Artykuł metodologiczny

Wizualizacja synapsy immunologicznej za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED (Time-Gated Stimulated Emission Depletion)

DOI:

10.3791/51100

⸱

24 marca 2014

 , 
1Center for Human Immunobiology, Texas Children's Hospital and Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj ilustrujemy protokół obrazowania za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED, cytotoksycznej synapsy immunologicznej komórek NK rekapitulowanej na szkle. Za pomocą tej metody uzyskujemy rozdzielczość sub-100 nm białek synapsy i cytoszkieletu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki NK tworzą ściśle regulowane, precyzyjnie dostrojone synapsy immunologiczne (IS) w celu lizy komórek zakażonych wirusowo lub rakotwórczych. Dynamiczna reorganizacja aktyny ma kluczowe znaczenie dla funkcjonowania komórek NK i tworzenia IS. Obrazowanie F-aktyny w synapsie tradycyjnie wykorzystuje mikroskopię konfokalną, jednak granica dyfrakcji światła ogranicza rozdzielczość mikroskopii fluorescencyjnej, w tym konfokalnej, do około 200 nm. Ostatnie postępy w technologii obrazowania umożliwiły rozwój obrazowania superrozdzielczego z ograniczoną subdyfrakcją. Aby zobrazować architekturę F-aktyny w IS, podsumowujemy cytotoksyczną synapsę komórek NK poprzez przyleganie komórek NK do aktywującego receptora na szkle. Następnie obrazujemy interesujące nas białka za pomocą dwukolorowej mikroskopii zubożenia emisji stymulowanej (STED). Daje to rozdzielczość <80 nm w synapsie. W niniejszym artykule opisujemy etapy przygotowania próbki i akwizycji obrazów za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED w celu wizualizacji F-aktyny w NK IS. Ilustrujemy również optymalizację pozyskiwania próbek za pomocą oprogramowania Leica SP8 i bramkowanego czasowo STED. Na koniec wykorzystujemy oprogramowanie Huygens do dekonwolucji obrazów w post-processingu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synapsa immunologiczna to złożone środowisko białek sygnałowych i elementów cytoszkieletu. Synapsa cytolityczna została pierwotnie opisana jako mająca strukturę podobną do "strzału w dziesiątkę" z pierścieniem aktyny i cząsteczkami adhezyjnymi otaczającymi centralną domenę wydzielniczą1-4. Jednak teraz wiemy, że składa się z mikroskopijnych domen aktywnej sygnalizacji, które wymagają ciągłej dynamicznej reorganizacji cytoszkieletu dla funkcji5-11. Wiele informacji, które obecnie posiadamy na temat synaps, pochodzi z mikroskopii, a immunolodzy jako pierwsi przyjęli najnowocześniejszą technologię obrazowania.

Jedną z takich nowatorskich technologii jest mikroskopia superrozdzielcza. Konwencjonalna mikroskopia świetlna jest ograniczona przestrzennie przez barierę dyfrakcyjną światła, która wyznacza dolną granicę rozdzielczości dla całej mikroskopii fluorescencyjnej, w tym konfokalnej, na około 200 nm. W ostatnich latach opracowano kilka technik, które pozwalają na rozdzielczość poniżej bariery dyfrakcyjnej. Należą do nich mikroskopia zubożenia emisji stymulacji (STED), mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM), mikroskopia stochastycznie rozdzielcza (STORM) i mikroskopia światła fotoaktywowanego (PALM). Techniki te zostały szczegółowo omówione w innym miejscu12-15, ale są opisane poniżej. Ograniczona rozdzielczość subdyfrakcji jest generowana w unikalny sposób w każdym systemie. Wybór techniki super-rozdzielczości powinien być zatem podyktowany eksperymentem i systemem eksperymentalnym, który nas interesuje.

