Konstrukcja i działanie komory do ciągłego znakowania izotopami 13C i 15N do jednorodnego lub różnicowego, metabolicznego i strukturalnego znakowania izotopów roślinnych

Podsumowanie

Ta metoda wyjaśnia, jak zbudować i obsługiwać ciągłą komorę do znakowania izotopów ¹³C i ¹⁵N do jednolitego lub zróżnicowanego etykietowania tkanek roślinnych. Omówiono reprezentatywne wyniki znakowania metabolicznego i strukturalnego Andropogon gerardii.

Streszczenie

Śledzenie rzadkich stabilnych izotopów od materiału roślinnego przez ekosystem dostarcza najbardziej wrażliwych informacji o procesach ekosystemowych; od strumieni CO₂ i tworzenia się materii organicznej w glebie do sondowania biomarkerów stabilnych izotopów na małą skalę. Sprzężenie wielu stabilnych izotopów, takich jak ¹³C, z ¹⁵N, ¹⁸O lub ²H, może ujawnić jeszcze więcej informacji na temat złożonych relacji stechiometrycznych podczas przemian biogeochemicznych. Materiał roślinny znakowany izotopami był wykorzystywany w różnych badaniach rozkładu ściółki i tworzenia się materii organicznej w glebie^1-4. Z tych i innych badań wynika jednak, że składniki strukturalne materiału roślinnego zachowują się inaczej niż składniki metaboliczne (tj. wymywalne związki o niskiej masie cząsteczkowej) pod względem wykorzystania mikrobiologicznego i długoterminowego magazynowania węgla^5-7. Możliwość oddzielnego badania składników strukturalnych i metabolicznych stanowi nowe, potężne narzędzie do rozwoju czołówki badań biogeochemicznych ekosystemów. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania materiału roślinnego znakowanego ¹³C i ¹⁵N, który jest albo jednolicie znakowany w całej roślinie, albo znakowany różnicowo w strukturalnych i metabolicznych składnikach rośliny.

Tutaj prezentujemy budowę i działanie ciągłej komory znakującej ¹³C i ¹⁵N, która może być modyfikowana w celu spełnienia różnych potrzeb badawczych. Jednolicie oznakowany materiał roślinny jest wytwarzany poprzez ciągłe etykietowanie od sadzonki do zbioru, podczas gdy etykietowanie różnicowe uzyskuje się poprzez usunięcie rosnących roślin z komory na kilka tygodni przed zbiorem. Reprezentatywne wyniki uprawy Andropogon gerardii Kaw wskazują na zdolność systemu do skutecznego znakowania materiału roślinnego na docelowych poziomach. Dzięki tej metodzie wyprodukowaliśmy materiał roślinny o jednolitej etykiecie roślinnej 4,4 atomu%¹³C i 6,7 atomu%¹⁵N lub materiał, który jest znakowany różnicowo przez maksymalnie 1,29 atomu%¹³C i 0,56 atomu%¹⁵N w swoich składnikach metabolicznych i strukturalnych (odpowiednio składniki ekstrahowane gorącą wodą i resztkowe gorącej wody). Wyzwania polegają na utrzymaniu odpowiedniej temperatury, wilgotności, stężenia CO₂ i poziomu światła w szczelnej atmosferze ¹³C-CO_{2 dla} udanej produkcji roślinnej. Ten opis komory stanowi użyteczne narzędzie badawcze do efektywnego wytwarzania jednorodnie lub różnicowo znakowanego wieloizotopowo materiału roślinnego do wykorzystania w eksperymentach nad cyklem biogeochemicznym ekosystemu.

Wprowadzenie

Zrozumienie dynamiki procesów zachodzących między roślinami, glebą i atmosferą jest kluczowe dla dokładnego przewidywania, jak funkcjonują globalne cykle węgla (C) i azotu (N) w obecnych i przyszłych warunkach środowiskowych. Izotopy stabilne są potężnymi narzędziami w badaniach ilościowych obiegu C i N roślina, gleba i atmosfera. Śledzenie rzadkich stabilnych izotopów z materiału roślinnego przez ekosystem dostarcza wrażliwych informacji w badaniach cykli biogeochemicznych, od strumieni CO₂ i tworzenia się materii organicznej w glebie po sondowanie biomarkerów stabilnych izotopów na małą skalę, np. ^4,8,9. Połączenie znakowania ¹³C ze znakowaniem ¹⁵N lub innymi stabilnymi izotopami, takimi jak ²H lub ¹⁸O w tkance roślinnej, zapewnia wysoce wykrywalny, identyfikowalny, a jednocześnie złożony substrat do wykorzystania w sprzężonych badaniach biochemii roślin i gleby. Możliwość jednolitego lub zróżnicowanego znakowania strukturalnego i metabolicznego materiału roślinnego zwiększa możliwości rozwiązywania złożonych pytań dotyczących obiegu C i N w ekosystemach. Korzyści płynące z zastosowania materiału roślinnego znakowanego izotopami w badaniach ilościowych rozliczania C i N zależą jednak od zdolności do wytworzenia materiału znakowanego ^{izotopowo 13}C i ¹⁵N, który jest znakowany jednolicie lub różnicowo.

