Artykuł metodologiczny

Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15N i ilościowej spektrometrii mas

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51103

⸱

13 marca 2014

 ,  ,  , 
1Institute of Plant Biology and Biotechnology, University of Münster, 2Department of Plant Biology, Carnegie Institution for Science

W tym artykule

Podsumowanie

Opisane porównawcze, ilościowe podejście proteomiczne ma na celu uzyskanie wglądu w skład kompleksów wielobiałkowych w różnych warunkach i jest demonstrowane przez porównanie genetycznie różnych szczepów. Do analizy ilościowej równe objętości różnych frakcji z gradientu gęstości sacharozy miesza się i analizuje za pomocą spektrometrii mas.

Streszczenie

Wprowadzony protokół dostarcza narzędzie do analizy kompleksów wielobiałkowych w błonie tylakoidów, ujawniając wgląd w złożony skład w różnych warunkach. W tym protokole podejście to zostało zademonstrowane poprzez porównanie składu kompleksu białkowego odpowiedzialnego za cykliczny przepływ elektronów (CEF) u Chlamydomonas reinhardtii, wyizolowanego z genetycznie różnych szczepów. Procedura obejmuje izolację błon tylakoidowych, a następnie ich rozdzielenie na kompleksy wielobiałkowe poprzez wirowanie w gradionym spadku gęstości sacharozy, SDS-PAGE, immunodetekcję i porównawczą, ilościową spektrometrię mas (MS) opartą na różnicowym znakowaniu metabolicznym (14N/15N) analizowanych szczepów. Błony tylakoidowe rozpuszczone w detergentach są ładowane na gradienty gęstości sacharozy przy równym stężeniu chlorofilu. Po ultrawirowaniu gradienty są rozdzielane na frakcje, które są analizowane za pomocą spektrometrii mas opartej na równej objętości. Takie podejście pozwala na badanie składu we frakcjach gradientowych, a ponadto na analizę zachowania migracyjnego różnych białek, ze szczególnym uwzględnieniem ANR1, CAS i PGRL1. Ponadto metoda ta została zademonstrowana poprzez potwierdzenie wyników za pomocą immunoblottingu oraz dodatkowo poprzez wsparcie wyników poprzednich badań (identyfikacja i zależna od PSI migracja białek, które zostały wcześniej opisane jako wchodzące w skład superkompleksu CEF, takich jak PGRL1, FNR i cyt f). W szczególności podejście to ma zastosowanie do odpowiedzi na szeroki zakres pytań, dla których protokół ten może zostać przyjęty i np. wykorzystany do analiz porównawczych składu kompleksu wielobiałkowego wyizolowanego z różnych warunków środowiskowych.

Wprowadzenie

Procesy fotosyntezy w błonach tylakoidowych roślin i glonów mogą funkcjonować w trybie liniowym i cyklicznym. Podczas liniowego przepływu elektronów (LEF) fotosystem I (PSI), fotosystem II (PSII) i cytochrom b6/f ostatecznie przenoszą elektrony z wody do NADP+1, prowadząc do wytworzenia NADPH i ATP2. W przeciwieństwie do tego, cykliczny przepływ elektronów (CEF), o którym wiadomo, że jest indukowany w różnych warunkach środowiskowych, takich jak stan 2 3 i warunki beztlenowe4, powoduje ponowną redukcję utlenionego PSI poprzez wstrzyknięcie elektronów z powrotem do łańcucha transportu elektronów. Proces ten może zachodzić albo po stronie zrębu kompleksu cytochromu b6/f 1, albo w puli plastochinonu5 i wytwarza ATP, ale nie NADPH2.

Celem prezentowanego protokołu jest zademonstrowanie metody opartej na spektrometrii mas (MS) do porównawczej, ilościowej analizy kompleksów wielobiałkowych w błonach tylakoidowych Chlamydomonas reinhardtii w celu uzyskania wglądu w skład tych kompleksów w różnych warunkach (na przykładzie porównania genetycznie różnych szczepów). Podejście to zostało zastosowane w publikacji Terashima i in. z 2012 roku, wykazującej zależną od Ca2+ regulację CEF w C. reinhardtii, w której pośredniczy kompleks wielobiałkowy zawierający białka CAS, ANR1 i PGRL16. Procedura zostanie wyjaśniona poprzez analizę porównawczą składu superkompleksu CEF w dwóch genetycznie różnych szczepach, wykorzystując w ten sposób znakowanie jednego z dwóch szczepów ciężkim azotem (15N). Krótko mówiąc, protokół obejmuje przygotowanie błon tylakoidowych, a następnie solubilizację detergentem i frakcjonowanie kompleksów fotosyntetycznych w gradiencie gęstości sacharozy. Po frakcjonowaniu gradientu, wybrane frakcje dwóch szczepów miesza się na podstawie równej objętości, rozdziela za pomocą SDS-PAGE, a następnie przeprowadza trawienie w żelu, a następnie ilościową analizę MS.

