Przyżyciowe pomiary wideomikroskopii przepływu krwi w siatkówce u myszy

Podsumowanie

Mikroskopia przyżyciowe może być używana u zwierząt do wizualizacji i pomiaru średnic naczyń krwionośnych siatkówki, prędkości przepływu krwi i całkowitego przepływu krwi w siatkówce.

Streszczenie

Zmiany w przepływie krwi w siatkówce mogą przyczyniać się do chorób oczu i dysfunkcji wzroku lub być ich konsekwencją. Dlatego kwantyfikacja zmienionej perfuzji może pomóc w badaniach nad mechanizmami patologii siatkówki. Przyżyciowy mikroskop wideo znaczników fluorescencyjnych może być stosowany do pomiaru średnic naczyń krwionośnych i prędkości krwiobiegu siatkówki, w szczególności tętniczek rozgałęziających się od centralnej tętnicy siatkówkowej i żyłek prowadzących do centralnej żyły siatkówki. Natężenia przepływu krwi można obliczyć na podstawie średnic i prędkości, z sumą przepływu tętniczego i oddzielnie przepływu komorowego, podając wartości całkowitego przepływu krwi w siatkówce. Ten artykuł i związany z nim film opisują metody stosowania tej techniki u myszy, które obejmują 1) przygotowanie oka do mikroskopii przyżyciowej znieczulonego zwierzęcia, 2) dożylny wlew mikrosfer fluorescencyjnych w celu pomiaru prędkości krwi, 3) dożylny wlew fluorescencyjnego dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej, w celu wspomagania mikroskopowej wizualizacji mikrokrążenia siatkówki, 4) użycie cyfrowej kamery mikroskopowej do uzyskania filmów perfuzyjnej siatkówki oraz 5) użycie oprogramowania do przetwarzania obrazu do analizy wideo. Te same techniki można zastosować do pomiaru szybkości przepływu krwi w siatkówce u szczurów.

Wprowadzenie

Siatkówka jest jedną z najbardziej aktywnych metabolicznie tkanek w ciele i w związku z tym wymaga obfitego dopływu krwi. Dwa oddzielne krążenia spełniają to wymaganie: krążenie naczyniówkowe dla zewnętrznej części siatkówki i krążenie siatkówki dla wewnętrznej części siatkówki. Badania perfuzji siatkówki są niezbędne do zrozumienia patologicznych mechanizmów i konsekwencji retinopatii cukrzycowej, retinopatii indukowanej tlenem, niedrożności tętnic lub żył siatkówki oraz udaru. Do ilościowego określenia przepływu krwi w siatkówce zastosowano kilka metod, przy czym każda technika ma swoje zalety, wady, ograniczenia i założenia. Wśród tych technik znajduje się infuzja mikrosfer o średnicy 7-8 μm, które osadzają się w tętniczkach przedwłośniczkowych^1,2, autoradiografia ilościowa^3,4, mikroangiopatia optyczna - optyczna tomografia koherentna^5,6, rezonans magnetyczny^7,8 i wideomikroskopia przyżyciowa^9-16. Zaletami tego ostatniego są bezpośrednia wizualizacja na żywo naczyń siatkówkowych i przepływu, zależność od zaledwie kilku drobnych założeń oraz przystępność cenowa dla laboratoriów posiadających mikroskop fluorescencyjny z dołączoną kamerą wideo. W poprzednich badaniach przyżyciowej mikroskopii wideo^9-16 fluorescencyjny dekstran był używany jako marker osocza, a znakowane fluorescencyjnie czerwone krwinki (od zwierzęcia dawcy) były używane jako markery prędkości. W obecnym protokole do pomiaru prędkości używa się fluorescencyjnie znakowanych mikrosfer o średnicy 1,9 μm zamiast czerwonych krwinek, przy czym ta zmiana neguje potrzebę dawcy komórek krwi.

Protokół

Procedury związane z wykorzystaniem zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania LSUHSC-S i przeprowadzone zgodnie z kryteriami określonymi przez National Institutes of Health.

1. Przygotowanie roztworów perfuzyjnych

1. Sonikować 1% (wagowo) roztwór podstawowy mikrosfer o średnicy 1,9 μm.
2. Pobrać ~25-30 x 10⁶ zielonych mikrosfer fluorescencyjnych (czyli ~10 μl roztworu podstawowego) do strzykawki o pojemności 300 μl. Rozcieńczyć mikrosfery, pobierając dodatkowe 240 μl soli fizjologicznej do strzykawki.
3. Przygotować 50 μl roztworu 2 x 10 6 fluorescencyjnego dekstranu rozpuszczonego w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, z wstrzykiwaną dawką w zakresie 3-10 mg/kg. Trzymaj dekstran przykryty folią aluminiową do czasu jego naparu.