Oznaczanie izotopów zostało użyte w badaniach dotyczących asymilacji roślin C i N¹⁰, alokacji¹¹ i ryzodowania¹². Jednolicie znakowany ¹³C i ¹⁵N materiał roślinny stanowi złożony oznakowany substrat do badań rozkładu ściółki^1,4, tworzenia materii organicznej w glebie^2,6, emisji CO₂ w glebie⁴, badań sieci troficznej w glebie¹³ oraz badań czasu przebywania C w glebie^2,14. Badania wykorzystujące biowęgiel znakowany ¹³C z oznakowanego materiału roślinnego zaczynają również ujawniać nowe informacje na temat wcześniej pomijanych basenów z węglem glebowym¹⁵. Podczas gdy znakowanie ¹⁵N, ²H i ¹⁸O jest stosunkowo łatwe do osiągnięcia poprzez uzdatnianie wody i nawozów, wyzwaniem jest produkcja jednorodnie znakowanego ¹³C materiału roślinnego poprzez wiązanie ¹³C-CO₂ .

Ciągłe oznaczanie izotopów od siewki do dojrzałości w szczelnej komorze powoduje jednolite oznaczanie izotopów w całej roślinie. Inne metody, takie jak wielokrotne znakowanie impulsowe¹⁶ i stosowanie dolistne lub odprowadzanie wilgoci^17,18, nie prowadzą do uzyskania jednolicie znakowanego izotopowo materiału roślinnego ani wyraźnego różnicowego znakowania określonych związków C (np. metabolicznych i strukturalnych)¹⁹. Ważnym czynnikiem przy znakowaniu izotopów jest skuteczność etykietowania, ze względu na wysoki koszt rzadkich związków wzbogaconych izotopami stosowanych do znakowania. Chociaż ciągłe znakowanie ¹³C było stosowane w ciągu ostatnich^2-4,20 lat, o ile nam wiadomo, nie ma opublikowanego szczegółowego opisu technicznego komory do ciągłego etykietowania z dowodami na wysoką skuteczność etykietowania i dokładną kontrolę ilości i jednorodności znakowania izotopów.

Na czele badań nad rozkładem ściółki i tworzeniem materii organicznej w glebie znajduje się koncepcja, że metaboliczny materiał roślinny (tj. wymywalne, labilne, niskocząsteczkowe związki) i strukturalny materiał roślinny (np. lignina, celuloza, hemiceluloza) są przetwarzane inaczej pod względem efektywności wykorzystania mikroorganizmów, tworzenia materii organicznej w glebie i długoterminowego przechowywania węgla w glebie^5-7. Materiał roślinny, który jest różnie oznakowany pod względem składników strukturalnych i metabolicznych, jest zatem użytecznym narzędziem w postępach w badaniach nad rozkładem ściółki i tworzeniem się materii organicznej w glebie. Znakowanie różnicowe za pomocą podwójnych izotopów pozwala na śledzenie składników strukturalnych i metabolicznych oddzielnie w ekosystemie przy użyciu techniki izotopów wielopulowych²¹.

Ciągłe znakowanie izotopów ^{z 13}C i innymi izotopami w szczelnej komorze wymaga szczególnej uwagi na warunki fizjologiczne roślin, aby zmaksymalizować produktywność roślin i efektywność znakowania izotopów. Skoki temperatury w ciągu dnia muszą być kontrolowane, aby zapobiec uszkodzeniom roślin podczas uprawy w hermetycznej komorze. Optymalny zakres wilgotności i temperatury jest wymagany do utrzymania otwartych aparatów szparkowych roślin i pobierania CO₂₂ ^. Wysoki poziom wilgotności powoduje zaparowanie ścianek komory, co minimalizuje dostępność światła i może uszkodzić konstrukcję komory. W przypadku pracy z drogimi związkami znakowanymi ciężkimi izotopami ważne jest staranne rozważenie skuteczności znakowania izotopów poprzez eliminację naturalnych izotopów obfitości z komory (np. pochodzących z zasiewania materią organiczną w glebie) i zapobieganie narażeniu na powietrze zewnętrzne.

Tutaj prezentujemy metodę budowy i obsługi ciągłej podwójnej komory do znakowania izotopów ¹³C i ¹⁵N do produkcji materiału roślinnego, który jest albo jednolicie oznakowany, albo ma swoje składniki strukturalne i metaboliczne znakowane na różnych poziomach. ¹³Znakowanie C jest kontrolowane na poziomie komory, natomiast nawożenie i znakowanie ¹⁵N jest kontrolowane na poziomie poszczególnych doniczek. Wykazano, że reprezentatywne wyniki wykazują zdolność tej metody do kontrolowania temperatury, wilgotności i stężenia CO₂ przez cały sezon wegetacyjny. Wyniki uprawy Andropogon gerardii, Kaw pokazują również zdolność tej metody do wytwarzania jednolicie lub różnie znakowanego materiału roślinnego. Opisana konkretna konstrukcja i schemat działania komory mogą być modyfikowane w celu uprawy różnych gatunków roślin, a także w celu dostosowania do oznakowania ²H lub ¹⁸O.