Jak wspomniano powyżej, CEF jest indukowany w różnych warunkach środowiskowych, a publikacja z 2010 roku demonstruje izolację funkcjonalnego superkompleksu CEF z komórek C. reinhardtii7 zablokowanych w stanie 2, co zostało przeprowadzone przez oddzielenie rozpuszczonych błon tylakoidowych na gradiencie gęstości sacharozy podczas ultrawirowania. Różni się od Iwai i wsp.7, przedstawiony protokół opisuje izolację superkompleksu CEF z beztlenowo hodowanych kultur C. reinhardtii przy zastosowaniu alternatywnej procedury. Obejmuje to zmiany w protokole izolacji tylakoidów, a także różnice dotyczące etapu rozpuszczania i rozdzielania kompleksów białkowych przez ultrawirowanie. W niniejszym protokole błony tylakoidalne izoluje się metodą opublikowaną przez Chua i Bennouna8, podczas gdy używane do przygotowania tylakoidów przez Iwai i wsp. zawierały 25 mM Me, 0,33 M sacharozy, 5 mM MgCl2, 1,5 mM NaCl (pH 6,5) zgodnie z opisem9. Solubilizację przeprowadzono 0,7-0,8% detergentem (n-tridecyl-β-D-maltozyd) przez 30 minut na lodzie w przypadku Iwai i współpracowników, podczas gdy opisana tutaj metoda solubilizacji polega na użyciu 0,9% detergentu (n-Dodecyl-β-D-maltozyd (β-DM)) i jest wykonywana tylko przez 20 minut na lodzie. Obie grupy używały 0,8 mg chlorofilu na ml do rozpuszczania z odpowiednim detergentem. Do oddzielenia kompleksów fotosyntetycznych od rozpuszczonych błon tylakoidowych Iwai i wsp. zastosowali stężenia sacharozy w zakresie 0,1-1,3 M, podczas gdy autorzy tego protokołu zastosowali stężenia w zakresie 0,4-1,3 M. Ostatnią różnicą jest prędkość wirowania, która jest niższa w porównaniu z wcześniejszą publikacją.

Solubilizacja błon tylakoidów za pomocą niejonowych detergentów, a następnie frakcjonowanie w gradionym gradinie gęstości sacharozy było już stosowane w licznych badaniach, począwszy od lat 80. aż do dzisiaj, 7, 9-14, a także zastosowanie metabolicznego znakowania białek jest szeroko rozpowszechnioną metodą w dziedzinie proteomiki. Opisane podejście stosuje znakowanie metaboliczne 15N dla jednego z dwóch porównywanych szczepów poprzez hodowlę go w obecności ciężkiego azotu jako jedynego źródła azotu w postaci 15N NH4Cl, który jest wbudowywany we wszystkie aminokwasy, prowadząc do przesunięcia masy w zależności od sekwencji aminokwasowej peptydu. Podczas analizy mieszaniny 14N i 15N w jednym przebiegu MS, to przesunięcie masy można wykorzystać do określenia pochodzenia próbki dla każdego peptydu, a względną obfitość peptydów można obliczyć reprezentując względną obfitość odpowiedniego białka15.

Dostępne są liczne ilościowe badania proteomiczne na C. reinhardtii, które porównują określoną ilość białka w celu analizy zmian w proteomie między warunkami eksperymentalnymi (np. zmiany w proteomie spowodowane składnikiem odżywczym16-19 lub stresem świetlnym20,21). W porównaniu z tamtymi badaniami, w obecnie prezentowanym podejściu łączone i analizowane są równe objętości próbek. Taki układ pozwala na badanie zachowań migracyjnych białek w obrębie gradientu, a ponadto na analizę składu różnych kompleksów w odniesieniu do badanych szczepów.

Ta metoda zostanie wyjaśniona głównie poprzez skupienie się na trzech białkach: Pierwszym kandydatem jest zlokalizowane w chloroplastach białko czujnika wapnia CAS, które, jak wykazano, jest zaangażowane w fotoaklimatyzację u C. reinhardtii22. Wapń jest uważany za ważny jon sygnałowy dla szlaków, które są aktywowane z powodu różnych stresów biotycznych i abiotycznych, co ostatecznie prowadzi do zmian w ekspresji genów i fizjologii komórki23 i zaproponowano, że chloroplasty mogą przyczyniać się do sygnalizacji komórkowej Ca2 + za pośrednictwem białka CAS22,24,25. Drugim białkiem jest ANR1 (odpowiedź beztlenowa 1 6), białko, które, jak wykazano, jest indukowane w warunkach beztlenowego wzrostu u C. reinhardtii26. Warto zauważyć, że CAS i ANR1 zostały zidentyfikowane jako podjednostki superkompleksu CEF, a ponadto, przy użyciu odwrotnych podejść genetycznych, wykazano, że oba białka przyczyniają się funkcjonalnie do CEF in vivo6, wspierając ich rolę jako funkcjonalnych podjednostek tego kompleksu białkowego. Trzecim białkiem jest białko tylakoidowe PGR5-Like 1 (PGRL1), które, jak wykazano, jest zaangażowane w CEF u Chlamydomonas4,27, a także u Arabidopsis5,28 i zostało również zidentyfikowane w pracy Iwai i wsp.7

To podejście zostanie przedstawione poprzez pokazanie wyników dwóch różnych eksperymentów: typu dzikiego (WT) kontra (vs.) szczepu ΔPSI29, wykazującego delecję genu psab, kodującego dla niezbędnej podjednostki fotosystemu I, która jest również częścią superkompleksu CEF oraz WT vs. szczep nokautujący pgrl1 4. Dla każdego z tych eksperymentów porównano skład ilościowy superkompleksu CEF między szczepem znakowanym 15N i 14N.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla Chlamydomonas

