Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do wizualizacji i ilościowego określenia dynamiki wzrostu wakuoli Chlamydii w żywych komórkach

DOI:

10.3791/51131

⸱

13 października 2015

 ,  , 
1Division of Allergy and Infectious Diseases, Department of Medicine, University of Washington, 2Program in Infectious Diseases, School of Public Health, University of California at Berkeley

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana jest metoda oparta na białku fluorescencyjnym żywych komórek do oświetlania wakuoli komórkowych (inkluzji) zawierających Chlamydię. Strategia ta umożliwia szybkie, zautomatyzowane określenie zakaźności Chlamydii w próbkach i może być wykorzystana do ilościowego badania dynamiki wzrostu inkluzji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieodzowna wewnątrzkomórkowa bakteria Chlamydia stanowi ogromne obciążenie dla globalnego zdrowia publicznego. C. trachomatis jest główną bakteryjną przyczyną infekcji przenoszonych drogą płciową, a także główną przyczyną możliwej do uniknięcia ślepoty na świecie. Istotnym wyznacznikiem udanego zakażenia komórek gospodarza przez Chlamydię jest zdolność bakterii do manipulowania sygnalizacją komórek gospodarza z wnętrza nowego, wakuolarnego przedziału zwanego inkluzją. Z wnętrza inkluzji Chlamydia pozyskuje składniki odżywcze niezbędne do ich 2-3 dniowego wzrostu rozwojowego, a dodatkowo wydzielają panel białek efektorowych na cytozolową powierzchnię błony wakuoli i do cytozolu gospodarza. Luki w naszej wiedzy na temat biologii Chlamydii stanowią jednak poważne wyzwanie dla wizualizacji i analizy tego wewnątrzkomórkowego przedziału. Niedawno opisano strategię odwrotnego obrazowania do wizualizacji inkluzji za pomocą ekspresji komórek gospodarza GFP. Podejście to racjonalnie wykorzystuje wewnętrzną nieprzepuszczalność błony inkluzyjnej dla dużych cząsteczek, takich jak GFP. W tej pracy opisujemy, w jaki sposób generowane są komórki gospodarza wykazujące ekspresję GFP lub mCherry w celu późniejszej wizualizacji inkluzji chlamydii. Co więcej, wykazano, że metoda ta skutecznie zastępuje kosztowne metody liczenia oparte na przeciwciałach, może być stosowana w połączeniu z innymi znacznikami fluorescencyjnymi, takimi jak chlamydia wykazująca ekspresję GFP, i może być wykorzystywana do uzyskania kluczowych danych ilościowych na temat wzrostu błony inkluzyjnej u szeregu gatunków i szczepów Chlamydia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby zakaźne wywoływane przez gatunki wewnątrzkomórkowej bakterii Chlamydia stanowią poważne obciążenie dla zdrowia na całym świecie, w tym choroby przenoszone drogą płciową, zapalenie miednicy, ślepota, zapalenie płuc i prawdopodobnie miażdżyca1-4. Zdolność chlamydii do interakcji z komórką gospodarza z wnętrza wakuoli (zwanej inkluzją) jest krytycznym wyznacznikiem pomyślnej infekcji komórek i gospodarza. Inkluzja jest nowym patogennym kompartmentem, który umożliwia wzrost chlamydii i jest dynamicznie modyfikowany przez cały 2-3 dniowy cykl rozwojowy Chlamydia5. Obligatoryjny wewnątrzkomórkowy charakter chlamydii stawia przed społecznością naukową liczne wyzwania, w szczególności w zakresie bezpośredniego badania unikalnej biologii inkluzji. Główną przeszkodą była niemożność skutecznego uwidocznienia zarówno wewnątrzkomórkowej chlamydii, jak i jej włączenia za pomocą metod fluorescencyjnych do żywych komórek. Niedawne odkrycie w końcu ujawniło sposoby generowania GFP eksprymującego C. trachomatis6; Odkrycie to nie doprowadziło jednak jeszcze do konkretnego oznakowania włączenia. Opisano niektóre techniki znakowania bakterii i inkluzji7,8, ale mają one wady, takie jak niespecyficzność, przemijalność i podatność na fotowybielanie. Kluczowe odkrycie dokonane przez naszą grupę ustanowiło nową strategię wyjaśniania inkluzji za pomocą GFP wyrażającego komórki gospodarza9. Strategia ta racjonalnie wykorzystuje wewnętrzną nieprzepuszczalność błony inkluzyjnej dla cząsteczek większych niż 520 Da10. Kiedy komórki są modyfikowane tak, aby stabilnie wyrażały określone cytozolowe białko fluorescencyjne (np. GFP lub mCherry), inkluzje Chlamydii są widoczne z niezwykłą wyrazistością dzięki całkowitemu wykluczeniu fluorescencji. Ta strategia odwrotnego obrazowania umożliwia natychmiastową wizualizację inkluzji dla wszystkich gatunków Chlamydia i może być łatwo dostosowana do większości komórek gospodarza będących przedmiotem zainteresowania. Aby zademonstrować jej użyteczność, metoda ta została wykorzystana wcześniej do ujawnienia i zdefiniowania komórkowych ścieżek wyjścia dla Chlamydia spp9.

