Humanizowany model myszy do badania infekcji bakteryjnych ukierunkowanych na mikrokrążenie

Podsumowanie

Neisseria meningitidis to specyficzny dla człowieka patogen, który infekuje naczynia krwionośne. W tym protokole ludzkie mikronaczynia są wprowadzane do myszy poprzez przeszczepienie ludzkiej skóry myszom z obniżoną odpornością. Bakterie w dużym stopniu przylegają do ludzkich naczyń, prowadząc do uszkodzenia naczyń krwionośnych i rozwoju wysypki plamistej zwykle obserwowanej u ludzi.

Streszczenie

Neisseria meningitidis powoduje ciężką, często śmiertelną sepsę, gdy dostaje się do ludzkiego krwiobiegu. Zakażenie prowadzi do rozległego uszkodzenia naczyń krwionośnych, co prowadzi do nieszczelności naczyniowej, rozwoju wysypki purpurowej i ostatecznie martwicy tkanek. Badanie patogenezy tej infekcji było wcześniej ograniczone przez ludzką specyfikę bakterii, co utrudniało modelowanie in vivo. W tym protokole opisujemy humanizowany model tej infekcji, w którym ludzka skóra, zawierająca mikronaczynia skórne, jest szczepiona myszom z obniżoną odpornością. Naczynia te łączą się z krążeniem myszy, zachowując przy tym swoje ludzkie cechy. Po wprowadzeniu do tego modelu N. meningitidis przylega wyłącznie do ludzkich naczyń, powodując rozległe uszkodzenia naczyń krwionośnych, stan zapalny, aw niektórych przypadkach rozwój wysypki plamistej. Protokół ten opisuje etapy szczepienia, infekcji i oceny tego modelu w kontekście zakażenia N. meningitidis. Technika ta może być stosowana do wielu specyficznych dla człowieka patogenów, które infekują krwioobieg.

Wprowadzenie

Sepsa meningokokowa jest często śmiertelną infekcją przenoszoną przez krew, wywoływaną przez patogen bakteryjny Neisseria meningitidis. U pacjentów z posocznicą meningokokową często występuje wybroczynowa lub purpurowa wysypka na skórze, która wcześniej była związana ze zniszczeniem naczyń krwionośnych spowodowanym przez krążące bakterie i produkty bakteryjne¹. Biopsje skóry od pacjentów klinicznych wykazują bakterie związane z mikronaczyniami, często wypełniającymi naczynia². Oprócz bakterii rozległa zakrzepica, krzepnięcie, przekrwienie i nieszczelność naczyniowa obserwuje się w obszarach purpurowych^3-5. To uszkodzenie naczyń może prowadzić do rozległej martwicy skóry i otaczających tkanek, co prowadzi do oczyszczenia, a nawet amputacji u osób, które przeżyły meningokoki. Zrozumienie, w jaki sposób infekcja powoduje to uszkodzenie naczyń krwionośnych, jest ważne dla optymalizacji strategii zapobiegania i leczenia. Większość badań nad posocznicą meningokokową przeprowadzono in vitro na ludzkich liniach komórkowych ze względu na ludzką specyficzność N. meningitidis. Wiele aspektów infekcji badano in vitro, w tym adhezję bakteryjną, odpowiedź komórek gospodarza, a także odpowiedź cytokin^6-9. Pilusy typu IV (Tfp) są uważane za główne organelle adhezyjne N. meningitidis zarówno na komórkach nabłonka, jak i śródbłonka¹⁰. Wykazano również, że przyleganie N. meningitidis do komórek gospodarza jest zależne od naprężeń ścinających i dlatego uważa się, że jest związane z szybkością przepływu krwi w mikrokrążeniu¹¹. Sugeruje to, że dynamiczne stresy, z którymi bakterie spotykają się in vivo, mają kluczowe znaczenie dla patogenezy. Modelowanie mikrośrodowiska małych naczyń krwionośnych in vitro jest jednak bardzo trudne.