2. Znieczulenie zwierzęce i kaniulacja naczyniowa

1. Znieczulić zwierzę do chirurgicznego wprowadzenia kaniul naczyniowych oraz do stacjonarnego pozycjonowania pod obiektywem mikroskopu. Dostępnych jest wiele rodzajów protokołów anestezjologicznych, o różnych zaletach i wadach oraz potencjalnym wpływie na parametry ogólnoustrojowe. Wśród wielu różnych opcji znajduje się połączenie ketaminy (100-150 mg/kg), ksylazyny (10 mg/kg) i acepromazyny (2 mg/kg) lub połączenie ketaminy (50 mg/kg) i pentobarbitalu (50 mg/kg). Opisane procedury są ostre i kończą się eutanazją wywołaną przedawkowaniem pentobarbitalu (150 mg/kg), po której następuje torakotomia; Włączenie leku przeciwbólowego nie jest konieczne w przypadku procedury terminalnej.
2. Utrzymuj poduszkę grzewczą pod zwierzęciem przez pozostałą część eksperymentu.
3. Utrzymuj oczy wilgotne solą fizjologiczną buforowaną fosforanami podczas kolejnych chirurgicznych wprowadzania kaniul naczyniowych.
4. Przygotuj kaniulę naczyniową do kolejnych infuzji znaczników fluorescencyjnych. Rurkę polietylenową o długości 20 cm (na przykład średnica wewnętrzna 0,28 mm; średnica zewnętrzna 0,61 mm) umieszcza się na końcówce igły strzykawki, przy czym ostry koniec igły jest wcześniej odłamywany przez zginanie w przód iw tył za pomocą hemostatu.
5. Napełnić strzykawkę i rurkę heparynizowanym (25 j./ml) solą fizjologiczną.
6. Ogol jedną stronę dolnej części brzucha i wykonaj nacięcie, aby odsłonić żyłę udową.
7. Aby kaniulować żyłę udową, zwiąż naczynie szwem 5,0, wykonaj częściowe nacięcie naczynia (około połowy średnicy naczynia) i włóż rurkę do naczynia, zabezpieczając rurkę szwem zawiązanym wokół odcinka kaniulowanego.

3. Przygotowanie do mikroskopii przyżyciowej

1. Rozszerz źrenicę oka kroplą 1% tropikamidowego roztworu okulistycznego, a następnie kroplą 2,5% roztworu okulistycznego hypromelozy.
2. Przykryj oko szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 5 mm.
3. Umieść zwierzę na tablicy z pleksi, która zostanie umieszczona pod obiektywem mikroskopu pionowego. Strategicznie umieść gazę chirurgiczną pod głową, aby umożliwić bezpośrednią oś przez obiektyw do centralnej siatkówki i tarczy optycznej.
4. Ustaw ostrość przez mikroskop na tarczy optycznej, znajdując dysk za pomocą obiektywu 4X o małej mocy i używając filtra fluoresceinowego.

4. Napar z mikrosfer fluorescencyjnych do pomiaru prędkości

1. Używając obiektywu 4X, ustaw ostrość na siatkówce z dyskiem optycznym w środku pola widzenia.
2. Nasycić fluorescencyjny roztwór mikrosfery z szybkością 250 μl/min/kg.
3. Nagraj na wideo widoczną siatkówkę wokół tarczy optycznej, używając czasu naświetlania kamery ~8 ms.
4. Przerwij infuzję mikrosfery, gdy nagrany zostanie wystarczający czas trwania filmu (1-2 min); część roztworu mikrosfery prawdopodobnie pozostanie niewykorzystana.