  1. W niniejszej pracy wykorzystano następujące szczepy C. reinhardtii: WT cc124, WT cw15-arg7 (auksotrof z niedoborem ściany komórkowej i argininą), zmutowany szczep ΔPSI29 i szczep nokautujący pgrl1 4.
  2. Wszystkie szczepy były hodowane w podłożu tris-octano-fosforanowym (TAP)-30, w temperaturze 25 °C z ciągłym natężeniem światła 20-50 μE/m2 sekundy i wytrząsaniem przy 120 obr./min. Hodowlę ΔPSI należy owinąć bibułą w celu naświetlania światłem <5 μE/m2 sek.
  3. Kultury znakowanych szczepów (odpowiednio ΔPSI i WT cc124) zawierały 7,5 mM 15N NH4Cl, podczas gdy kultury dla szczepów nieznakowanych (WT cw15-arg7 i pgrl1, odpowiednio) zawierały 7,5 mM 14N NH4Cl. Komórki muszą rosnąć przez co najmniej cztery pokolenia, aby osiągnąć pełne znakowanie i muszą być utrzymywane w fazie wzrostu wykładniczego.
  4. W dniu poprzedzającym rozpoczęcie doświadczenia należy policzyć i rozcieńczyć komórki do gęstości 1 x 106 komórek/ml w objętości co najmniej 750 ml/szczep.

Proszę zauważyć, że dwa rodzaje nieciągłych gradientów gęstości sacharozy są opisane w poniższym protokole. Gradienty gęstości sacharozy w fotosystemie według Takahashi i wsp.9 stosuje się do oddzielenia różnych fotosyntetycznych kompleksów białkowych od wyizolowanych i rozpuszczonych tylakoidów podczas wirowania w ciągu nocy i muszą być przygotowane dzień wcześniej (patrz protokół 2), a gradienty gęstości tylakoidów sacharozy8 są stosowane w procedurze izolacji tylakoidów (patrz protokół 3).

2. Przygotowanie gradientów gęstości sacharozy w fotosystemie

  1. Do wylewania gradientów potrzebne są trzy roztwory podstawowe:
    1. 2 M sacharoza
    2. 10% β-s.m. w H2O
    3. 0,5 M trycyna, pH 8,0 (NaOH)
  2. Korzystając z tych zapasów, przygotuj następujące roztwory:
    Koncentracja:1,3 mln1.0 M0.85 M0.7 M0,65 mln0.4 M
    2 m Sacharoza13 ml10 ml8,5 ml7 ml6,5 ml4 ml
    10% β-DM100 μl100 μl100 μl100 μl100 μl100 μl
    0,5 m tricine200 μl200 μl200 μl200 μl200 μl200 μl
    H2O6,7 ml9,7 ml11.2 ml12.7 ml13.2 ml15.7 ml
  3. Użyj probówek wirówkowych o wymiarach 14 mm x 89 mm i bardzo powoli wlewaj gradienty, zaczynając od roztworu o najwyższej gęstości sacharozy do roztworu o niższej gęstości.
  4. Wlać tylko po 1 ml dla roztworów 1,3 i 1,0 M oraz 2 ml dla pozostałych roztworów.
  5. Pozostaw gradienty na noc w chłodni.

3. Indukcja beztlenowa i izolacja błon tylakoidowych8

  1. Przed przystąpieniem do izolacji błon tylakoidowych należy wywołać warunki beztlenowe, bulgocząc argonem przez 4 godziny. Bulgotanie można przeprowadzić za pomocą szklanej pipety w kolbach hodowlanych z ciągłym mieszaniem kultury za pomocą mieszadła magnetycznego.
  2. Rozpocznij od izolacji błon tylakoidów poprzez granulowanie komórek przez 5 minut w temperaturze 2,500 x g, ponownie zawiesić w buforze H1 (0,3 M sacharozy, 25 mM HEPES (pH7,5), 5 mM MgCl 2).
    (Należy pamiętać, że rozpoczynając izolację błon tylakoidów, próbki należy przechowywać na lodzie, aby uniknąć degradacji białka, wszystkie etapy wirowania przeprowadza się w temperaturze 4 °C i zdecydowanie zaleca się pracę w rękawicach, aby uniknąć zanieczyszczenia keratyną.)
  3. Ogniwa osadzane przez 5 minut przy 2 500 x g, ponownie zawieszone w buforze H1.
  4. Rozbij komórki dwoma przejściami przez nebulizator o ciśnieniu azotu 1,500 hPa (dla szczepów bez ściany komórkowej wykonaj tylko jedno przejście).
  5. Obracaj komórki przez 7 minut przy 2,500 x g.
    (Po tym kroku supernatant powinien być jasnozielony, jeśli nie, pęknięcie komórki nie powiodło się.)
  6. Zawieś komórki w buforze H2 (0,3 M sacharozy, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) i komórki osadkowe na 10 minut przy 32 800 x g.
  7. Ponownie zawiesić komórki w buforze H3 (1,8 M sacharozy, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) i homogenizować osad za pomocą garnka (na końcu tego etapu roboczego nie powinny pozostać żadne zielone cząstki).
  8. Przygotować gradienty gęstości sacharozy tylakoidów w probówkach (25 mm x 89 mm), zaczynając od dołu od warstwy 12 ml buforu H3 z komórkami, wlać środkową warstwę 12 ml buforu H4 (1,3 M sacharozy, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) i na wierzch 12 ml buforu H5 (0,5 M sacharozy, 5 mM KWASÓW (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)). Zachowaj ostrożność podczas nalewania gradientów i unikaj mieszania trzech warstw.
  9. Zrównoważyć z buforem H5 i odwirować gradienty gęstości tylakoidów sacharozy przez 1 godzinę przy 70 700 x g.
  10. Usunąć prążki tylakoidów z gradientów gęstości sacharozy tylakoidów i rozcieńczyć je buforem H6 o odpowiedniej objętości (5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)).
  11. Wiruj komórki przy 37 900 x g przez 20 minut. Jeśli osad nie jest szczelny, do tego etapu wirowania potrzeba więcej buforu H6.
  12. Ponownie zawiesić tylakoidy w buforze H6 o małej objętości i przystąpić do oznaczania stężenia chlorofilu.