Receptor adhezyjny dla Neisseria Tfp jest nadal nieznany, dlatego w tej chwili nie można przewidzieć strategii domina w celu uzyskania adhezji bakteryjnej w modelu zwierzęcym. Sugerowano, że CD46 jest receptorem Tfp, a transgeniczne zwierzęta zostały wyprodukowane, aby działały jako modele mysie. Jednak zakażenie u tych zwierząt nie prowadzi do rozległego zakażenia ani do rozwoju wysypki^12,13. Inne modele zwierzęce, które zostały opisane pod kątem aspektu bakteriemicznego zakażenia Neisseria, uwzględniają preferencję bakterii dla ludzkiej transferyny jako źródła żelaza^14,15. Suplementacja ludzkiej transferyny lub ekspresja jej z transgenu powoduje zwiększenie obciążenia bakteryjnego w krwiobiegu przez dłuższy czas, ale model ten nie wykazuje adhezji bakteryjnej ani rozwoju wysypki^16,17.

W tym protokole opisujemy humanizowany model myszy, w którym ludzka skóra, w tym mikrokrążenie skórne, jest przeszczepiana myszom z obniżoną odpornością^18,19. W ten sposób powstają funkcjonalne naczynia ludzkie, ukrwione z krążeniem myszy. W połączeniu z suplementacją transferyny u ludzi, model ten uwzględnia co najmniej dwa specyficzne dla człowieka aspekty N. meningitidis, tj. ludzki śródbłonek i ludzką transferynę, w środowisku in vivo. N. meningitidis wprowadzony dożylnie do tego modelu przylega specyficznie do ludzkiego śródbłonka, powodując patologię podobną do tej, którą zgłasza się u pacjentów klinicznych, w tym uszkodzenie naczyń krwionośnych i rozwój wysypki plamistej¹⁸.

Protokół

1. Ryzyka i uprawnienia

1. Lokalne komisje etyczne muszą zatwierdzić wszystkie protokoły dotyczące zwierząt. Protokół ten został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi ustanowionymi przez francuskie i europejskie przepisy dotyczące opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (Décrets 87-848, 2001-464, 2001-486 i 2001-131 oraz Dyrektywa Europejska 2010/63/UE) i zatwierdzony przez lokalną komisję etyczną Comité d'Ethique en matière d'Expérimentation Animale, Universite Paris Descartes, Paryż, Francja. Nr katalogowy: CEEA34. GD.002.11.
2. W przypadku ludzkiej skóry uzyskano pisemną świadomą zgodę pacjenta, a wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z francuskimi wytycznymi krajowymi i zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną, Comité d'Evaluation Ethique de l'INSERM IRB 00003888 FWA 00005881, Paryż, Francja Opinia: 11-048.
3. N. meningitidis jest potencjalnie szkodliwym patogenem dla ludzi i należy podjąć wszelkie niezbędne środki ostrożności podczas obchodzenia się z organizmem. Te środki ostrożności obejmują szczepienia i pracę w warunkach 2 poziomu bezpieczeństwa biologicznego.