Tutaj pokazujemy dalej, jak ta metoda jest wykonywana i może być wykorzystana do uzyskania kluczowych danych ilościowych na temat dynamiki wzrostu integracji. Co więcej, może skutecznie zastąpić kosztowne metody liczenia oparte na przeciwciałach i może być stosowany w połączeniu z innymi znacznikami fluorescencyjnymi, takimi jak Chlamydia11 wykazująca ekspresję mKate2. Ta potężna kombinacja narzędzi umożliwia badanie właściwości fizycznych błony inkluzyjnej chlamydii wewnątrz żywych komórek gospodarza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie fluorescencyjnych linii komórkowych gospodarza

  1. Dzień 1. Umieść komórki 293T (lub inną retrowirusową linię pakującą) na płytkach 6-dołkowych w 2 x 106 komórek / dołek, aby następnego dnia były zlewające się ~ 75%. W razie potrzeby należy wykonać zduplikowane studzienki dla każdego retrowirusa, który ma być użyty.
  2. Dzień 2. Odessać komórki i dodać 2 ml świeżej pożywki wzrostowej (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamina). Komórki transfekcyjne z 5–8 μg każda z wektorem retrowirusowym (zawierającym GFP) i wektorem opakowania (np. pVSVg) przy użyciu Lipofectamine 2000 lub podobnego odczynnika i zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Inkubować komórki z DNA przez 4–6 godzin w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C, a następnie zastąpić pożywkę pożywką o pojemności 1 ml.
  4. Inkubować komórki przez 48 godzin w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C.
  5. Dzień 3. Płytki docelowe komórek (np. HeLa) na płytkach 6-dołkowych o przybliżonej gęstości 105 komórek / dołek, aby następnego dnia były ~ 50% zlewane. Sprawdź dodatnią transfekcję w komórkach 293T, monitorując fluorescencję GFP pod odwróconym mikroskopem.
  6. Dzień 4. Zebrać supernatanty zawierające retrowirusy z komórek 293T za pomocą pipety i przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy z octanu celulozy 0,45 μm.
  7. Usunąć pożywkę z komórek HeLa i dodać 0,5 ml pożywki wzrostowej zawierającej 16 μg/ml polibrenu. Dodać ~0,5 ml przefiltrowanego retrowirusa do komórek kroplami i inkubować komórki w inkubatorze CO 2 o temperaturze 37 °Cprzez 24 godziny. Przechowywać pozostałego retrowirusa (tj. z duplikatu studzienki) w temperaturze 4 °C.
  8. Dzień 5. Jeśli zduplikowane studzienki zostały wykonane w celu wygenerowania dodatkowego retrowirusa, powtórz krok 1.7, aby seryjnie zainfekować pozostałymi cząstkami retrowirusa.
  9. Dzień 6. Pasaż transfekował komórki HeLa w stosunku 1:1 do 10 cm naczynia zawierającego antybiotyk selekcyjny (np. 500 μg/ml neomycyny).
  10. Odczekaj wystarczająco dużo czasu, aż transdukowane komórki odrosną w obecności antybiotyku selekcyjnego, po czym komórki mogą być rozmnażane za pomocą standardowych technik z niższym stężeniem antybiotyku selekcyjnego (np. 200 μg/ml neomycyny).
    Uwaga: W razie potrzeby komórki mogą być również wybierane klonalnie w celu uzyskania idealnej jasności w tym czasie.