Protokół

1. Budowa komory

1. Zbuduj komorę etykietowania w szklarni, aby zapewnić maksymalny potencjał naturalnego światła do wzrostu roślin. Upewnij się, że dostępne jest odpowiednie zasilanie do zasilania wszystkich elementów komory.
2. Zbuduj komorę etykietowania, montując przezroczyste ścianki akrylowe o grubości 3,175 mm (odpowiedni byłby również poliwęglan) i przezroczysty sufit akrylowy o grubości 6,35 mm na aluminiowej ramie z pomalowaną na biało stalową podłogą, aby zmaksymalizować współczynnik odbicia promieni słonecznych. Wymiary komory mogą być dostosowane do indywidualnych potrzeb badawczych.
3. Zamontuj komorę na sklejce 3/4 cala (19 mm) na blokach żużlowych.
4. Wywierć otwory w szkle akrylowym, aluminiowej ramie i stalowej podłodze i użyj, aby połączyć ze sobą wszystkie elementy.
5. Uszczelnij wszystkie szwy silikonową uszczelką, aby zapewnić hermetyczne uszczelnienie.
6. Zbuduj drzwi, montując jedną część paneli akrylowej na długich, które można przykręcić za pomocą zdejmowanych nakrętek motylkowych.
7. Uszczelnij drzwi listwą uszczelniającą, aby zapobiec wyciekom powietrza.
8. Wybierz obszar bezpośrednio przylegający do komory jako centrum sterowania, aby zamontować wszystkie urządzenia sterujące temperaturą, wilgotnością, CO₂ i monitorujące.
9. Ostrożnie wywierć małe otwory w ścianie komory przylegającej do centrum sterowania na wszystkie przewody elektryczne i przewody gazowe. Użyj silikonowej uszczelki, aby uszczelnić otwory wokół wszystkich przewodów i rurek, aby zapobiec wyciekom powietrza.
10. Przetestuj komorę pod kątem wycieków powietrza, napełniając ją wysokim poziomem CO₂ (np. 800 ppm) i pozostawiając na noc. Jeśli stężenie CO₂ w komorze jest utrzymywane na pierwotnym poziomie, oznacza to, że jest ona szczelna. Jeśli stężenie spadnie z dnia na dzień, wszystkie szwy należy zbadać i ponownie uszczelnić silikonową uszczelką, aż do uzyskania hermetycznego uszczelnienia.
11. W przypadku niektórych roślin przystosowanych do warunków silnego oświetlenia należy dodać światła podłączone do zegara na bezpośredniej zewnątrz komory, aby zwiększyć penetrację światła i produktywność roślin.

2. Kontrola temperatury i wilgotności

1. Reguluj temperaturę w komorze, instalując komercyjny klimatyzator typu split z wężownicami chłodzącymi (parownika) umieszczonymi wewnątrz komory oraz wężownicami sprężarki i skraplacza umieszczonymi na zewnątrz szklarni w celu odprowadzania ciepła. Ustaw klimatyzator tak, aby utrzymywał żądaną temperaturę.
2. Użyj małego osuszacza pokojowego, aby kontrolować wilgotność w komorze.
   1. Wywierć otwór drenażowy w podłodze komory przylegającej do osuszacza.
   2. Wyjmij kolektor kondensatu z osuszacza i podłącz rurkę odpływową z osuszacza przez otwór odpływowy w podłodze komory.
   3. Pod komorą umieść otwarty słoik wypełniony wodą, do której osuszacz będzie mógł spłynąć bezpośrednio. Tworzy to hermetyczne uszczelnienie, ale także pozwala na wyrównanie ciśnienia.
3. Zainstaluj sterownik, taki jak sterownik Omega iSeries, w centrum sterowania z czujnikiem wilgotności wewnątrz komory.
   1. Podłącz sterownik do systemu osuszania za pomocą przekaźnika półprzewodnikowego i ustaw regulator wilgotności z wysokim alarmem i huśtawką, aby utrzymać optymalne warunki wzrostu w komorze. Optymalne warunki temperatury i wilgotności będą się różnić dla różnych gatunków roślin.

3. Kontrole CO₂

1. Wzbogacenie ¹³C-CO₂ uzyskuje się przy użyciu dwóch zbiorników czystego gazu CO_{2 ,} jednego o stężeniu 10 atomów%¹³C-CO₂ lub wyższym, a drugiego o zawartości 1,1 atomu%¹³C-CO₂ (naturalna obfitość).
2. Monitorowanie stężenia CO₂ polega na tym, że pompa membranowa w sposób ciągły zasysa powietrze z komory przez analizator gazów w podczerwieni (IRGA), a następnie pompuje powietrze z powrotem do komory, utrzymując w ten sposób zamknięty system (rysunek 1).
3. Ustaw niski alarm i martwą strefę w oprogramowaniu IRGA, aby utrzymać stężenie CO₂ w żądanym zakresie. W tym przypadku używamy niskiego alarmu 360 ppm ze strefą martwą 40 ppm, aby utrzymać stężenie CO₂ w zakresie 360-400 ppm.
4. Podłącz zawór dozujący do każdego zbiornika i ostrożnie je wyreguluj, aby osiągnąć docelowy poziom wzbogacenia ¹³C. Ustaw regulatory zbiornika na 20 psi.
5. Włóż zawór elektromagnetyczny między zawór dozujący a regulator każdego zbiornika. Połącz ze sobą wyloty dwóch zaworów dozujących i doprowadź je do środka komory. Podłącz przekaźnik półprzewodnikowy do wyjścia IRGA, aby sterować zaworami elektromagnetycznymi (rysunek 1).

4. Internetowy system zdalnego monitorowania

1. Monitoruj stężenia CO₂ z oprogramowania IRGA, logując je do lokalnego pliku raz na 30 sekund.
2. Utwórz niestandardowe narzędzie (np. w perlu lub innym języku programowania), aby pobrać wpisy z lokalnego pliku rejestrowania CO₂ wraz z aktualnym znacznikiem czasu laptopa i przesłać je do aplikacji internetowej zaplecza.
3. Ustaw aplikację internetową tak, aby wysyłała zapytania dotyczące danych czujnika temperatury i wilgotności.
4. Użyj systemu monitorowania, aby sprawdzać stan temperatury w komorze co pięć minut, aby zapobiec potencjalnym skokom temperatury, które zniszczyłyby rośliny w przypadku awarii systemu klimatyzacji.
5. Monitoruj dane dotyczące_CO2, temperatury i wilgotności w dowolnej standardowej przeglądarce internetowej, aby wszelkie nieoczekiwane skoki temperatury lub spadki CO₂ mogły być natychmiast zareagowane.