2. Przeszczep skóry

1. Zbierz ludzką skórę jak najbliżej czasu przeszczepu. Większość skóry w tej pracy pochodzi z operacji chirurgii plastycznej obejmujących okolicę brzucha. Inne źródła, takie jak piersi, nogi, a nawet twarz, były z powodzeniem stosowane.
2. Przygotuj próbkę ludzkiej skóry, czyszcząc powierzchnię skóry 70% EtOH i kładąc ją płasko na dobrze oczyszczonej powierzchni, najlepiej pod kapturem przepływowym.
3. Pokrój plastry 200-400 μm od górnej części skóry za pomocą dermatomu o ustalonej grubości.
4. Sprawdź plastry skóry pod kątem integralności i pokrój je w kwadraty o wymiarach 2 cm x 2 cm, a następnie umieść w PBS (bez kationów dwuwartościowych) w przypadku szczepienia natychmiast lub w temperaturze 4 °C w DMEM z 10% surowicą do krótkotrwałego przechowywania (3-12 godzin).
5. Znieczulenie myszy w wieku 6-8 tygodni SCID.bg(około 20 g) w wieku 6-8 tygodni za pomocą ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) wstrzykniętych i.p.
6. Po znieczuleniu myszy sprawdź reakcję na ból, wykonując szczypanie palca u nogi, co jest standardową metodą ustalania odruchu bólowego. Nałóż żel na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i ogol lewą stronę zwierzęcia za ramieniem, gdzie zostanie umieszczony przeszczep. Utrzymuj mysz w cieple na poduszce grzewczej przez cały czas trwania zabiegu.
7. Po przygotowaniu myszy do zabiegu, oczyść ogolony obszar 70% EtOH.
8. Zastosuj miejscowo znieczulenie miejscowe na miejsce przeszczepu (tronotan) i przygotuj miejsce przeszczepu, ostrożnie usuwając powierzchowną warstwę skóry myszy za pomocą zakrzywionych nożyczek. Uważaj, aby nie zakłócić leżącego poniżej układu naczyniowego.
9. Usuń skórę z obszaru nieco mniejszego niż obszar wycinka ludzkiej skóry.
10. Usuń plasterek skóry z PBS (lub DMEM) i umieść na łóżku przeszczepu, upewniając się, że strona naskórka jest skierowana do góry. Kroki 2.8-2.10 należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, upewniając się, że złoże przeszczepu nie wysycha.
11. Wyrównaj jeden róg lub krawędź i przymocuj za pomocą kleju tkankowego. Ostrożnie dopasuj resztę plastra skóry do podłoża przeszczepu, umieszczając niewielkie ilości kleju tkankowego wokół krawędzi. Zawsze przycinaj ludzką skórę do odpowiedniego rozmiaru, zamiast powiększać podłoże przeszczepu.
12. Nie naciągaj skóry zbyt mocno na łoże przeszczepu, ponieważ skóra myszy jest bardzo elastyczna.
13. Upewnij się, że przeszczep jest przymocowany za pomocą kleju tkankowego w każdym rogu.
14. Oczyść obszar roztworem jodu.
15. Nałóż plaster z obszarem poduszki na przeszczep. Upewnij się, że plaster jest mocny, ale nie ciasny i że nie ma to wpływu na oddychanie zwierzęcia.
16. Przymocuj plaster za pomocą taśmy opatrunkowej.
17. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie na ciepłej powierzchni.
18. Po przebudzeniu włóż zwierzę z powrotem do klatki. Zwierzęta trzymane są po 2-3 osobniki w klatce.
19. Podczas rekonwalescencji regularnie sprawdzaj myszy pod kątem oznak bólu lub niepokoju. 10-14 dni po szczepieniu usuń plaster, uważając, aby nie zakłócić przeszczepu. Z naszego doświadczenia wynika, że ból pooperacyjny jest minimalny. Niemniej jednak zwierzęta powinny być monitorowane codziennie, w szczególności w ciągu kilku dni po operacji. Kryteria bólu lub dystresu są następujące.
    • Utrata masy ciała powyżej 10%
    • Wygląd fizyczny, futro, pozycja garbata, oczy
    • Przyspieszony oddech lub tętno
    • Zmniejszone lub nietypowe ruchy.
    • Wzrost temperatury ciała
    • W przypadku wykrycia objawów bólu paracetamol podaje się doustnie (300 mg/kg mc., co 4 godziny). Humanitarne punkty końcowe są ściśle przestrzegane, jeśli ból utrzymuje się.
20. Jeśli przeszczep wygląda na suchy, nakładaj olejek dla niemowląt co 2-3 dni, aby zachować elastyczność skóry.
21. Przeszczep jest gotowy do eksperymentów 21 dni po przeszczepie.