STED super rozdzielczość osiąga się za pomocą wiązki zubożenia torroidalnego o wysokiej intensywności, która selektywnie "wycisza" fluorescencję wokół każdego interesującego nas fluoroforu po wzbudzeniu, co skutkuje mikroskopią fluorescencji ograniczoną do subdyfrakcji16-18. Jedną z zalet STED jest to, że akwizycja obrazu jest szybka i wymaga stosunkowo niewielkiej obróbki końcowej. Podczas gdy wybór barwnika jest podyktowany położeniem widmowym wiązki zubożającej, która w dostępnym na rynku systemie znajduje się na długości fali 592 nm, dostępnych na rynku jest kilka dostępnych na rynku barwników, które umożliwiają kombinację dwóch fluoroforów. Ponadto można obrazować powszechnie stosowane reportery fluorescencyjne, takie jak GFP, co umożliwia eksperymenty z żywymi komórkami19,20.

Wcześniej używaliśmy STED do identyfikacji i ilościowego określania regionów hipogęstości F-aktyny, które są wykorzystywane przez komórki NK do degranulacji21,22. Sugerujemy, że STED jest dobrym wyborem do obrazowania synapsy immunologicznej ze względu na stosunkowo elastyczną dostępność fluoroforów i lepszą poprawę rozdzielczości w osi x-y. Ponadto, w dostępnym na rynku systemie STED wykorzystywanym w tych eksperymentach, zastosowanie szybkiego (12 000 Hz) skanera rezonansowego pozwala na szybkie pozyskiwanie obrazów przy minimalnym uszkodzeniu próbek. Ograniczona elastyczność w doborze barwników jest uważana za wadę STED12, jednak dwukolorowy STED jest stosunkowo prosty z kilkoma dostępnymi na rynku fluoroforami. Integracja STED z laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym pozwala również na dodatkowe obrazowanie konfokalne w połączeniu z STED, więc podczas gdy STED jest ograniczony do dwóch kanałów, dodatkowe struktury mogą być obrazowane w konfokalnym z rozdzielczością około 200 nm (E. Mace, obserwacje niepublikowane). Chociaż opisujemy zastosowanie STED do obrazowania komórek odpornościowych, technologia ta jest stosowana do różnych typów komórek, w tym komórek nerwowych, oraz do wizualizacji różnych struktur komórkowych23-26.

SIM używa innego podejścia do generowania obrazów ograniczonych subdyfrakcją. Poprzez wizualizację znanych wzorców okresowego wzbudzenia, można następnie uzyskać informacje o nieznanej strukturze badanej po transformacji matematycznej27. Daje to wzrost rozdzielczości do ~100 nm w bok28,29. Zaletą karty SIM jest to, że jest kompatybilna ze wszystkimi standardowymi barwnikami i sondami konfokalnymi, jednak wadą jest to, że pozyskiwanie obrazów jest znacznie wolniejsze, a te wymagają długiego przetwarzania końcowego12. Ogranicza to również jego zastosowanie do obrazowania żywych komórek.

Na koniec, obrazy o super rozdzielczości mogą być generowane przez stochastyczne przełączanie foto-fluoroforów. Podejście to jest wykorzystywane w mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej światłem (PALM) i stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (STORM). Skanując wiele klatek kamery i lokalizując losowo aktywowane cząsteczki, które są "włączane" i "wyłączane" w czasie, obrazy o rozdzielczości 20-30 nm są generowane ze skumulowanych klatek30-32 . Wadą tej rozdzielczości jest czas potrzebny na pozyskanie obrazów.

Tutaj pokazujemy szczegółowo protokół przygotowania i obrazowania próbek dwukolorowych w STED. W tym systemie wzbudzenie odbywa się za pomocą impulsowego, przestrajalnego lasera ze światłem białym. Ze względu na charakter impulsowej wiązki wzbudzenia, możliwe jest bramkowanie czasowe detekcji, co dodatkowo zwiększa rozdzielczość. Ponadto system jest wyposażony w hybrydowe detektory gadolinu (HyD), które są bardziej czułe niż konwencjonalne lampy fotopowielaczy, co pozwala na mniejsze zapotrzebowanie na moc lasera. Wiązka zubożająca dla STED jest stosowana w sposób ciągły i jest dostrojona do 592 nm, co będzie dyktować wybór barwników dostępnych dla dwóch kolorów STED. Powszechnie stosowane kombinacje barwników obejmują zazwyczaj jedną pobudliwą o długości 488 nm (taką jak Alexa Fluor 488, Oregon Green, DyLights green lub Chromeo 488) i jedną pobudliwą o długości 458 nm (taką jak Pacific Orange lub Horizon V500). Tak więc, podczas gdy wykrywanie dwóch barwników będzie w podobnym zakresie (i oba są dostępne za pomocą lasera zubożającego), wzbudzenie będzie następować przy różnych długościach fal. Dzięki przestrajalnemu laserowi światła białego i przestrajalnym detektorom maksymalizacja sygnału przy jednoczesnej eliminacji nakładania się widma jest dość łatwa. W związku z tym odnieśliśmy duży sukces dzięki kombinacjom dostępnych na rynku barwników, takich jak Pacific Orange i Alexa Fluor 488 (stosowany tutaj). Nasz protokół jest dostosowany i opisuje ocenę ludzkich komórek NK, ponieważ reprezentuje to historyczne skupienie naszego laboratorium. W tym przykładzie wykorzystujemy w szczególności linię komórkową NK92, ponieważ jest to jedna z tych, które regularnie stosowaliśmy w naszych pracach eksperymentalnych21,33.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pokryj szkiełka nakrywkowe przeciwciałem