5. System nawadniania

1. Wywierć jeden mały otwór w ścianie komory ze szkła akrylowego na garnek.
2. Użyj rurki irygacyjnej, aby utworzyć jeden pierścień do nawadniania kropelkowego na doniczkę i przeprowadź rurkę irygacyjną przez ścianę komory na zewnątrz.
3. Uszczelnij otwory wokół rurki irygacyjnej silikonową uszczelką, aby zapobiec wyciekom powietrza.
4. Na zewnątrz komory podłącz rurkę irygacyjną do rurki pompy perystaltycznej.
5. Użyj małego węża clamp, aby zamknąć wszystkie rurki irygacyjne, aby zapobiec wyciekowi powietrza między podlewaniem.

6. Rośliny doniczkowe

1. Wybierz rozmiar doniczki odpowiedni dla uprawianych roślin. Tutaj używane są doniczki o pojemności 40, 15 litrów.
2. Stwórz wolną od gleby mieszankę doniczkową, mieszając piasek, wermikulit i profilowaną porowatą ceramikę.
3. Przetestuj zdolność zatrzymywania wody w mieszance doniczkowej, ważąc napełniony garnek do sucha, mocząc garnek w wodzie i pozwalając mu całkowicie spłynąć, a następnie ważąc garnek mokry. Użyj tej maksymalnej zdolności zatrzymywania wody, aby upewnić się, że nadmiar oznakowanego nawozu i wody nie wycieknie z doniczek podczas podlewania.
4. Kiełkuj nasiona w ziemi doniczkowej przed posadzeniem ich w doniczkach. Gwarantuje to, że w komorze etykietowania umieszczane są tylko pomyślnie wykiełkowane nasiona.
5. Zaszczep sadzonki świeżą gnojowicą glebową, aby wprowadzić pożyteczne mikroorganizmy.
6. Gdy nasiona wykiełkują, ostrożnie przeszczep sadzonki do doniczek w żądanej liczbie.
7. Po posadzeniu w doniczce przenieś doniczki do komory i zmontuj każdą doniczkę za pomocą indywidualnego węża do nawadniania.

7. Uszczelnienie komory

1. Podczas pierwszego uszczelnienia drzwi do komory, przestrzeń komory wypełnia duża masa powietrza zewnętrznego. Usuń ten zewnętrzny CO_{2 ,} podłączając płuczkę sodowo-wapniową do pompy powietrza, aby szorować stężenie CO₂ do co najmniej 200-250 ppm przed ponownym napełnieniem komory do 400 ppm za pomocą mieszaniny ^{zbiornika 13}C-CO₂.
2. Staraj się, aby komora była zamknięta przez cały okres wegetacji, aby zminimalizować naturalne zanieczyszczenie CO₂ w obfitości.
3. Monitoruj wizualnie wzrost roślin i dostosuj nawożenie i nawadnianie do zapotrzebowania.

8. Nawożenie i nawadnianie

1. Użyj roztworu nawozu, takiego jak zmodyfikowany roztwór Hoaglanda²³, aby nawozić rośliny przez system nawadniania.
2. Oznaczyć nawóz ¹⁵N, stosując podroztwór ¹⁵N-KNO₃ na docelowym poziomie atomu%¹⁵N, mieszając 98 atomów%¹⁵N-KNO₃z naturalną obfitością ¹⁵N-KNO₃ (0,37 atomu%¹⁵N).
3. Wymieszaj wystarczającą ilość roztworu nawozu przy każdym nawożeniu dla całej komory, w oparciu o zdolność zatrzymywania wody przez mieszankę doniczkową. Umieść odpowiednią ilość nawozu na jedną doniczkę w szklanym słoiku i przygotuj tyle słoików, ile jest doniczek.
4. Odkręć węże irygacyjne i umieść każdy z nich w słoiku z roztworem nawozu, a następnie podłącz je do pompy perystaltycznej.
5. Podlewaj rośliny, pompując wodę przez pompę perystaltyczną przez poszczególne węże do nawadniania kropelkowego regularnie, gdy rośliny tego potrzebują.
6. Nawożenie roztworem Hoaglanda powinno być zgodne z zapotrzebowaniem roślin lub projektem eksperymentalnym, przy rosnącym zapotrzebowaniu na składniki odżywcze wraz ze wzrostem produktywności roślin, aby zmaksymalizować produktywność.
7. Najpierw przepompuj roztwór Hoaglanda przez wąż irygacyjny, a następnie przepompuj przez niego płukanie wodą, aby zminimalizować rozwój glonów i bakterii w rurkach.
8. Ponownie zamocuj wszystkie węże po nawożeniu i nawadnianiu, aby wyeliminować wyciek powietrza z komory.

9. Etykietowanie jednolite i zróżnicowane

1. W celu zróżnicowanego znakowania składników strukturalnych i metabolicznych należy wyjąć rośliny z komory etykietowania 1-3 tygodnie przed zbiorem. Rośliny, które mają być równomiernie oznakowane, mogą pozostać w szczelnie zamkniętej komorze etykietowania w sposób ciągły aż do zbiorów i być nawadniane roztworem ¹⁵N-Hoaglanda.
W
2. tym czasie należy przechowywać usunięte rośliny w szklarni, aby otrzymywały odpowiednią ilość światła i CO₂ przy naturalnej obfitości ¹³C.
3. W przypadku różnicowego oznaczania ¹⁵N należy kontynuować nawożenie i nawadnianie roślin jak zwykle, ale należy użyć naturalnej obfitości ¹⁵N-KNO₃ w roztworze nawozu Hoaglanda.

