Method Article

Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15N i ilościowej spektrometrii mas

DOI:

10.3791/51103

⸱

March 13th, 2014

 ,  ,  , 
1Institute of Plant Biology and Biotechnology, University of Münster, 2Department of Plant Biology, Carnegie Institution for Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane porównawcze, ilościowe podejście proteomiczne ma na celu uzyskanie wglądu w skład kompleksów wielobiałkowych w różnych warunkach i jest demonstrowane przez porównanie genetycznie różnych szczepów. Do analizy ilościowej równe objętości różnych frakcji z gradientu gęstości sacharozy miesza się i analizuje za pomocą spektrometrii mas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzony protokół dostarcza narzędzie do analizy kompleksów wielobiałkowych w błonie tylakoidów, ujawniając wgląd w złożony skład w różnych warunkach. W tym protokole podejście to zostało zademonstrowane poprzez porównanie składu kompleksu białkowego odpowiedzialnego za cykliczny przepływ elektronów (CEF) u Chlamydomonas reinhardtii, wyizolowanego z genetycznie różnych szczepów. Procedura obejmuje izolację błon tylakoidowych, a następnie ich rozdzielenie na kompleksy wielobiałkowe poprzez wirowanie w gradionym spadku gęstości sacharozy, SDS-PAGE, immunodetekcję i porównawczą, ilościową spektrometrię mas (MS) opartą na różnicowym znakowaniu metabolicznym (14N/15N) analizowanych szczepów. Błony tylakoidowe rozpuszczone w detergentach są ładowane na gradienty gęstości sacharozy przy równym stężeniu chlorofilu. Po ultrawirowaniu gradienty są rozdzielane na frakcje, które są analizowane za pomocą spektrometrii mas opartej na równej objętości. Takie podejście pozwala na badanie składu we frakcjach gradientowych, a ponadto na analizę zachowania migracyjnego różnych białek, ze szczególnym uwzględnieniem ANR1, CAS i PGRL1. Ponadto metoda ta została zademonstrowana poprzez potwierdzenie wyników za pomocą immunoblottingu oraz dodatkowo poprzez wsparcie wyników poprzednich badań (identyfikacja i zależna od PSI migracja białek, które zostały wcześniej opisane jako wchodzące w skład superkompleksu CEF, takich jak PGRL1, FNR i cyt f). W szczególności podejście to ma zastosowanie do odpowiedzi na szeroki zakres pytań, dla których protokół ten może zostać przyjęty i np. wykorzystany do analiz porównawczych składu kompleksu wielobiałkowego wyizolowanego z różnych warunków środowiskowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procesy fotosyntezy w błonach tylakoidowych roślin i glonów mogą funkcjonować w trybie liniowym i cyklicznym. Podczas liniowego przepływu elektronów (LEF) fotosystem I (PSI), fotosystem II (PSII) i cytochrom b6/f ostatecznie przenoszą elektrony z wody do NADP+1, prowadząc do wytworzenia NADPH i ATP2. W przeciwieństwie do tego, cykliczny przepływ elektronów (CEF), o którym wiadomo, że jest indukowany w różnych warunkach środowiskowych, takich jak stan 2 3 i warunki beztlenowe4, powoduje ponowną redukcję utlenionego PSI poprzez wstrzyknięcie elektronów z powrotem do łańcucha transportu elektronów. Proces te....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla Chlamydomonas

