virol. 83 (16), 7873-7882 (2009).
  38. Shi, S. -R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 13-32 (2011).
  39. Lu, X., Triezenberg, S. J. Chromatin assembly on herpes simplex virus genomes during lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 217-222 (2010).
  40. Placek, B. J., Berger, S. L. Chromatin dynamics during herpes simplex virus-1 lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 223-227 (2010).
  41. Eshleman, E., Shahzad, A., Cohrs, R. J. Varicella zoster virus latency. Future Virol. 6 (3), 341-355 (2011).
  42. Paulus, C., Nitzsche, A., Nevels, M. Chromatinisation of herpesvirus genomes. Rev. Med. Virol. 20 (1), 34-50 (2010).
  43. Nitzsche, A., Paulus, C., Nevels, M. Temporal dynamics of cytomegalovirus chromatin assembly in productively infected human cells. J. Virol. 82 (22), 11167-11180 (2008).
  44. Zhou, J., Chau, C. M., et al. Cell cycle regulation of chromatin at an origin of DNA replication. EMBO J. 24 (7), 1406-1417 (2005).
  45. Day, L., Chau, C. M., Nebozhyn, M., Rennekamp, A. J., Showe, M., Lieberman, P. M. Chromatin profiling of Epstein-Barr virus latency control region. J. Virol. 81 (12), 6389-6401 (2007).
  46. Arvey, A., Tempera, I., Lieberman, P. M. Interpreting the Epstein-Barr Virus (EBV) Epigenome Using High-Throughput Data. Viruses. 5 (4), 1042-4254 (2013).
  47. Lu, F., Day, L., Gao, S. -J., Lieberman, P. M. Acetylation of the latency-associated nuclear antigen regulates repression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus lytic transcription. J. Virol. 80 (11), 5273-5282 (2006).
  48. Günther, T., Grundhoff, A. The epigenetic landscape of latent Kaposi sarcoma-associated herpesvirus genomes. PLoS Pathog. 6 (6), (2010).
  49. Toth, Z., Maglinte, D. T., et al. Epigenetic analysis of KSHV latent and lytic genomes. PLoS Pathog. 6 (7), (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

HSV 1 DetectionFluorescent In Situ HybridizationNeuronal Tissue AnalysisTrigeminal Ganglion SectioningHeat Based Antigen UnmaskingDNA RNA Protein Triple StainingConfocal Microscopy ImagingViral Genome LocalizationLatent Virus DetectionSingle Cell Codetection

Powiązane artykuły