4. Oznaczanie stężenia chlorofilu31

  1. Oznaczanie ilości chlorofilu odbywa się za pomocą 80% acetonu.
  2. Zmieszać 995 μl 80% acetonu i 5 μl tylakoidów w buforze H6 (rozcieńczenie 1:200).
  3. Wirować przez kilka sekund, aż nie pozostaną żadne zielone cząstki, a następnie wirować w dół przy 14,1 x g przez 5 minut.
  4. Weź supernatant i zmierz wartość wygaszania odpowiednio przy 663,6 i 646,6 nm oraz 750 nm.
  5. Oblicz ilość chlorofilu, korzystając z następujących wzorów:
    1. CChl a [mg/ml] = (0,01225 * E663,6 – 0,00255 * E646,6) * współczynnik rozcieńczenia
    2. CChl b [mg/ml] = (0,02031 * E646,6 – 0,00491 * E663,6) * współczynnik rozcieńczenia
    3. CChl [mg/ml] = CChl a + CChl b

5. Wczytywanie gradientów gęstości sacharozy w fotosystemie

  1. Oblicz ilości tylakoidów, β-DM i buforu H6, które są potrzebne dla każdego gradientu:
    1. Każdy gradient należy obciążyć całkowitą objętością 700 μl 0,8 mg/ml chlorofilu w 0,9% β-DM (rozpuścić β-DM w H2O), pozostałą objętość wypełnić buforem H6.
  2. Do solubilizacji przygotuj różne porcje z tylakoidami, β-DM i buforem H6 dla każdego gradientu.
  3. Pozostawić próbki na 20 minut na lodzie, regularnie mieszając (odwracając) co kilka minut (etap rozpuszczania).
  4. Wirować z maksymalną prędkością (14 000 x g) przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    (Po odwirowaniu osad powinien być mały i białawy, podczas gdy supernatant jest ciemnozielony.)
  5. Załaduj supernatant na gradienty.
  6. Zrównoważyć buforem H6 i odwirować za pomocą ultrawirówki przy 134 470 x g przez noc (14 godzin) w temperaturze 4 °C.
    (Należy pamiętać, że pomyślne rozdzielenie kompleksów fotosyntetycznych przy użyciu gradientów gęstości sacharozy w fotosystemie, jak przedstawiono w tym protokole, osiąga się tylko przy użyciu świeżo wyizolowanych tylakoidów, ponieważ przewidywanie rozpuszczania i separacji kompleksów jest trudne do wykonania podczas pracy z błonami tylakoidów, które zostały wcześniej zamrożone).

6. Frakcjonowanie gradientów gęstości sacharozy w fotosystemie

  1. Zrób zdjęcia gradientów.
  2. Nakłuć otwór na dnie probówki za pomocą igły i frakcjonować gradienty w probówkach o pojemności 500 μl. Alternatywnie frakcjonowanie można również przeprowadzić przy użyciu 96-dołkowej płytki (mikropłytki).
  3. W przypadku stosowania mikropłytki należy określić absorbancję różnych frakcji gradientowych przy 675 nm.
    (Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni.)

7. SDS-PAGE i immunodetekcja

(Proszę zauważyć, że tylko dla porównania WT i ΔPSI przeprowadzono analizę western blot w celu wybrania frakcji do późniejszej analizy MS. Do eksperymentu wybrano frakcje WT i pgrl1 na podstawie absorbancji w różnych frakcjach.)

  1. Oddzielić 30 μl każdej frakcji od gradientu WT i ΔPSI na 13% żelu poliakrylamidowymSDS 32.
  2. Przeprowadzić analizę western blot33 przy użyciu następujących przeciwciał: ANR1 (TEF7)26, PGRL134, CAS6, podjednostki PSI PSAD32 i podjednostki rdzeniowej PSII D1. Należy stosować wszystkie przeciwciała o rozcieńczeniu 1:1 000 (w celu uzyskania ulepszonej techniki wykrywania chemiluminescencji), z wyjątkiem przeciwciała D1, które należy stosować w rozcieńczeniu 1:10 000.
  3. Na podstawie wyników immunodetekcji należy pobrać frakcje pikowe ANR1, PGRL1 i PSAD dla WT i ΔPSI (tutaj odpowiednio frakcje 6 i 13), zmieszać 30 μl frakcji 6 z WT i ΔPSI i zrobić to samo z frakcją 13 z obu preparatów i ponownie rozdzielić je na 13% żelu poliakryloamidowym SDS.
  4. Do porównania ilościowego WT i pgrl1 należy wziąć frakcje nadkompleksu CEF, jak oznaczono przez pomiar absorbancji w różnych frakcjach gradientowych i wymieszać 30 μl obu próbek, a następnie rozdzielić na 13% żelu poliakrylamidowym SDS.
  5. Barwienie pasm białkowych roztworem Coomassie (85% kwasu fosforowego, 757 mM siarczanu amonu, 1,2% błękitu brylantowego Coomassie, 20% metanolu) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Aby usunąć niespecyficzne zabarwienia, przemyj kilkakrotnie ddH2O.
  7. Pokrój paski na kawałki żelu o średnicy 1 mm i przystąp do trawienia w żelu.
    (Alternatywnie, próbki można suszyć przez kilka minut w wirówce próżniowej i przechowywać przez kilka tygodni przed kontynuowaniem trawienia w żelu).