  1. Rozgrzej (w temperaturze 37 °C) 30 ml pożywki RPMI 10% FCS i 1 ml BD Cytofix/Cytoperm.
  2. Przygotować roztwór 5 μg/ml oczyszczonego przeciwciała w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS). Do aktywacji linii komórkowej NK92 zaleca się stosowanie anty-CD18 i anty-NKp30.
    1. Zaznacz jedno kółko o wielkości około dziesięciocentówki dla każdego warunku na szkiełku nakrywkowym #1.5 za pomocą pisaka PAP. W przypadku eksperymentu z dwoma kolorami powinny istnieć cztery warunki: niebarwiony, podwójnie barwiony i dwa warunki pojedynczo barwione. Dozować 200 μl roztworu przeciwciał w każdym regionie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    2. Szkiełka nakrywkowe należy umyć, delikatnie zanurzając je w 50 ml PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej. Mycie powinno nastąpić bezpośrednio przed dodaniem komórek i należy zachować ostrożność, aby uniknąć wysuszenia przeciwciał na szkiełku nakrywkowym.

2. Aktywuj komórki NK na szkiełkach nakrywkowych; Naprawa i przepuszczalność

  1. Wyizoluj 5 x 105 komórek NK92 na warunek. Odwirować i zdekantować supernatant. Przemyć raz 10 ml podgrzanego podłoża z kroku 1.1. Odwirować i zdekantować supernatant.
    1. Zawiesić komórki w podgrzanym podłożu z kroku 1.1 w stężeniu 2,5 x 106/ml.
    2. Delikatnie zdekantować 200 μl do środka obszaru utworzonego w sekcji 1.2.1. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut w temperaturze 5% CO2 . (Uwaga: czas ten może być wydłużony lub skrócony w zależności od interesującej nas funkcji biologicznej. Do polaryzacji granulek komórek NK wystarczy 20 min).
  2. Po inkubacji komórek delikatnie umyć szkiełka nakrywkowe, zanurzając każde z nich w 50 ml PBS o temperaturze pokojowej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  3. Dodać 1 μl Triton X-100 do 1 ml podgrzanego roztworu Fix/Perm z kroku 1.1 i dokładnie wymieszać. Utrwal i przepuszczalność, dodając 200 μl buforu Fix/Perm (krok 2.3) do komórek. Inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.