2. Generacja Chlamydia trachomatis wykazująca ekspresję GFP

  1. Przygotować 2x bufor CaCl2 (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM CaCl2) i bufor 4SP (0,4 M sacharozy, 16 mM Na2HPO4).
  2. Dzień 1. Zamrożony bulion C. trachomatis rozmrozić na lodzie i natychmiast rozcieńczyć 10 μl bakterii w 50 μl buforu 2x CaCl2. Dodać 3 μg plazmidowego DNA (np. pASK-GFP-mKate2-L2), dobrze wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 25 °C.
  3. Na tym etapie należy przygotować komórki gospodarza, trypsynizując kolbę T-75 z komórkami McCoya do probówki wirówkowej. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 50 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości 1x buforu CaCl2, aby uzyskać końcowe stężenie 4 x 10 7 komórek/ml.
  4. Po 30-minutowej inkubacji (od kroku 2.2) dodać 100 μl przygotowanych komórek McCoya do probówki z mieszaniną transformacyjną (całkowita objętość 200 μl) i inkubować przez dodatkowe 20 minut w temperaturze 25 °C. Dodać 100 μl tej mieszaniny przekształconych komórek do pojedynczego dołka z płytki 6-dołkowej i nałożyć 2 ml pożywki wzrostowej. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 2 dni.
  5. Dzień 3. Lizuj komórki McCoya zakażone C. trachomatis poprzez zastąpienie pożywki 1 ml dH2O i zeskrobanie komórek z wygiętą końcówką pipety o pojemności 1000 μl. Dodać 1 ml buforu 4SP i przepuścić zawiesinę przez igłę 27,5 G ~ 5 razy w celu skutecznej lizy komórek i uwolnienia C. trachomatis.
  6. Przenieść 2 ml lizatu komórkowego zawierającego C. trachomatis do kolby T-75 zawierającej zlewającą się monowarstwę świeżo posianych komórek McCoya; dodać 8 ml DMEM (bez FBS) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 25 °C, aby C. trachomatis mógł przylegać do komórek.
  7. Odessać komórki i dodać świeżą pożywkę wzrostową uzupełnioną 10 j./ml penicyliny G i 1 μg/ml cykloheksymidu. Inkubować kolbę przez 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °CCO 2 .
  8. Dzień 4. Sprawdź za pomocą mikroskopii świetlnej, czy komórki są zakażone, a inkluzje zawierają nieprawidłową chlamydię. Zidentyfikuj inkluzje jako jasne wakuole pod standardowym mikroskopem świetlnym, a nieprawidłowe ciała Chlamydii jako obiekty przypominające pierścienie w inkluzjach o średnicy większej niż 2 μm.
  9. Dzień 5. Poddać hodowli lizę, zastępując pożywkę 2 mldH 2O i zeskrobać komórki do zawiesiny. Dodać 2 ml buforu 4SP i przepuścić zawiesinę przez igłę 27,5 G ~5 razy.
  10. Użyj 2 ml lizatu komórkowego, aby zainfekować świeżą monowarstwę komórek McCoya w pojedynczym dołku na płytce 6-dołkowej. Inkubować komórki z lizatem przez 2 godziny w temperaturze 25 °C, odsysać i dodawać świeżą pożywkę wzrostową zawierającą penicylinę G i cykloheksymid.
  11. Inkubować komórki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 3–5 dni, w zależności od ogólnego stanu zdrowia komórek.
  12. Powtórz kroki 2.9–2.10 jeden lub więcej razy, w razie potrzeby, pasując kultury do świeżych studzienek na płytce 6-dołkowej, aż pojawią się normalnie wyglądające inkluzje (pozbawione nieprawidłowych ciał). W tym czasie użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby sprawdzić, czy C. trachomatis wyraża mKate2 (czerwony).
  13. Zwiększenie skali zakażonych kultur w celu wytworzenia stad chlamydiów o wysokim mianie, na przykład poprzez zbieranie transformantów Chlamydia z zakażonych komórek McCoya lub HeLa hodowanych w kolbach T-150.