10. Żniwa

1. Przestań podlewać rośliny na 1 tydzień przed zbiorami, aby rośliny zaczęły starzeć się, a podłoże doniczkowe wyschło.
2. Otwórz komorę i wyjmij doniczki w celu natychmiastowego strzyżenia i zbioru biomasy nadziemnej
3. Wylej mieszankę doniczkową i korzenie na grube sito.
4. Użyj sitka, aby oddzielić korzenie od mieszanki doniczkowej i potrząśnij korzeniami z mieszanki doniczkowej.
5. Umieść korzenie na sitku o średnicy 2 mm i opłucz je wodą, aby usunąć pozostały materiał doniczkowy. Użyj pęsety, aby usunąć wermikulit, który może przylegać do korzeni
.
6. Pozostaw korzenie do wyschnięcia na powietrzu w ramach przygotowań do przyszłych eksperymentów.

11. Chemia ściółki

1. Zważyć powietrznie suchy materiał roślinny, aby określić biomasę w komorze etykietowania.
2. Zmielić podpróbkę do analizy chemicznej.
3. Umieścić 2,0 g ściółki wysuszonej w piekarniku (60 °C) w 125 ml kolbie przemytej kwasem i dodać 50 ml wody dejonizowanej.
4. Umieścić próbkę na podgrzanej (60 °C) płycie mieszadła i umieścić mieszadło w kolbie. Ustawić mieszanie na 200 obr./min i pozostawić próbkę do ogrzewania przez 30 minut.
5. Po 30 minutach przefiltruj roztwór ściółki przez siatkę nylonową o grubości 20 μm w systemie filtracji próżniowej.
6. Przenieś ekstrakt do wstępnie zważonej probówki przemytej kwasem i zamroź.
7. Przenieść resztki ściółki na wstępnie zważoną aluminiową miskę i wysuszyć w temperaturze 60 °C. Po wysuszeniu zważyć miskę i ściółkę w celu określenia masy pozostałości gorącej wody.
8. Liofilizować ekstrakt z gorącej wody i zważyć, aby określić masę ekstraktu z gorącej wody.
9. Analizuj ściółkę suszoną w piecu (60 °C), liofilizowany ekstrakt z gorącej wody i pozostałości gorącej wody suszonej w piekarniku w spektrometrze mas analizatora elementarnego - stosunek izotopów (EA-IRMS).

Wyniki

Nasza komora znakowania ma wymiary 1,2 m x 2,4 m x 3,6 m i mieści donice o pojemności 40,15 L (Rysunek 1). Komputeryzowany system sterowania IRGA utrzymywał stężenia CO₂ w zakresie ustalonych wartości od 360 do 400 ppm podczas dziennego okresu aktywności fotosyntetycznej (Rysunek 2a). Funkcja alarmu niskiego poziomu CO₂ w systemie IRGA uruchamiała zawory elektromagnetyczne, umożliwiając dopływ CO₂ z zbiorników z naturalnym stężeniem oraz wzbogaconych w ¹³C do komory, gdy stężenie spadło poniżej progu minimalnego (np. 360 ppm). Funkcja martwej strefy zatrzymywała przepływ, gdy stężenie osiągało górny punkt nastawy (np. 400 ppm). System monitorowania temperatury i wilgotności iSeries, połączony z klimatyzatorem i osuszaczem powietrza, utrzymywał warunki klimatyczne w zadanych parametrach przez cały sezon wegetacyjny (Rysunek 2b). Do chłodzenia komory wykorzystaliśmy jednostkę klimatyzacyjną o mocy jednej tony (3,5 kW).

System zdalnego monitorowania umożliwiał przeglądanie zarejestrowanych danych w dowolnym momencie za pomocą standardowej przeglądarki internetowej. Stężenia CO₂, wartości temperatury i wilgotności były poddawane próbkowaniu w aplikacji internetowej w celu wyświetlania wykresów z ostatnich 24–240 h w odstępach 24-godzinnych. Pozwalało to na szybką wizualną weryfikację, czy dobowe wahania mieściły się w oczekiwanych granicach. Interfejs internetowy wyświetlał również aktualny stan komory oraz generował powiadomienia o potencjalnych problemach, takich jak brak otrzymywania bieżących danych. W dowolnym momencie z interfejsu internetowego można było również pobrać pełny zestaw danych.

Za pomocą czujnika kwantowego zmierzono promieniowanie czynne fotosyntetycznie (PAR) w bezpośrednim wnętrzu i na zewnątrz komory w czterech punktach, przy włączonym i wyłączonym oświetleniu, w połowie lata i w połowie dnia. Wartość PAR w komorze była o 31,5% niższa niż na zewnątrz przy wyłączonym oświetleniu komory oraz o 22% niższa niż na zewnątrz przy włączonym oświetleniu. Zatem oświetlenie komory pomaga znacząco zwiększyć penetrację PAR wewnątrz komory o 9,5% (P<0.05).

Nasz system ciągłego znakowania pozwolił na uzyskanie 2759 g biomasy A. gerardii, z czego 37% stanowiła biomasa nadziemna, a 63% biomasa podziemna. Osiągnęliśmy znakowanie całej rośliny na poziomie 4,4 atom%¹³C w jednorodnym materiale roślinnym poprzez odpowiednie ustawienie zaworów elektromagnetycznych w dwóch zbiornikach z CO₂ (Rycina 1, Tabela 1). Uzyskano znakowanie całej rośliny na poziomie 6,7 atom%¹⁵N w jednorodnym materiale roślinnym poprzez zmieszanie 98 atom%¹⁵N-KNO₃ z 0,37 atom%¹⁵N-KNO₃ w podroztworze KNO₃ zmodyfikowanej pożywki Hoaglanda²³ (Tabela 1). Rośliny A. gerardii podlewano co tydzień łącznie 750 ml cieczy (woda oraz pożywka Hoaglanda) przez cały sezon wegetacyjny. Nawożenie przeprowadzano za pomocą 200-500 ml pożywki Hoaglanda znakowanej ¹⁵N na tydzień, w zależności od produktywności roślin.