3. Infekcja

1. Dzień przed zakażeniem przygotuj szczep bakteryjny, rozpylając na płytkach agarowych GCB odpowiednie antybiotyki. Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
2. Przygotowanie bakterii
   1. Ponownie wprowadzić bakterie do 5 ml pożywki SFM ze śródbłonka ludzkiego z 10% surowicą do OD₆₀₀ 0,05.
   2. Inkubować, wytrząsając przez 2 godziny w inkubatorze (37 °C przy 5% CO_{2 )} pod luźną pokrywą, aż do uzyskania gęstości bakteryjnej około₆₀₀ 0,1.
   3. Odwirować bakterie przez 3 minuty 15 000 obr./min.
   4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w PBS, a następnie ponownie odwirować.
   5. Powtórzyć etap prania (2.2.4-2.2.5) dwukrotnie.
   6. Ponownie zawiesić osad bakteryjny w PBS.
   7. Zmierz OD₆₀₀.
   8. Wykonaj hodowlę OD₆₀₀ 0,1 (10⁸ CFU/ml) lub OD₆₀₀ 1,0 (10⁹ CFU/ml). Z tego znanego stężenia rozcieńczyć do 10-7 jtk/ml. Staraj się przygotować bakterie jak najbliżej czasu wstrzyknięcia.
3. Myszy
   1. Zważ myszy.
   2. Znieczulić myszy ketaminą (100 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg) wstrzykniętymi i.p.
   3. Po zaśnięciu sprawdź, czy reakcja bólowa jest nieobecna przez uszczypnięcie palca u nogi, utrzymuj myszy w cieple za pomocą poduszki rozgrzewającej i nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu.
   4. Każdej myszy należy podać 8 mg ludzkiej transferyny, zawieszonej w roztworze soli fizjologicznej lub PBS, we wstrzykniętym i.p.
   5. Weź niewielką kroplę krwi z ogona i rozprowadź na płytce agarowej, aby sprawdzić, czy krew jest sterylna przed infekcją.
   6. Wstrzyknąć dożylnie 100 μl 10⁷ jtk/ml kultury bakteryjnej (łącznie 10⁶ jtk) przez żyłę zaoczodołową lub ogonową. Pomiary CFU wykonane 5 minut po wstrzyknięciu są spójne niezależnie od miejsca wstrzyknięcia.
   7. Po kilku minutach odetnij koniec ogona i rozprowadź próbkę krwi na płytkach agarowych z odpowiednimi antybiotykami z jednym 10-krotnym rozcieńczeniem, aby ustalić CFU krwi natychmiast po zakażeniu.
   8. Uszczelnij ogon klejem tkankowym.
   9. Po wstrzyknięciu rozcieńczyć inokulum bakteryjne i rozprowadzić na płytkach agarowych odpowiednimi antybiotykami w celu ustalenia CFU.
   10. Pozwól myszom dojść do siebie na poduszce grzewczej, aż będą gotowe do ruchu
   11. Po 6 godzinach od zakażenia należy pobrać niewielką ilość krwi z ogona, rozcieńczyć i ustalić płytkę w celu ustalenia CFU po 6 godzinach.
   12. Inkubować wszystkie płytki agarowe w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 przez} noc.

4. Poświęcenie

1. W wybranym momencie zakażenia znieczulić myszy ketaminą (100 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg) wstrzykniętymi i.p.
2. Po zaśnięciu utrzymuj mysz w cieple za pomocą poduszki grzewczej.
3. Kiedy odruch bólowy minie (szczypanie palca), odetnij koniec ogona i pobraj krew.
4. Rozprowadzić krew na płytkach agarowych z odpowiednimi antybiotykami; 5 μl bezpośrednio i 10 μl rozcieńczenia 1:10 w celu ustalenia CFU.
5. Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.
6. Po złożeniu myszy w ofierze zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi i etycznymi, potwierdź śmierć z powodu braku bicia serca. Wykonaj nacięcie w linii środkowej, przetnij klatkę piersiową i wykonaj nacięcie w sercu.
7. Zbierz jak najwięcej krwi z jamy serca/klatki piersiowej i umieść w sterylnej probówce.
8. Wyjąć narządy (np. wątrobę, śledzionę, mózg) na sterylną płytkę.
9. Usunąć przeszczep skóry i fragment skóry myszy na sterylną płytkę.
10. Wyrzuć korpus myszy.
11. Po pozostawieniu pobranej krwi do krzepnięcia przez 15 minut, odwirować ją przez 15 minut z prędkością 3 000 obr./min.
12. Usunąć osocze z krwi i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy, na przykład w celu wykrycia cytokin metodą ELISA lub FACS.

5. Liczba jednostek CFU narządów

1. Zważyć probówki homogenizujące zawierające 500 μl PBS każda przed pobraniem próbek do biopsji.
2. Pobrać próbki biopsji o średnicy 4 mm z każdej tkanki za pomocą sterylnego stempla do biopsji.
3. Umieścić biopsje w wstępnie zważonych probówkach homogenizujących zawierających 500 μl PBS. Homogenizuj próbki skóry za pomocą kulek o średnicy 2 mm, używaj mniejszych kulek do innych narządów.
4. Pozostałe tkanki umieścić w 4% paraformaldehydzie (PFA) i przechowywać w temperaturze 4 °C do mikroskopii (patrz poniżej).
5. Zważyć probówki homogenizujące zawierające biopsje w celu ustalenia masy biopsji (do późniejszego obliczenia tkanki CFU/mg).
6. Homogenizować próbki.
   1. Homogenizuj wątrobę, śledzionę i mózg z prędkością 6000 obr./min przez 30 sekund.
   2. Homogenizować próbki skóry z prędkością 6 000 obr./min przez 30 sekund i powtórzyć w razie potrzeby.
7. Rozcieńczyć z każdej probówki homogenizującej na płytkach agarowych i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 w} celu ustalenia liczby CFU w organach.