8. Trawienie w żelu (zmodyfikowane z Shevchenko et al.Rozdział 35)

Proszę pamiętać, aby przygotować wszystkie i roztwory na krótko przed użyciem i wziąć szklane butelki do zawierających acetonitryl (ACN).
OSTROŻNOŚĆ! Praca z ACN może być szkodliwa; Więcej informacji można pobrać ze strony: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).

  1. Kawałki żelu myć >10 objętościami ddH2O (~200 μl) przez 30 sek.
  2. Inkubować kawałki żelu z 300 μl 25 mM NH4HCO3 przez 15 minut z potrząsaniem, usunąć płyn.
  3. Inkubować kawałki żelu z 300 μl 25 mM NH4HCO3 w 50% ACN (przygotować przez zmieszanie ACN i 50 mM NH4HCO3 w stosunku 1:1) przez 15 minut z wytrząsaniem, usunąć płyn.
  4. Jeśli kawałki żelu są nadal niebieskie, powtórz mycie NH4HCO3 i NH4HCO3 / ACN, aż większość Coomassie zostanie usunięta.
    (Chociaż większość przebarwień Coomassie powinna zostać usunięta, nie jest konieczne całkowite odplamienie kawałków żelu.)
  5. Dodaj 100 μl ACN, aby odwodnić kawałki żelu przez 5 minut. Kawałki żelu powinny się skurczyć i wyglądać na całkowicie białe.
  6. Usuń jak najwięcej ACN i kontynuuj trawienie trypsyny. Alternatywnie próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
  7. Dodać 10-20 μl na pasmo 20 ng/μl trypsyny w 10% ACN / 25 mM NH4HCO3 (świeżo rozcieńczonym), próbki przechowywać na lodzie.
  8. Po 30 minutach sprawdź, czy cały roztwór został wchłonięty i w razie potrzeby dodaj więcej buforu trypsyny. Kawałki żelu powinny być całkowicie pokryte buforem trypsyny. Próbki należy przechowywać na lodzie.
  9. Pozostaw kawałki żelu na kolejne 90 minut na lodzie, aby nasycić je trypsyną.
    (Etap krytyczny: wydajność peptydów tryptycznych znacznie wzrasta wraz ze wzrostem czasu inkubacji na lodzie, prawdopodobnie z powodu powolnej dyfuzji enzymu do matrycy poliakryloamidu. Konieczne jest posiadanie niewielkiego nadmiaru roztworu pokrywającego kawałki żelu, aby uniknąć wyschnięcia kawałków podczas całonocnej inkubacji.)
  10. Trawić w temperaturze 37 °C przez 4-6 godzin. W przypadku eksperymentów wymagających maksymalnego odzysku peptydów, trawić przez noc.
  11. Po roztrawieniu odwirować skondensowany bufor.
  12. Sonikować probówki przez 5 minut, aby wymyć peptydy i ponownie odwirować.
  13. Zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki.
  14. Ekstrakcję peptydową 80 μl 30% ACN / 1% kwasu mrówkowego (FA) należy przeprowadzić w kąpieli sonicznej przez 15 minut.
  15. Ekstrakcję 80 μl 30% ACN / 1% FA należy przeprowadzić w kąpieli sonicznej przez 15 minut.
  16. Ekstrakcję 80 μl 70% ACN / 1% FA należy przeprowadzić w kąpieli sonicznej przez 15 minut.
  17. Ponownie odwirować i połączyć supernatant z wcześniejszym eluatem.
    (FA służy do inaktywacji trypsyny i zwiększenia rozpuszczalności peptydów.)
  18. Całkowicie wysuszyć roztwór peptydowy w wirówce próżniowej.
    (W tym momencie próbki mogą być przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze -20 °C przed przystąpieniem do analizy MS).
  19. Ponownie zawiesić peptydy w 6 μl buforu MS (5% ACN, 0,1 v/v FA, woda) i sonikować przez 2-5 minut.
  20. Odwirować próbki z maksymalną prędkością przez 5 minut w celu usunięcia cząstek stałych.
  21. Do analizy spektrometrycznej mas należy użyć 4 μl supernatantu.

9. Analiza danych MS za pomocą "Proteomatic"

Analiza danych została przeprowadzona za pomocą oprogramowania open-source "Proteomatic" (które można pobrać pod adresem http://www.proteomatic.org/), platformy, która pozwala na generowanie i uzupełnianie potoków oceny danych MS/MS, przy użyciu darmowego i komercyjnego oprogramowania36. W skrócie ustawienia są opisane poniżej, a bardziej szczegółowe informacje można znaleźć w6,26.