3. Zakażenie komórek chlamydią

  1. Umieść komórki GFP-HeLa w żądanym naczyniu hodowlanym, na przykład w naczyniach ze szklanym dnem lub szkiełkach komorowych do obrazowania w wysokiej rozdzielczości lub na płytkach 24-dołkowych do oznaczania IFU i badań przesiewowych wielodołkowych.
  2. Rozmrozić zamrożoną probówkę zawierającą C. trachomatis, C. muridarum lub C. pneumoniae na lodzie i rozcieńczyć w HBSS do pożądanej liczby infekcji (MOI), na przykład MOI = 1.
  3. Wykonaj infekcje statyczne lub wspomagane wirowaniem w oparciu o konkretny szczep Chlamydia, który zostanie użyty.
    1. W przypadku zakażeń seroliferem L2 lub C. muridarum C. trachomatis LGV należy przemyć komórki GFP-HeLa HBSS i inkubować z rozcieńczonymi bakteriami przez 2 godziny w temperaturze 25 °C. Odessać i przemyć komórki HBSS, a następnie inkubować komórki w pożywce wzrostowej w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C.
    2. W przypadku zakażeń C. trachomatis serowar D lub C. pneumoniae należy przemyć komórki GFP-HeLa HBSS i dodać rozcieńczone bakterie do komórek. Umieścić płytkę wielodołkową lub naczynie ze szklanym dnem (zabezpieczone taśmą w pokrywie płytki wielodołkowej) w uchwycie na płytki wielodołkowe w wahadłowym wirniku kubełkowym w wirówce stołowej.
    3. Odwirować komórki w temperaturze 900 x g w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę.
    4. Wyjąć naczynia hodowlane z wirówki i umieścić w inkubatorze CO 2 o temperaturze 37 °Cna 1 godzinę.
    5. Odessać komórki w komorze bezpieczeństwa biologicznego, dwukrotnie umyć komórki HBSS i dodać świeżą pożywkę wzrostową. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °CCO 2 .

4. Wizualizacja inkluzji chlamydii na żywo

  1. Usuń zakażone Chlamydią komórki GFP-HeLa z inkubatora CO2 i zastąp pożywkę RPMI bez czerwieni fenolowej + 5% FBS.
  2. Zamontuj komórki w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym (Nikon Eclipse Ti-E lub podobny) za pomocą obiektywu olejowego 20X lub wyższego.
  3. Korzystając z oprogramowania do obrazowania (Volocity 6 lub podobnego), skoncentruj się i zidentyfikuj komórki GFP-HeLa zakażone Chlamydią: zielone komórki zawierające duże czarne (inkluzje Chlamydia).
  4. Zaznacz lokalizacje xyz regionów zawierających komórki zakażone chlamydią za pomocą oprogramowania do obrazowania (Volocity 6 lub podobnego). Zrób to, ręcznie 'Dodawanie punktów' w trybie widoku stołu montażowego XY. W ten sposób współrzędne xyz są zapisywane dla każdej zaznaczonej lokalizacji.
  5. W oknie dialogowym Konfiguracja akwizycji skonfiguruj oprogramowanie tak, aby pobierało kanały zielone (GFP, cytozol HeLa) i czerwone (mKate2, C. trachomatis) oraz z szybkością nowych klatek na kanał co 5 minut.
  6. Uzyskaj sekwencję obrazów za pomocą protokołu akwizycji wprowadzonego powyżej, klikając przycisk "Przechwyć/Nagraj".