3. Plamy

  1. Przygotować bufor barwiący: sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1% BSA, 0,1% saponina.
    1. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego w 200 μl buforu barwiącego (patrz krok 3.1). (Uwaga: przeciwciała należy miareczkować przed użyciem). Należy unikać stosowania przeciwciała pierwszorzędowego, które jest wytwarzane u tego samego gatunku, który jest używany do powlekania szkiełka nakrywkowego (krok 1.2). Należy również unikać połączeń strepatiwidyna-biotyna w obrazowaniu chorób przenoszonych drogą płciową.
    2. Zgodnie z sekcją 2.3.1 delikatnie umyć szkiełka nakrywkowe w 50 ml buforu barwiącego. Przetrzyj krawędzie obszaru pióra PAP bawełnianym wacikiem, aby usunąć nadmiar buforu. Zastosować roztwór przeciwciał utworzony w sekcji 3.1.1. Inkubować 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. (Zalecane: inkubować szkiełka nakrywkowe w pudełku na szkiełka z wilgotnym ręcznikiem papierowym, aby utrzymać wilgotność).
  2. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego w 200 μl buforu barwiącego. Zalecane fluorofory to Alexa Fluor 488, Pacific Orange i V500. Ogólnie rzecz biorąc, rozcieńczenie 1:200 jest odpowiednie do obrazowania STED.
    1. Delikatnie umyj szkiełka nakrywkowe w 50 ml buforze barwiącym. Przetrzyj krawędzie obszaru pióra PAP bawełnianym wacikiem, aby usunąć nadmiar buforu. Zastosuj drugorzędowy roztwór przeciwciał. Inkubować 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
  3. Powtórz mycie i barwienie, aby uzyskać dodatkowe interesujące białka. W przypadku wykrycia F-aktyny z falloidyną, można ją dołączyć do przeciwciała drugorzędowego, zwykle w rozcieńczeniu 1:200.

4. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na slajdach

  1. Przygotuj podłoże montażowe. Uwaga: Preferowane są Prolong lub Prolong Gold. Należy unikać stosowania VECTASHIELD, ponieważ nie jest on kompatybilny z chorobami przenoszonymi drogą płciową. W przypadku stosowania falloidyny należy unikać stosowania 2,2-tiodioetanolu. Mowiol jest akceptowalny.
  2. Umieść około 10-20 μl podłoża montażowego na szkiełku. Odwróć szkiełko nakrywkowe (stroną z komórką do dołu) i delikatnie zamontuj szkiełko nakrywkowe, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Inkubować szkiełka podstawowe przez 24 godziny (szkiełko nakrywkowe do góry) przed obrazowaniem.
  3. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci.

5. Konfiguracja eksperymentalna

  1. Uruchom wymagane lasery i oprogramowanie. Zainicjuj laser wyczerpujący STED przy 100% mocy. Align STED laser, który w przypadku systemów komercyjnych jest często zabiegiem zautomatyzowanym.
  2. Skupić próbkę, zaczynając od pojedynczej barwionej kontroli, na mikroskopie za pomocą okularów.

6. Optymalizacja ustawień

  1. Zeskanuj pierwszy kanał i zoptymalizuj moc lasera, położenie wiązki wzbudzenia i zasięg detektora. Jeśli to możliwe, unikaj zysku w wysokości 100 >. Przechwyć obraz w trybie konfokalnym, aby zoptymalizować ustawienia. Uśrednianie linii i/lub klatek zwiększy rozdzielczość. Sprawdź nasycenie pikseli. Uwaga: Pewne nasycenie jest dopuszczalne w konfokalnym, ponieważ zastosowanie STED zmniejszy intensywność emisji. W przypadku STED optymalny rozmiar piksela będzie wynosił poniżej 30 nm, jednak lepszą rozdzielczość uzyska się przy mniejszych rozmiarach pikseli. Rozmiar obszaru zainteresowania, który jest obrazowany, będzie dyktował dolną granicę rozmiaru piksela. Mniejsze rozmiary pikseli mogą zwiększyć fotowybielanie.
    1. Zastosuj wiązkę zubożającą STED i uchwyć obraz, zaczynając od 50% mocy lasera zubożającego. Jeśli zauważalna jest poprawa rozdzielczości, można zastosować większą moc lasera zubożającego. Na tym etapie może być konieczne dostosowanie mocy lasera wzbudzenia, średniej linii i/lub wzmocnienia.
    2. Zastosuj bramkowanie czasowe, aby zmniejszyć tło (minimum 0,3 nsec). Dostosuj ustawienia, aż będzie widoczna poprawa rozdzielczości w stosunku do konfokalnej. Rozdzielczość można przybliżyć, szacując połowę maksimum na całej szerokości (FWHM). Reprezentuje to odległość o połowie maksymalnej intensywności piku Gaussa utworzonego przez narysowanie profilu liniowego w poprzek struktury będącej przedmiotem zainteresowania i jest szeroko stosowaną metodą szacowania rozdzielczości.
    3. Gdy pierwszy kanał będzie zadowalający, zainicjuj drugą sekwencję skanowania sekwencyjnego. Ogólnie rzecz biorąc, najlepiej jest najpierw zeskanować fluorofor o dłuższej długości fali. Powtórz krok 6.1 na drugim kanale.
  2. Potwierdź brak nakładania się spektralnego, obrazując pojedyncze barwione kontrole z obiema sekwencjami skanowania. Łagodne nakładanie się widma można skorygować za pomocą funkcji usuwania spektralnego w oprogramowaniu, jednak należy tego unikać, jeśli to możliwe.