  1. Identyfikacja i kwantyfikacja danych MS
    Identyfikację i kwantyfikację białek z eksperymentów WT vs. ΔPSI przeprowadzono za pomocą OMSSA (wersja 2.1.437) i qTrace26, odpowiednio, jak opisano6,26. Do analizy danych MS z eksperymentu WT vs. pgrl1 użyto następującego zaktualizowanego potoku:
    1. Oprócz OMSSA37 białka zostały również zidentyfikowane z X! Tandem (wersja 2013.02.0138). Oba algorytmy zastosowano poprzez wyszukiwanie w bazie danych wygenerowanej przez połączenie bazy danych modelu genów JGI Chlamydomonas w wersji 4.3 z bazą danych AUGUSTUS w wersji 10.2, a także w oparciu o połączoną bazę danych NCBI BK000554.2 i NC_001638.1.
    2. Identyfikację peptydów MS2 przeprowadzono przy użyciu podejścia typu cel-wabik39. Wabik dla każdego białka został stworzony przez losowe tasowanie peptydów tryptycznych przy zachowaniu nadmiarowości peptydów nieprotetypowych.
    3. Walidację statystyczną peptydów przeprowadzono za pomocą oprogramowania qvality (wersja 0.3.340) przy użyciu progu prawdopodobieństwa błędu a posteriori (PEP) mniejszego niż 0,01, a wyniki przefiltrowano z tolerancją masy prekursora wynoszącą 5 ppm.
    4. Peptydy od OMSSA i X! Serie tandemowe połączono i określono ilościowo za pomocą qTrace26, stosując następujące kroki filtrowania: wymagaj identyfikacji MS2, dodaj nazwy białek / informacje o grupach i wymagaj obu peptydów siostrzanych.

Aby zbadać, czy proporcje białek znacząco różniły się względem siebie w mieszanych frakcjach nadkompleksu CEF z WT i pgrl1, przeprowadzono analizę statystyczną przy użyciu oprogramowania SPSS (wersja 21). Podjednostki kompleksu cytochromu b6/f przetestowano względem siebie, a także białka FNR, FTSH2 i HCF136 względem podjednostek PSI. Proporcje peptydów w każdej liczbie skanów na białko wszystkich czterech kontrprób przetestowano pod kątem rozkładu normalnego za pomocą testu Shapiro-Wilksa. Ponieważ populacje peptydów nie miały rozkładu normalnego (p<0,001), przeprowadzono statystyki nieparametryczne. W pierwszej kolejności zastosowano test Kruskala-Wallisa, oceniający istotną rozbieżność między grupami. Tylko wtedy, gdy test ten przewidywał znaczące różnice między grupami, przeprowadzono dalszą analizę w celu przewidzenia istotnych różnic między dwiema niezależnymi grupami za pomocą testu Manna-Whitneya-U.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wprowadzona metoda proteomiki ilościowej ma na celu charakterystykę składu kompleksów wielobiałkowych w błonach tylakoidów, co zaprezentowano poprzez analizę porównawczą komponentów superkompleksów CEF w genetycznie różnych szczepach C. reinhardtii. Opisana metoda została z sukcesem zastosowana przez Terashimę et al.6 i obejmuje izolację błon tylakoidów z kultur hodowanych beztlenowo, a następnie solubilizację detergentem. Następnie próbki są nanoszone na gradient gęstości sacharozy w oparciu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ostatnich latach opublikowano różne ilościowe badania proteomiczne z wykorzystaniem znakowania stabilnymi izotopami. W tych eksperymentach zwykle porównuje się dwie różne próbki, z których jedna jest znakowana stabilnym izotopem. Następnie białka lub peptydy z dwóch próbek są łączone w równych proporcjach i dalej przetwarzane razem48. Takie badania często mają na celu porównanie zdefiniowanych izolowanych przedziałów komórkowych (np. chloroplastów, mitochondriów lub błon tylakoidów) narażonych na ró...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

M.H. dziękuje za wsparcie ze strony "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG). Wkład autora: M.H. zaprojektował badania; K. T., J. S. i M. T. przeprowadzili badania i przeanalizowali dane; Autorami artykułu byli K.T. i M.H.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemikalia
Kwas octowyAppliChemA0662http://www.applichem.com/home/
AcetonAppliChemA2300http://www.applichem.com/home/
Acetonitryl Optigrade fü r LC-MSDiagonal9340Szkodliwy, pracować w rękawiczkach. Zapoznaj się z tekstem protokołu, aby uzyskać dalsze środki ostrożności.

https://www.diagonal.de/

Chlorek amonu 15NCambridge Isotope Laboratories39466-62-1http://www.isotope.com/cil/index.cfm
Chlorek amonu 14NAppliChemA0988http://www.applichem.com/home/
Wodorofosforan amonu AppliChemA3583http://www.applichem.com/home/
Siarczan amonu AppliChemA3598http://www.applichem.com/home/
Coomassie błękit brylantowy R-250Fisher Scientific10041653http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-dodecyl-β-D-maltozydAppliChemA0819http://www.applichem.com/home/
EDTAAppliChemA2937http://www.applichem.com/home/
Kwas mrówkowy   AppliChemA3858http://www.applichem.com/home/
HEPESAppliChemA3724http://www.applichem.com/home/
Chlorek magnezuAppliChemA4425http://www.applichem.com/home/
MetanolAppliChemA2954http://www.applichem.com/home/
Kwas fosforowyAppliChemA0989http://www.applichem.com/home/
Wodorofosforan dipotasu AppliChemA1042http://www.applichem.com/home/
Diwodorofosforan potasu AppliChemA1043http://www.applichem.com/home/
Wodorotlenek soduAppliChemA1551http://www.applichem.com/home/
sacharozaAppliChemA1125http://www.applichem.com/home/
TricineAppliChemA3954http://www.applichem.com/home/
TrisAppliChemA2264http://www.applichem.com/home/
Trypsyna (zmodyfikowany stopień sekwencjonowania) i bufor trypsynyPromegaV5111
http://www.promega.de/Sprzęt
Nebulizator (BioNeb cell disrupttor)Glas-Colhttp://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
Probówki wirówkowe (14 mm x 89 mm) Beckman Coulter331372do przygotowania gradientów w stylu Takahashi

http://www.beckmancoulter.de/

Probówki wirówkowe 25 mm x 89 mm
Beckman Coulter344058do przygotowania gradientów izolacji tylakoidów.