Wykorzystaliśmy metodę ekstrakcji gorącą wodą, aby ustalić, czy istnieją różnice izotopowe między materiałem roślinnym znakowanym jednorodnie a materiałem znakowanym różnicowo. W przypadku roślin znakowanych różnicowo, podczas zbiorów usunęliśmy wszystkie całkowicie obumarłe liście i potraktowaliśmy je oddzielnie, ponieważ prawdopodobnie nie były one znakowane różnicowo. Analizując zawartość ¹³C, wszystkie cztery dni inkorporacji różniły się znacząco od siebie w przypadku całej rośliny oraz ekstraktu z gorącej wody, natomiast dla pozostałości po ekstrakcji gorącą wodą dni 14 i 22 nie wykazywały istotnych różnic (Tabela 1). Porównując frakcje tkanek roślinnych w ramach każdego dnia, ekstrakt i pozostałość z gorącej wody różniły się znacząco od siebie przez wszystkie cztery dni, a do 22. dnia cała roślina, ekstrakt i pozostałość różniły się od siebie w sposób istotny (Tabela 1). W odniesieniu do inkorporacji ¹⁵N w komponenty roślinne, zaobserwowano różnice między dniami inkorporacji a frakcjami tkanek roślinnych. Dla ekstraktu z gorącej wody wszystkie cztery dni inkorporacji różniły się znacząco od siebie pod kątem ¹⁵N, a dla całej rośliny i pozostałości po ekstrakcji gorącą wodą krótsze okresy inkorporacji różniły się znacząco od dłuższych okresów inkorporacji (Tabela 1). Frakcje tkanek roślinnych w roślinach znakowanych jednorodnie nie różniły się znacząco od siebie pod kątem ¹⁵N, natomiast ekstrakt i pozostałość z gorącej wody różniły się znacząco pod kątem ¹⁵N w przypadku ściółki znakowanej różnicowo.

Wszystkie wartości izotopowe podano w zapisie procentowym atomowym (atom %) (Równanie 1), który jest dokładniejszym zapisem niż % przy wysokich poziomach wzbogacenia w ciężki izotop²¹. Na przykład:

(1)

W niniejszym badaniu przeprowadziliśmy analizy statystyczne przy użyciu programu SAS w wersji 9.2. Różnice między poziomami natężenia światła wewnątrz i na zewnątrz komory przetestowano za pomocą testu t-studenta dla prób zależnych. Różnice w znakowaniu ¹³C i ¹⁵N ekstraktów wodnych oraz pozostałości po ekstrakcji wodnej przetestowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) w procedurze PROC ANOVA. Do analizy porównań wielokrotnych wykorzystano test wielu zakresów Duncan'a. Istotność przyjęto na poziomie P = 0,05. Aby sprawdzić, czy dane spełniają założenia analizy, zastosowano test sum rang Wilcoxona.

Rycina 1. Schemat komory do ciągłego znakowania wieloizotopowego o pojemności 40 doniczek widziany z góry. Linie przerywane reprezentują okablowanie elektryczne, natomiast linie ciągłe reprezentują rurki doprowadzające gaz lub wodę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 2. A) Średnie stężenie CO₂ (ppm) (+/- SE) w ciągu doby dla całego sezonu wegetacyjnego. B) Średnia temperatura (ºC), otwarte kółka, oraz wilgotność (%), zamknięte kółka (+/- SE) w ciągu doby dla całego sezonu wegetacyjnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

		Jednolity (0)	Różnicowanie (7)	Różnicowanie (14)	Różnicowanie (22)
Cały miot	13At % C	4,46±0,02 Aab	3,93±0,05 Ba	3,64±0,03 Ca	3,35±0,06 Db
	15N At%	6,69±0,07 Aa	6,72±0,01 Aa	6,33±0,06 Ba	6,41±0,07 Ba
Wodny ekstrakt na gorąco	13% atomów C	4,59±0,04 Aa	3,35±0,06 Bb	2,79±0,06 Cb	2,37±0,03 Dc
	15N atom %	6,69±0,03 Aa	6,43±0,01 Bb	5,89±0,07 Db	6,16±0,05 Cb
Osad z gorącej wody	13% atomów C	4,37±0,06 Ab	4,1±0,03 Ba	3,79±0,10 Ca	3,66±0,05 Ca
	15N At %	6,57±0,04 Ba	6,71±0,02 Aa	6,45±0,02 Ca	6,44±0,03 Ca

Tabela 1. Skład izotopowy i chemia ściółki dla ściółki znakowanej jednorodnie i różnicowo. Liczba dni różnicowego znakowania poza komorą podano w nawiasach. Porównania między dniami wbudowy oznaczono wielkimi literami (w wierszach), a porównania między frakcjami ściółki małymi literami (w kolumnach) dla każdej zmiennej.

Dyskusja

Ten projekt komory do ciągłego znakowania izotopów został wykorzystany do produkcji jednorodnie i różnicowo znakowanych ¹³C i ¹⁵N A. gerardii do późniejszych eksperymentów terenowych i laboratoryjnych. W ciągu trzech sezonów wegetacyjnych komora z powodzeniem utrzymywała temperaturę, wilgotność i stężenia CO₂ w zadanych parametrach (rysunek 2). Niezawodność systemu kontroli temperatury ma kluczowe znaczenie w szczycie lata, kiedy wysokie promieniowanie słoneczne może spowodować przegrzanie szczelnej komory. Wyeliminowanie nadmiernej wilgotności spowodowanej transpiracją z rosnących roślin zapewnia, że aparaty szparkowe roślin pozostają otwarte na pobieranie przez fotosyntezę²² oraz że kondensacja wody nie hamuje przenikania światła ani nie uszkadza struktury komory.