7. Akwizycja obrazu

  1. Pobieranie obrazów. W przypadku obrazowania ilościowego zaleca się uzyskanie co najmniej 20 obrazów/warunek. Dokładna liczba powinna być jednak określona zgodnie z pytaniem eksperymentalnym w połączeniu z podejściem statystycznym, takim jak obliczanie wielkości próby. Zapisz eksperyment.

8. Dekonwolucja

  1. Otwórz plik za pomocą oprogramowania do dekonwolucji lub procesora wsadowego. Sprawdź parametry dla każdego kanału za pomocą oprogramowania. Potwierdź widma wzbudzenia i emisji każdego kanału, emisję zubożenia STED i kierunek obrazowania (w górę lub w dół, jeśli obraz jest trójwymiarowy).
  2. Dekonwolucjonizuj za pomocą kreatora dekonwolucji. Ustawienia domyślne są na ogół odpowiednie, jednak stosunek sygnału do szumu (SNTR) będzie się różnił w zależności od fluoroforu i będzie musiał być określony dla każdego kanału i każdego eksperymentu indywidualnie.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczywiście, głównym celem obrazowania w superrozdzielczości będzie poprawa w stosunku do konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej. Istnieją jednak pewne typowe pułapki, które mogą prowadzić do nieoptymalnej rozdzielczości. Wymagają one, aby każdy eksperyment był optymalizowany indywidualnie. W naszym reprezentatywnym eksperymencie obrazujemy sieć F-aktyny w komórce NK aktywowanej przez przeciwciało związane ze szkłem. Najczęstsze przyczyny (i korekcje) braku lepszej rozdzielczości STED w porównaniu z konfokalnymi są następujące:

  1. Niedostateczne pobieranie próbek (rysunek 1a). Może to prowadzić do ziarnistości i utraty informacji o pikselach, na co wskazuje słaba rozdzielczość filamentów F-aktyny. Zwiększone uśrednianie linii lub klatek często może to skorygować.
  2. Bielenie i/lub nadmierne pobieranie próbek (rysunek 1b). Może to być spowodowane długim czasem przebywania pikseli w wyniku nadmiernego uśredniania linii. Alternatywnie może to być wynikiem nadmiernego skanowania obrazu przed akwizycją, w tym nadmiernego użycia lasera zubożającego. Powoduje to często zamglone lub rozmyte obrazy. Można to skorygować, skanując pole zainteresowania tylko w minimalnym stopniu przed uzyskaniem lub, jeśli to możliwe, zwiększając prędkość skanowania laserowego. Jeśli problem będzie się powtarzał, można zmniejszyć moc lasera wyczerpującego się.

Poprzez osiągnięcie prawidłowej równowagi między czasem przebywania pikseli, mocą lasera wzbudzenia i mocą lasera zubożającego, można wygenerować obraz o zwiększonej rozdzielczości i wystarczającej ilości informacji (Rysunek 1c). Rozdzielczość można jeszcze bardziej poprawić, stosując dekonwolucję (rysunek 1d). Gdy akwizycja jest zoptymalizowana, dekonwolucja poprawi rozdzielczość zarówno jakościowo, jak i ilościowo, a rozdzielczość poniżej 100 nm powinna być rutynowo osiągalna.