5. Kwantyfikacja parametrów wzrostu inkluzji w żywych komórkach

  1. W pożądanym czasie po zakażeniu (np. 24, 48 hpi) należy usunąć zakażone Chlamydią komórki GFP-HeLa z inkubatora i umieścić na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym. Uwaga: Obiektyw powietrzny 20X lub 40X z wysokim NA najlepiej nadaje się do płytek 24-dołkowych, a obiektyw olejowy 40X jest zalecany do szkiełek komorowych. Hoduj komórki na dowolnym podłożu do tego testu.
  2. Skoncentruj się na płaszczyznach środkowych komórek, gdzie inkluzje mają maksymalną średnicę i dają ostre krawędzie.
  3. Zdobądź obrazy dla wielu pól w każdym dołku (co najmniej 10 na odwiert); studzienki zazwyczaj reprezentują powtórzenia lub zmienne eksperymentalne.
  4. Policz liczbę inkluzji ręcznie, na oko (inkluzje to czarne przedziały w komórkach GFP-HeLa) lub użyj algorytmów oprogramowania do obrazowania, aby automatycznie zidentyfikować i zliczyć inkluzje.
    1. Znajdź komórki GFP-HeLa według intensywności fluorescencji (polecenie "Znajdź obiekty") i dostosuj intensywność progu fluorescencji w oparciu o względne intensywności komórek.
    2. Filtruj wybrane obiekty, korzystając ze wskazówek dotyczących rozmiaru, aby były one większe niż 5 μm2. To jest "populacja 1".
    3. Zastosuj polecenie "Wypełnij otwory w obiektach", używając "populacji 1" jako danych wejściowych. Ten krok generuje "populację 2".
    4. Odejmij "populację 1" od "populacji 2", aby uzyskać dodatnio oznaczone inkluzje Chlamydii, oznaczone jako "populacja 3".
    5. Zastosuj filtr rozmiaru do "populacji 3" (polecenie "Filtruj populację"), na przykład utrzymując obiekty większe niż 25 μm2 dla inkluzji w zainfekowanych komórkach przez 24 godziny lub dłużej. W przypadku wczesnych czasów infekcji, takich jak przed 18 godziną, należy ustawić filtr o rozmiarze tak, aby utrzymywał obiekty większe niż 4 μm2, ponieważ wtrącenia te są znacznie mniejsze. Filtrowanie rozmiaru powoduje populację obiektów oznaczonych jako "inkluzje".
    6. Obliczanie danych ilościowych na podstawie obrazów, na przykład liczby inkluzji, wielkości inkluzji i obwodu inkluzji, za pomocą oprogramowania do obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki ssaków wyrażające cytozolowe białka fluorescencyjne (np. GFP) mogą być zaprojektowane tak, aby umożliwić oświetlenie inkluzji Chlamydia w żywych, zakażonych kulturach komórkowych. Po zakażeniu Chlamydią inkluzje są łatwo widoczne jako czarne plamy w komórkach gospodarza (ryc. 1). Klarowność inkluzji pozbawionych fluorescencji może być wykorzystana do automatycznej identyfikacji inkluzji w wielu polach widzenia i/lub zabiegach (ryc. 1). Po wygenerowaniu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy eksperymentalną strategię generowania fluorescencyjnych komórek gospodarza do wizualizacji i analizy inkluzji Chlamydii w czasie rzeczywistym. To podejście do wizualizacji wakuoli daje potężną zdolność do oświetlania, śledzenia i ilościowego pomiaru dynamicznych właściwości inkluzji chlamydii w populacjach komórek lub w pojedynczych komórkach w czasie. Inkluzje chlamydii w komórkach znakowanych białkiem fluorescencyjnym są uderzająco dobrze zdefiniowane, dzięki czemu można je łat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Ianowi Clarke'owi i P. Scottowi Hefty'emu za plazmidy pGFP-SW2 i pASK-GFP-mKate2-L2. Dziękujemy Paulowi Millerowi za pomoc techniczną i Richardowi Stephensowi za inne zasoby. Praca ta została sfinansowana z grantu NIH AI095603 (KH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lipofectamine 2000Invitrogen11668
Opti-MemInvitrogen31985
PolybreneSigmaH9268
0,45 µ m filtryFisher09-719D
G418Invitrogen10131
HBSSInvitrogen14025
DMEMInvitrogen11995
RPMI 1640Invitrogen11875
RPMI 1640 w/o czerwień fenolowaCellgro17-105-CV
Penicylina GSigma13752
CycloheximideSigmaC7698
Naczynia ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-14-C
Szkiełka komorowe, Lab-Tek IINunc154526, 154534

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).
  2. Schachter, J. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).
  3. Campbell, L. A., Kuo, C. C. Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).
  4. Darville, T., Hiltke, T. J. Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis. The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).
  5. Hackstadt, T. Cell biology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).
  6. Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector). PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258(2011).
  7. Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
  8. Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells. Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).
  9. Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).
  10. Heinzen, R. A., Hackstadt, T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).
  11. Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).
  12. Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One. 7 (10), e46949(2012).
  13. Agaisse, H., Derré, I. A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One. 8 (2), e57090(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Chlamydia InclusionFluorescent Host CellsLive Fluorescence MicroscopyInclusion Growth DynamicsReverse Imaging StrategyGFP Hela CellsInclusion QuantitationChlamydia SpeciesInclusion MembraneMicroscope Analysis Software

Powiązane artykuły