http://www.beckmancoulter.de/

Coulter Avanti Wirówka J-20 XPBeckman Coulterhttp://www.beckmancoulter.de/
Fuchs-Rosenthal komora do wysiewu komórekDiagonal449/72https://www.diagonal.de/
Homogenizator (Potter) 50 ml Fisherbrand10618242http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Słupek do homogenizatoraFisherbrand105252220http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Ultrawirówka (Optima XPN-80 Ultrawirówka)Strona internetowa Beckman Coulter: http://www.beckmancoulter.de/
Inne
Przeciwciała Agriserahttp://www.agrisera.com/en/index.html

Bibliografia

  1. Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
  2. Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
  3. Finazzi, G., Furia, A., Barbagallo, R. P., Forti, G. State transitions, cyclic and linear electron transport and photophosphorylation in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 1413 (3), 117-129 (1999).
  4. Tolleter, D., et al. Control of hydrogen photoproduction by the proton gradient generated by cyclic electron flow in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (7), 2619-2630 (2011).
  5. Hertle, A. P., et al. PGRL1 Is the Elusive Ferredoxin-Plastoquinone Reductase in Photosynthetic Cyclic Electron Flow. Mol. Cell. 49 (3), 511-523 (2013).
  6. Terashima, M., et al. Calcium-dependent regulation of cyclic photosynthetic electron transfer by a CAS, ANR1, and PGRL1 complex. PNAS. 109 (43), 17717-17722 (2012).
  7. Iwai, M., Takizawa, K., Tokutsu, R., Okamuro, A., Takahashi, Y., Minagawa, J. Isolation of the elusive supercomplex that drives cyclic electron flow in photosynthesis. Nature. 464 (7292), 1210-1213 (2010).
  8. Chua, N. H., Bennoun, P. Thylakoid Membrane Polypeptides of Chlamydomonas reinhardtii: Wild-Type and Mutant Strains Deficient in Photosystem II Reaction Center. PNAS. 72 (6), 2175-2179 (1975).
  9. Takahashi, H., Iwai, M., Takahashi, Y., Minagawa, J. Identification of the mobile light-harvesting complex II polypeptides for state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. PNAS. 103 (2), 477-482 (2006).
  10. Ikeuchi, M., Plumley, F. G., Inoue, Y., Schmidt, G. W. Phosphorylation of Photosystem II Components, CP43 Apoprotein, D1, D2, and 10 to 11 Kilodalton Protein in Chloroplast Thylakoids of Higher Plants. Plant Physiol. 85 (3), 638-642 (1987).
  11. Ruban, A. V., Lee, P. J., Wentworth, M., Young, A. J., Horton, P. Determination of the Stoichiometry and Strength of Binding of Xanthophylls to the Photosystem II Light Harvesting Complexes. J. Biol. Chem. 274 (15), 10458-10465 (1999).
  12. Barera, S., Pagliano, C., Pape, T., Saracco, G., Barber, J. Characterization of PSII-LHCII supercomplexes isolated from pea thylakoid membrane by one-step treatment with α- and β-dodecyl-D-maltoside. Phil. Trans. R. Soc. B. 367 (1608), 3389-3399 (2012).
  13. Kantzilakis, K., et al. A comparative approach towards thylakoid membrane proteome analysis of unicellular green alga Scenedesmus obliquus. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (9), 2271-2279 (2007).
  14. Takahashi, Y., Yasui, T., Stauber, E. J., Hippler, M. Comparison of the subunit compositions of the PSI-LHCI supercomplex and the LHCI in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry. 43 (24), 7816-7823 (2004).
  15. Thelen, J. J., Peck, S. C. Quantitative proteomics in plants: choices in abundance. Plant Cell. 19 (11), 3339-3346 (2007).
  16. Hsieh, S., et al. The Proteome of Copper, Iron, Zinc, and Manganese Micronutrient Deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteom. 12 (1), 65-86 (2013).
  17. Longworth, J., Noirel, J., Pandhal, J., Wright, P. C., Vaidyanathan, S. HILIC- and SCX-based quantitative proteomics of Chlamydomonas reinhardtii during nitrogen starvation induced lipid and carbohydrate accumulation. J. Proteome Res. 11 (12), 5959-5971 (2012).
  18. Malasarn, D., et al. Zinc deficiency impacts CO2 assimilation and disrupts copper homeostasis in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 288 (15), 10672-10683 (2013).
  19. Höhner, R., et al. The metabolic status drives acclimation of iron deficieny responses in Chlamydomonas reinhardtii as revealed by proteomics based hierarchical clustering and reverse genetics. Mol. Cell. , (2013).
  20. Mahong, B., Roytrakul, S., Phaonaklop, N., Wongratana, J., Yokthongwattana, K. Proteomic analysis of a model unicellular green alga, Chlamydomonas reinhardtii, during short-term exposure to irradiance stress reveals significant down regulation of several heat-shock proteins. Planta. 235 (3), 499-511 (2012).
  21. Förster, B., Mathesius, U., Pogson, B. J. Comparative proteomics of high light stress in the model alga Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 6 (15), 4309-4320 (2006).
  22. Petroutsos, D., et al. The chloroplast calcium sensor CAS is required for photoacclimation in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (8), 2950-2963 (2011).
  23. Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
  24. Nomura, H., Komori, T., Kobori, M., Nakahira, Y., Shiina, T. Evidence for chloroplast control of external Ca2+-induced cytosolic Ca2+ transients and stomatal closure. Plant J. 53 (6), 988-998 (2008).