figure-results-1
Rysunek 1. Optymalizacja akwizycji i typowe pułapki obrazowania chorób przenoszonych drogą płciową. Komórki NK92 aktywowano na szkle powlekanym anty-CD18 i -NKp30 przez 20 minut, a następnie utrwalono, przeniknięto i wybarwiono na F-aktynę za pomocą Phalloidin Alexa Fluor 488. a) Przykład utraty informacji o obrazie z powodu niedostatecznego próbkowania. b) Przykład utraty rozdzielczości z powodu bielenia/nadpróbkowania c) warunki zoptymalizowane d) zoptymalizowane warunki prowadzą do większej poprawy rozdzielczości dzięki dekonwolucji. Podziałka = 5 μm.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poprawa rozdzielczości w stosunku do konfokalnej będzie w pewnym stopniu zależna od czynników, których nie można kontrolować. Czynniki te obejmują drobne aberracje w grubości szkiełka nakrywkowego i niespójności w mediach montażowych. Ważne jest, aby temperatura i wilgotność w pomieszczeniu do obrazowania były jak najbardziej spójne, a wiązka STED powinna być ponownie ustawiana co około 60 minut. Jak wspomniano w procedurach, należy unikać stosowania medium montażowego VECTASHIELD, ponieważ nie jest ono kompatybilne z STED. Oprócz tego należy zawsze używać szkiełek nakrywkowych #1,5, a jeśli są dostępne, używać tych, które zostały sprawdzone do określonej grubości.

Jedną z modyfikacji opisanego tutaj podejścia jest obrazowanie dodatkowych kanałów w konfokalu, przy użyciu fluoroforów, które emitują na większej długości fali niż wiązka STEM. W ten sposób można obrazować do czterech kanałów (dwa w konfokalu, dwa w STED). Jeśli jednak przyjmiemy to podejście, kanały z fluoroforami emitującymi powyżej lasera zubożającego STED będą musiały zostać najpierw zobrazowane, ponieważ zastosowanie wiązki STED spowoduje wyczerpanie fotonów w tych kanałach. Jedną z zalet tej techniki jest zastosowanie bramkowania czasowego, które również poprawi rozdzielczość w konfokalnym poprzez wyeliminowanie emisji z fotonów o krótkim czasie życia34. W szczególności zastosowanie bramkowania czasowego, czyli taktowania detektorów emisji odpowiadającego wzbudzeniu impulsowemu STED, zmniejszy fluorescencję tła od odbicia od szkła nakrywkowego podczas obrazowania z bliska. Nawet w eksperymencie, który nie nadaje się do STED, jeśli używasz impulsowego źródła wzbudzenia, bramkowanie czasowe może być użytecznym narzędziem do poprawy rozdzielczości w konfokalu.

Istnieją różne modyfikacje, które można wykorzystać do poprawy rozdzielczości w STED. Jednym z nich jest zmniejszenie rozmiaru otworu w stosunku do standardowej jednostki 1 Airy, chociaż zmniejszy to również ilość światła docierającego do próbki. Można to skompensować poprzez zwiększenie mocy lub wzmocnienia lasera. Innym jest zwiększenie średniej liniowej, co zwiększy ilość informacji zbieranych dla każdego fotonu, poprawiając rozdzielczość. Również w tym przypadku może się to jednak odbyć kosztem fotowybielania próbki, dlatego konieczne będzie znalezienie równowagi między rozdzielczością a wybielaniem. Podobnie, stosowanie białek fluorescencyjnych, takich jak GFP, będzie wymagało starannej optymalizacji, aby uniknąć wybielania. W razie potrzeby można to osiągnąć poprzez zmniejszenie mocy lasera STED. Dłuższe punkty czasowe pozwolą również na większą regenerację fotonów i zmniejszenie bielenia. Korekta fotowybielania powinna być uwzględniona podczas analizy żywej choroby przenoszonej drogą płciową.