5. Infuzja fluorescencyjnego markera plazmowego do pomiaru średnic

1. Używając obiektywu 4X, ustaw ostrość na siatkówce z dyskiem optycznym w środku pola widzenia.
2. Przygotowany roztwór fluorescencyjnego dekstranu należy wprowadzić do żyły udowej w bolusie w ciągu ~5 sekund, podczas nagrywania wideo. Ten film pomoże określić tożsamość tętniczek i żyłek, przy czym tętniczki są najpierw perfundowane. Wykonaj ten krok z czasem ekspozycji aparatu ustawionym na ~8 ms, chociaż dokładny czas ekspozycji nie jest krytyczny.
3. Przełącz się na obiektyw 10X i czas naświetlania 20-40 ms, aby poprawić rozdzielczość, aby sfilmować każdą z 4-7 tętniczek i 4-7 żyłek w powierzchownej siatkówce. Ustaw ostrość (i nagraj wideo) na około jednej ćwiartce widocznej siatkówki na raz, ze środkiem dysku optycznego w jednym rogu pola widzenia. Należy dołożyć starań, aby zminimalizować czas, w którym światło mikroskopu oświetla tkankę, aby zmniejszyć możliwość fototoksyczności wywołanej światłem/barwnikiem¹⁷.

6. Analiza wideo

1. Za pomocą skali mikrometrycznej skalibruj system wizyjny pod kątem konwersji μm/piksel.
2. Za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu odtwórz nagrane wideo.
3. Na filmie przedstawiającym wlew bolusa z dekstranu fluorescencyjnego zidentyfikuj tętniczki i żyłki.
4. Dla każdej z 4-7 tętniczek i 4-7 żyłek zarejestrowanych za pomocą obiektywu 10X, zmierz średnice wypełnione fluorescencyjnym dekstranem, średnio 5 pomiarów średnicy na naczynie wzdłuż widocznej długości.
5. Dla każdej z tych samych tętniczek i żyłek zmierz długość smugi mikrosfer fluorescencyjnych, używając 10 kolejnych smug mikrosfery w każdym naczyniu, aby uniknąć błędu selekcji. Podziel długości smug przez czas ekspozycji, aby obliczyć prędkość mikrosfery, na przykład 160 μm/8 ms = 20 μm/ms = 2 cm/s. Uśrednij 10 prędkości na statek.
6. Obliczyć objętościowe natężenie przepływu dla każdego naczynia za pomocą następującego równania: przepływ = średnia prędkość × π × średnica²/4.
7. Zsumuj natężenia przepływu tętniczego i oddzielnie natężenia przepływu komorowego, aby uzyskać całkowity przepływ krwi w siatkówce.

Wyniki

Rycina 1 przedstawia pojedyncze klatki z filmu z eksperymentu, przy czym panele A–D oraz F–I pokazują smugi fluorescencyjnych mikrokul, uchwycone przy użyciu obiektywu 4X i czasie naświetlania 8 ms (oraz binningu 2 × 2 piksele w celu zmniejszenia rozmiaru pliku wideo). Rycina 1E przedstawia orientację naczyń siatkówki na pozostałych panelach ryciny. Nie każda klatka filmu będzie zawierać ostro skupioną smugę fluorescencyjną; jednak niektóre klatki mogą zawierać wiele smug możliwych do wy...

Dyskusja

Ta technika przyżyciowej mikroskopii wideo może być stosowana nie tylko u myszy, ale także u szczurów. Protokół ten opiera się tylko na kilku założeniach, ale jest ograniczony do stosowania w znieczuleniu i z rozszerzeniem źrenicy, jak to opisaliśmy. Pozostałe założenia i ograniczenia są następujące:

1. Założenie minimalnego błędu powiększenia optycznego wynikającego z refrakcyjnej natury oka. Jak opisali inni^18-20, metoda wypełniania przestrzeni między rogówką a szk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikrosfery fluorescencyjne	Bangs Laboratories	FS04F/10584 (zielone)
Sondy molekularne	fluorescencyjnego dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej	D-7137 (zielone); D-7139 (czerwony)
System mikroskopowy	Nikon	Eclipse E600FN + nasadki
Obiektyw 4X	Nikon	Plan Fluor 4X	przysłona numeryczna 0,13; odległość robocza 17,2 mm
obiektyw 10X	Nikon	Plan 10X	przysłona numeryczna 0,25; odległość robocza 10,5 mm
Tropicamid roztwór okulistyczny	Bausch Lomb	1% tropicamid
Hypromeloza roztwór okulistyczny	HUB Pharmaceuticals	2,5% Goniovisc
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu	Uniwersytet Kalifornijski San Francisco Vale Lab	Micro-Manager
Cyfrowa kamera wideo do mikroskopii	Fotometria	CoolSnap ES	Rozdzielczość 1392 x 1040 pikseli; Rozmiar piksela 6,45 x 6,45 μ mln