Niemal ciągłe monitorowanie stężenia CO₂ przez oprogramowanie IRGA utrzymywało ciągłe znakowanie roślin w ^{temperaturze 13}C podczas ich wzrostu w komorze. Ze względu na wysoką aktywność fotosyntetyczną A. gerardii rosnącego w tej komorze, CO₂ był często wstrzykiwany do systemu w godzinach dziennych szczytu sezonu wegetacyjnego, kiedy aktywność fotosyntetyczna obniżała stężenie CO₂ do 360 ppm, mniej więcej co 15-20 minut. Dozowanie ¹³zbiorników C-CO 2 o wzbogaconej i naturalnej obfitości_pozwoliło na uzyskanie kontrolowanej atmosfery o temperaturze 4,4% ¹³C przez cały sezon wegetacyjny w celu jednolitego znakowania tkanek roślinnych. ¹³Produkcję C-CO₂ można również osiągnąć przez zmieszanie ¹³C-wodorowęglanu sodu lub ¹³C-węglan sodu i kwas solny, jednak ten typ systemu jest bardziej skomplikowany i wymaga więcej monitorowania i konserwacji, dlatego zalecamy stosowanie gazu ¹³C-CO₂ . Ważną kwestią przy monitorowaniu stężeń CO₂ za pomocą IRGA jest to, że analizatory podczerwieni tracą dwie trzecie swojej czułości podczas pomiaru ¹³C-CO_{2 .} To niedoszacowanie o około 2,9% ppm dla naszej mieszaniny 4,4%¹³C-CO₂ nie było dla nas wielkim problemem, ale może stać się bardziej znaczącym problemem przy etykietowaniu przy wyższych poziomach ¹³C²⁷.

A. gerardii to wieloletni gatunek graminoidów preriowych z ciepłą porą roku. Konstrukcja tej komory została zoptymalizowana pod kątem produkcji A. gerardii (ryc. 1). Wielkość i wysokość komory zostały dobrane z uwzględnieniem maksymalnej produktywności wysokościowej A. gerardii w terenie, a także pożądanej produkcji biomasy roślinnej do przyszłych eksperymentów. Wiadomo, że A. gerardii ma ograniczone światło w polu^24,25. PAR w szklarni może być zmniejszony o 30-47% w porównaniu z poziomami zewnętrznymi²⁶. Ponieważ nasze rośliny były uprawiane w komorze ze szkła akrylowego w szklarni, ograniczenie PAR było problemem. Po włączeniu lampy fluorescencyjne zwiększyły PAR w komorze o 9,5%, co mogło przyczynić się do zwiększenia wydajności u tego wrażliwego na światło gatunku. Korzystając z tej konstrukcji komory do uprawy innych rodzajów roślin, specyficzne potrzeby fizjologiczne, takie jak wielkość, oświetlenie, zapotrzebowanie na składniki odżywcze, wrażliwość na temperaturę i wilgotność gleby, powinny być starannie dostosowane, aby utrzymać optymalne warunki wzrostu roślin.

Podczas pracy z drogimi związkami znakowanymi izotopowo, takimi jak 10 atom%¹³C-CO₂ i 98 atom%¹⁵N-KNO₃, wydajność etykietowania jest ważnym czynnikiem. Ta konstrukcja komory optymalizuje etykietowanie ¹³C, dokładając wszelkich starań, aby uszczelnić komorę i zminimalizować wyciek powietrza do i z komory. Jeżeli komora ta nigdy nie zostanie otwarta w okresie wegetacji, wówczas żaden z ¹³C oznaczonych CO₂ z komory nie wycieka do atmosfery. Wydaje się, że nagromadzenie CO₂ podczas oddychania w nocy nie uszkadza rosnących roślin i jest szybko wchłaniane po wschodzie słońca (ryc. 2). Podczas etykietowania różnicowego komora została na krótko otwarta w celu usunięcia różnie oznakowanych doniczek, ale nie wydaje się, aby to rozcieńczyło docelowe znakowanie 4,4 atomu%¹³C stale znakowanych roślin (Tabela 1). Etykietowanie ¹³C zostało również zoptymalizowane poprzez usunięcie początkowego powietrza atmosferycznego uwięzionego w komorze po uszczelnieniu. Podczas wstępnych badań w komorze bez wstępnego szorowania atmosferycznego CO₂ zmierzono, że rośliny mają rozcieńczony poziom ¹³C w pierwszych wytworzonych liściach niż w późniejszych wyprodukowanych liściach. Wydaje się, że początkowe usuwanie atmosferycznego CO₂ po zamknięciu komory eliminuje ten problem, umożliwiając ciągłe znakowanie ¹³C od sadzonki do dojrzałości. Utrzymanie wolnej od gleby mieszanki doniczkowej piasku, wermikulitu i gliny eliminuje również naturalne zanieczyszczenie CO₂ spowodowane oddychaniem gleby. Eliminacja gleby z systemu wymaga starannego nawożenia i zaszczepiania, które mogą być unikalne dla różnych gatunków roślin. Znakowanie ¹⁵N za pomocą docelowego roztworu 7 atomów%¹⁵N Hoeglanda dało wysoce znakowany materiał roślinny o stężeniu 6,7 atomu%¹⁵N (Tabela 1). Niewielkie rozcieńczenie w stosunku do docelowej zawartości ¹⁵N może być spowodowane pewną naturalną obfitością N w mieszance doniczkowej lub szczepieniem w glebie rodzimej.