  25. Weinl, S., et al. A plastid protein crucial for Ca2+-regulated stomatal responses. New Phytol. 179 (3), 675-686 (2008).
  26. Terashima, M., Specht, M., Naumann, B., Hippler, M. Characterizing the anaerobic response of Chlamydomonas reinhardtii by quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9 (7), 1514-1532 (2010).
  27. Petroutsos, D., et al. PGRL1 participates in iron-induced remodeling of the photosynthetic apparatus and in energy metabolism in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 284 (47), 32770-32781 (2009).
  28. DalCorso, G., et al. A complex containing PGRL1 and PGR5 is involved in the switch between linear and cyclic electron flow in Arabidopsis. Cell. 132 (2), 273-285 (2008).
  29. Redding, K., et al. A systematic survey of conserved histidines in the core subunits of Photosystem I by site-directed mutagenesis reveals the likely axial ligands of P700. EMBO J. 17 (1), 50-60 (1998).
  30. Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. (2008).
  31. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975 (3), 384-394 (1989).
  32. Naumann, B., Stauber, E. J., Busch, A., Sommer, F., Hippler, M. N-terminal processing of Lhca3 Is a key step in remodeling of the photosystem I-light-harvesting complex under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 280 (21), 20431-20441 (2005).
  33. Hippler, M., Klein, J., Fink, a, Allinger, T., Hoerth, P. Towards functional proteomics of membrane protein complexes: analysis of thylakoid membranes from Chlamydomonas reinhardtii. Plant J. 28 (5), 595-606 (2001).
  34. Naumann, B., et al. Comparative quantitative proteomics to investigate the remodeling of bioenergetic pathways under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 7 (21), 3964-3979 (2007).
  35. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Prot. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  36. Specht, M., Kuhlgert, S., Fufezan, C., Hippler, M. Proteomics to go: Proteomatic enables the user-friendly creation of versatile MS/MS data evaluation workflows. Bioinformatics. 27 (8), 1183-1184 (2011).
  37. Geer, L. Y., et al. Open mass spectrometry search algorithm. J. Proteome Res. 3 (5), 958-964 (2004).
  38. Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
  39. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat. Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  40. Käll, L., Storey, J. D., Noble, W. S. QVALITY: non-parametric estimation of q-values and posterior error probabilities. Bioinformatics. 25 (7), 964-966 (2009).
  41. Wollman, F. A., Bennoun, P. A new chlorophyll-protein complex related to photosystem I in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 680, 352-360 (1982).
  42. Bailey, S., et al. A critical role for the Var2 FtsH homologue of Arabidopsis thaliana in the photosystem II repair cycle in vivo. J. Biol. Chem. 277 (3), 2006-2011 (2002).
  43. Kato, Y., Sakamoto, W. Protein quality control in chloroplasts: a current model of D1 protein degradation in the photosystem II repair cycle. J. Biochem. 146 (4), 463-469 (2009).
  44. Meurer, J., Plücken, H., Kowallik, K. V., Westhoff, P. A nuclear-encoded protein of prokaryotic origin is essential for the stability of photosystem II in Arabidopsis thaliana. EMBO J. 17 (18), 5286-5297 (1998).
  45. Kuras, R., Wollman, F. A. The assembly of cytochrome b6/f complexes: an approach using genetic transformation of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. EMBO J. 13 (5), 1019-1027 (1994).
  46. de Vitry, C., Finazzi, G., Baymann, F., Kallas, T. Analysis of the nucleus-encoded and chloroplast-targeted rieske protein by classic and site-directed mutagenesis of Chlamydomonas. Plant Cell. 11 (10), 2031-2044 (1999).
  47. Hamel, P., Olive, J., Pierre, Y., Wollman, F. A., de Vitry, C. A new subunit of cytochrome b6f complex undergoes reversible phosphorylation upon state transition. J. Biol. Chem. 275 (22), 17072-17079 (2000).
  48. Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent-resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8 (9), 2186-2198 (2009).
  49. Atteia, A., et al. A proteomic survey of Chlamydomonas reinhardtii mitochondria sheds new light on the metabolic plasticity of the organelle and on the nature of the alpha-proteobacterial mitochondrial ancestor. Mol. Biol. Evol. 26 (7), 1533-1548 (2009).
  50. Pagliano, C., Barera, S., Chimirri, F., Saracco, G., Barber, J. Comparison of the α and β isomeric forms of the detergent n-dodecyl-D-maltoside for solubilizing photosynthetic complexes from pea thylakoid membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1817 (8), 1506-1515 (2012).
  51. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Methods. 6 (5), 3-7 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza kompleks w wielobia kowychgradient g sto ci sacharozyizolacja b on tylakoid wSDS PAGEimmunodetekcjacykliczny przep yw elektron wChlamydomonas reinhardtiizachowanie migracyjne bia ek

Powiązane artykuły