Oczywiście możliwe jest również obrazowanie w 3 wymiarach w STED, które również da poprawę w stosunku do konwencjonalnego obrazowania konfokalnego. Jest to szczególnie ważne, jeśli odbywa się to w połączeniu z dekonwolucją, chociaż należy zachować ostrożność, aby skorygować dryft, który występuje podczas obrazowania wielu płaszczyzn w osi z. W przypadku korzystania z oprogramowania Huygens do dekonwolucji, korekcję tę uzyskuje się za pomocą funkcji "stabilizacji obrazu". Dzięki takiemu podejściu poprawi się rozdzielczość w osi z. Jest to ogromna poprawa w porównaniu z konwencjonalnym obrazowaniem konfokalnym, które ma słabą rozdzielczość osiową, a nawet w porównaniu z samym STED, który również ma stosunkowo słabą rozdzielczość osi z. Podczas pozyskiwania wielu stosów w STED należy zachować ostrożność, aby uniknąć wybielania próbki, a w razie potrzeby można w tym celu zmniejszyć uśrednianie linii lub intensywność mocy lasera. Ponownie należy zauważyć, że w przypadku obrazowania innych fluoroforów, które nie są odpowiednie dla STED, zastosowanie wiązki zubożającej w pierwszym sekwencyjnym skanie zapobiegłoby emisji z tych kanałów. W związku z tym podejście mieszane STED/konfokalne (przy użyciu skanowania konfokalnego w kanałach, które emitują o długości fali większej niż 592 nm) niestety nie będzie odpowiednie dla 3D.

Podsumowując, wybraliśmy STED jako podejście ze względu na jego względną łatwość aplikacji i poprawę rozdzielczości w porównaniu ze standardowym obrazowaniem konfokalnym. W obrazowaniu synapsy immunologicznej okazał się skuteczną i cenną techniką, która pozwala nam dostrzec szczegóły w architekturze F-aktyny, które nie są możliwe w rozdzielczości powyżej 200 nm. Chociaż wiele z tych szczegółów wydaje się subtelnych, mogą one mieć głęboki wpływ na funkcjonowanie komórek NK. W ten sposób stosujemy najnowszą technologię obrazowania nanoskopowego do uzyskiwania informacji, które mają kluczowe znaczenie dla utrzymania zdrowia ludzkiego.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Częściowy koszt publikacji tego artykułu został pokryty przez Leica Microsystems, Inc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Geoffowi Danielsowi za pomoc techniczną. Praca ta została sfinansowana przez R01 AI067946 J.S.O.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#1.5 Szkiełka nakrywkoweVWR48393-172
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences554722
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA2153
Aplikator z bawełnianą końcówkąFisher ScientificS450941
Probówki wirówkowe Falcon (50 ml)VWR352070
Surowica cielęca płodu (FCS) (500 ml)Atlantic BiologicalsS11050
Kozia anty-królik Pacific OrangeLife TechnologiesP31584
Wycieraczki laboratoryjneVWR82003-820
Lakier do paznokciVWR100491-940
Komórki NK-92ATCCCRL-2407
Falloidyna Alexa Fluor 488Life TechnologiesA12379
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiLife Technologies14190250
Przedłużony odczynnik zapobiegający blaknięciuLife TechnologiesP7481
Oczyszczony anty-CD18Biolegend301202
Oczyszczony anty-NKp30Biolegend325202
Oczyszczony anty-perforynaBiolegend308102
RPMI 1640 podłoże ( 500 ml)Life Technologies11875-093
Saponina z kory QuillajaSigmaS4521
Długopis Super PAPLife Technologies008899
Triton X-100Mikroskopia elektronowa Nauki22142
Oprogramowanie do dekonwolucji HuygensaSVISkontaktuj się z firmą
Leica SP8 TCS STEDLeica Firma Microsystemsskontaktuj się z firmą
mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges. Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).
  2. Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  3. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  4. Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).
  5. Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses. J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).
  6. Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).
  7. Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses. Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).
  8. Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
  9. Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses. Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).
  10. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
  11. Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  12. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).
  13. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
  14. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).
  15. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front. Immunol. 3, 421 (2012).
  16. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
  17. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).
  18. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  19. Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP. Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).
  20. Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. Nanoscale resolution in GFP-based microscopy. Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).
  21. Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
  22. Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
  23. Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy. Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).
  24. Tonnesen, J., Nagerl UV, Superresolution imaging for neuroscience. Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).
  25. Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held. PLoS One. 8 (4), (2013).
  26. Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).
  27. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).
  28. Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination). Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  29. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  30. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).
  31. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  32. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  33. Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological. J. Exp. Med. Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski,, Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. 204 (10), 2305-2320 (2007).
  34. Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki Natural Killerwizualizacja F aktynydwukolorowy STEDSTED z bramkowaniem czasowymmikroskopia konfokalnadekonwolucja obrazuoprogramowanie Leica SP8oprogramowanie Huygensobrazowanie subdyfrakcyjne

Powiązane artykuły