  1. W niniejszej pracy wykorzystano następujące szczepy C. reinhardtii: WT cc124, WT cw15-arg7 (auksotrof z niedoborem ściany komórkowej i argininą), zmutowany szczep ΔPSI29 i szczep nokautujący pgrl1 4.
  2. Wszystkie szczepy były hodowane w podłożu tris-octano-fosforanowym (TAP)-30, w temperaturze 25 °C z ciągłym natężeniem światła 20-50 μE/m2 sekundy i wytrząsaniem przy 120 obr./min. Hodowlę ΔPSI należy owinąć bibułą w celu naświetlania światłem <5 μE/m2 sek.
  3. Kultury znakowanych szczepów (odpowiednio ΔPSI i WT cc124) zawierały 7....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzone podejście do proteomiki ilościowej ma na celu scharakteryzowanie składu kompleksów wielobiałkowych w błonach tylakoidów, wykazanego przez analizę porównawczą składników nadkompleksu CEF w genetycznie różnych szczepach C. reinhardtii. Opisana metoda została z powodzeniem zastosowana przez Terashima i wsp.6 i obejmuje izolację błon tylakoidów z kultur uprawianych beztlenowo, a następnie rozpuszczalność detergentów. Następnie próbki są ładowane na gradient gęstości sacharozy oparty n.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach opublikowano różne ilościowe badania proteomiczne z wykorzystaniem znakowania stabilnymi izotopami. W tych eksperymentach zwykle porównuje się dwie różne próbki, z których jedna jest znakowana stabilnym izotopem. Następnie białka lub peptydy z dwóch próbek są łączone w równych proporcjach i dalej przetwarzane razem48. Takie badania często mają na celu porównanie zdefiniowanych izolowanych przedziałów komórkowych (np. chloroplastów, mitochondriów lub błon tylakoidów) narażonych na ró.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.H. dziękuje za wsparcie ze strony "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG). Wkład autora: M.H. zaprojektował badania; K. T., J. S. i M. T. przeprowadzili badania i przeanalizowali dane; Autorami artykułu byli K.T. i M.H.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chemikalia
Kwas octowyAppliChemA0662http://www.applichem.com/home/
AcetonAppliChemA2300http://www.applichem.com/home/
Acetonitryl Optigrade fü r LC-MSDiagonal9340Szkodliwy, pracować w rękawiczkach. Zapoznaj się z tekstem protokołu, aby uzyskać dalsze środki ostrożności.

https://www.diagonal.de/

Chlorek amonu 15NCambridge Isotope Laboratories39466-62-1http://www.isotope.com/cil/index.cfm
Chlorek amonu 14NAppliChemA0988http://www.applichem.com/home/
Wodorofosforan amonu AppliChemA3583http://www.applichem.com/home/
Siarczan amonu AppliChemA3598http://www.applichem.com/home/
Coomassie błękit brylantowy R-250Fisher Scientific10041653http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-dodecyl-β-D-maltozydAppliChemA0819http://www.applichem.com/home/
EDTAAppliChemA2937http://www.applichem.com/home/
Kwas mrówkowy   AppliChemA3858http://www.applichem.com/home/
HEPESAppliChemA3724http://www.applichem.com/home/
Chlorek magnezuAppliChemA4425http://www.applichem.com/home/
MetanolAppliChemA2954http://www.applichem.com/home/
Kwas fosforowyAppliChemA0989http://www.applichem.com/home/
Wodorofosforan dipotasu AppliChemA1042http://www.applichem.com/home/
Diwodorofosforan potasu AppliChemA1043http://www.applichem.com/home/
Wodorotlenek soduAppliChemA1551http://www.applichem.com/home/
sacharozaAppliChemA1125http://www.applichem.com/home/
TricineAppliChemA3954http://www.applichem.com/home/
TrisAppliChemA2264http://www.applichem.com/home/
Trypsyna (zmodyfikowany stopień sekwencjonowania) i bufor trypsynyPromegaV5111
http://www.promega.de/Sprzęt
Nebulizator (BioNeb cell disrupttor)Glas-Colhttp://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
Probówki wirówkowe (14 mm x 89 mm) Beckman Coulter331372do przygotowania gradientów w stylu Takahashi

http://www.beckmancoulter.de/

Probówki wirówkowe 25 mm x 89 mm
Beckman Coulter344058do przygotowania gradientów izolacji tylakoidów.

http://www.beckmancoulter.de/

Coulter Avanti Wirówka J-20 XPBeckman Coulterhttp://www.beckmancoulter.de/
Fuchs-Rosenthal komora do wysiewu komórekDiagonal449/72https://www.diagonal.de/
Homogenizator (Potter) 50 ml Fisherbrand10618242http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Słupek do homogenizatoraFisherbrand105252220http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Ultrawirówka (Optima XPN-80 Ultrawirówka)Strona internetowa Beckman Coulter: http://www.beckmancoulter.de/
Inne
Przeciwciała Agriserahttp://www.agrisera.com/en/index.html

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
  2. Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
  3. Finazzi, G., Furia, A., ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiprotein Complex AnalysisSucrose Density GradientQuantitative Mass SpectrometryThylakoid Membrane IsolationMetabolic LabelingSDS PAGEImmunodetectionCyclic Electron FlowChlamydomonas ReinhardtiiProtein Migration Behavior

Related Articles