Podczas biosyntezy związków dochodzi do naturalnej dyskryminacji ¹³C (lub ¹⁵N) w wyniku frakcjonowania kinetycznego i niestatystycznego rozkładu izotopów w syntetyzowanych związkach. Tak więc w przypadku C produkty wtórne (np. lipidy, związki fenolu) są na ogół zubożone w ¹³C w porównaniu z produktami początkowymi (węglowodanami). Wydaje się, że ta naturalna dyskryminacja ¹³C utrzymuje się również wtedy, gdy rośliny są uprawiane w atmosferze wzbogaconej ^{o 13}C, co można zaobserwować w niewielkiej różnicy w atomie%¹³C ekstraktów gorącej wody i pozostałości gorącej wody w jednolicie oznakowanych roślinach (Tabela 1). To naturalne frakcjonowanie kinetyczne jest bardzo małe w porównaniu ze wzbogacaniem i nie wpływa negatywnie na jednorodność etykietowania.

Różnicowe znakowanie strukturalnych i metabolicznych tkanek roślinnych jest nowatorską techniką, która może znaleźć się w zaawansowanych badaniach nad rozkładem ściółki, ekologią mikrobiologiczną i tworzeniem się materii organicznej w glebie. Różnica w ¹³C i ¹⁵N ekstraktów z gorącej wody i pozostałości gorącej wody wskazuje na znaczne rozcieńczenie ¹³C i ¹⁵N w wymywalnych związkach o niskiej masie cząsteczkowej (ekstrakty z gorącej wody) ze strukturalnego materiału roślinnego (pozostałości gorącej wody) po 7, 14 i 22 dniach znakowania różnicowego (P<0,005). To różnicowe znakowanie tkanek roślinnych może być wykorzystane do śledzenia losu składników strukturalnych i metabolicznych oddzielnie w ekosystemie. Etykietowanie różnicowe ¹³C było bardziej ekstremalne niż etykietowanie różnicowe ¹⁵N. Może to wynikać z natychmiastowego rozcieńczenia ¹³C podczas wyjmowania roślin z atmosfery znakowanej ¹³C-CO_{2 ,} podczas gdy etykieta ¹⁵N pozostaje jeszcze przez jakiś czas w mieszance doniczkowej, a rozcieńczenie ¹⁵N następuje wolniej. W przypadku bardziej drastycznego różnicowego oznaczania ¹⁵N, można rozważyć przepłukanie doniczek wodą przed nawożeniem naturalną obfitością w ostatnich tygodniach wzrostu poza komorą.

Konstrukcja i działanie tego systemu ciągłego znakowania ¹³C i ¹⁵N do jednolitego lub różnicowego, metabolicznego i strukturalnego znakowania tkanek roślinnych zapewnia nowatorską metodę produkcji izotopowo znakowanego materiału roślinnego do zaawansowanych badań. Konstrukcja i szczegóły operacyjne tej komory zostały wybrane do znakowania A. gerardii 4,4 atomem%¹³C i 7 atom%¹⁵N, ale można je dostosować do innych typów roślin i poziomów znakowania izotopów. Opisane tutaj warunki uprawy powinny być dostosowane do wielkości, temperatury, wilgotności, światła, wody i wymagań odżywczych poszczególnych gatunków roślin. Etykietowanie za pomocą ¹⁸O lub ²H można również osiągnąć poprzez etykietowanie wody używanej w systemie nawadniania. Opisany tutaj system rozwiązuje wiele problemów związanych z jednolitym i zróżnicowanym etykietowaniem materiału roślinnego w ^{temperaturze 13}C. Ten podstawowy projekt komory może być wykorzystany przez inne grupy badawcze do produkcji wysoce znakowanego materiału roślinnego do zaawansowanych badań biogeochemii ekosystemów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
40-calowy zdalny wentylator wieżowy	Living Accents	FS10-S3R-A
elektryczny wentylator wieżowy z pilotem	LASKO	2559
Mr. Slim Klimatyzator typu split	Mitsubishi Electric	R410A
Elektroniczne 24-godzinne wyłączniki czasowe	Intermatic	ET100C	obsługuje system oświetlenia fluorescencyjnego
Regulator wilgotności i temperatury iSeries	Omega	CHiTH-i8DV33-5-El
Przekaźnik półprzewodnikowy	Omega	SSRL240
serii CKR	Crydon
		6X543
Analizator CO2 GasHound	Osuszacz powietrza LI-COR	LI-800
	Dayton	1DGX4
Regulator gazu specjalnego	Airgas	CGA 580
T5 Wysoka moc wyjściowa Komercyjny system oświetlenia fluorescencyjnego	Hydro Farm	FLT48
Pompa powietrza	Thermo Scientific	420-1901
Masterflex Cartridge Pump HeadSystem	Cole Parmer	7553-70
Przełącznik sieciowy serii 1900	Profil katalizatora
Porus Ceramic Top Dressing	Greens Grade
Przemysłowy kwarc 40 mesh	Unimin	4095
Mycorrhizae Professional Growing Medium	ProMix
Wermikulit i perlit	Thermo-Ran	C633
Azotan potasu - 15N 98 atomów %	Sigma-Aldrich	335134
Węgiel-13C Dwutlenek 10 atomów %	Sigma-Aldrich	600180
Klasa medyczna Regulator CO2	Airgas
	Airgas	CGA 350
4 w pudełku	Grainger
Masterflex PharMed BPT Rurka	Cole Parmer	HV-06508-24

42-calowy Cewki elektromagnetyczne Dayton