6. Histologia/Immunohistochemia

1. Utrwalenie
   1. Utrwalić tkanki w 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C. Etap fiksacji może być dłuższy; w przypadku przechowywania przez dłuższy czas należy umieścić tkanki w 0,25% PFA.
   2. Opłucz tkanki w PBS, a następnie umieść je w 20% roztworze sacharozy i wróć do temperatury 4 °C na noc lub do momentu, gdy tkanki zanurzą się w roztworze.
   3. Umyj chusteczki w PBS, przytnij na wymiar i umieść w roztworze OCT (w formie do tkanek lub przyklejone do płyty bazowej).
   4. Szybko zamroź tkanki na szalce Petriego unoszącej się w ciekłym azocie.
   5. Po zamrożeniu chusteczki należy umieścić na suchym lodzie przed przeniesieniem do temperatury -80 °C w celu przechowywania.
2. Krojenie
   1. Usunąć tkanki z temperatury -80 °C i pozostawić do zrównoważenia do -20 °C w kriostacie.
   2. Pokrój tkanki o grubości około 10-15 μm i umieść na powlekanych szkiełkach mikroskopowych.
   3. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
3. Barwienia
   1. Pozwól, aby szkiełka osiągnęły temperaturę pokojową.
   2. Narysuj wokół plasterka na szkiełku za pomocą hydrofobowego pisaka. Odczekaj 5-10 min.
   3. Uwodnij/umyj plasterek w PBS przez 5 minut, powtórz dwa razy.
   4. Przepuszczalny plaster w 0,1% Trytonie w PBS przez 10 min.
   5. Prać w PBS 2-3x przez 5 min.
   6. Zablokuj w PBS 0,1% Triton 1% BSA na 10-60 minut, w zależności od przeciwciała lub barwnika, który ma być użyty.
   7. Usunąć bufor blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone zgodnie z wymaganiami w buforze blokowym. Inkubuj przez określony czas. (Często 1 godzina w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C).
   8. Prać w PBS 2-3x przez 5 min.
   9. Zastosować przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone odpowiednio w buforze koźlaków; DAPI jest zwykle uwzględniany w tym kroku. Inkubować przez określony czas, często 1-2 godziny w temperaturze pokojowej, w ciemności.
   10. Prać w PBS 2-3x przez 5 min.
   11. Zamontuj w bladzeniu zabezpieczające nośniki montażowe za pomocą szkła nakrywkowego i uszczelnij lakierem do paznokci.
   12. Szkiełka barwione obrazować natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4 °C.
   13. Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej lub fluorescencyjnej z filtrami/laserami odpowiednimi do zastosowanych fluoroforów.
4. histologia
   1. Zezwolić na użycie szkiełek do badania histologicznego, aby osiągnąć temperaturę pokojową.
   2. Szkiełka barwienia przy użyciu standardowego protokołu barwienia hematoksyliny / eozyny.
      1. Umieść szkiełka w stojaku na slajdy.
      2. Stojak transferowy z prowadnicami między roztworami w następującej kolejności:
      3. 2 sekundy pod bieżącą wodą z kranu.
      4. 3 minuty w przefiltrowanym roztworze hematoksyliny.
      5. 10 sekund pod bieżącą wodą.
      6. 10 sekund w wodzie destylowanej.
      7. 10 sekund do etanolu 100%.
      8. 2 sekundy do przefiltrowanej eozyny.
      9. 10 sekund pod bieżącą wodą.
      10. 10 sekund do etanolu 100%
      11. 2 min do ksylenu x 3 (kąpiel I, II, III).
      12. Przenieś natychmiast i dodaj kilka kropel kleju utrwalającego na każde szkiełka, umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu, usuń pęcherzyki powietrza, pozostaw do wyschnięcia na kilka godzin.
      13. Obraz jest przesuwany pod standardowym mikroskopem światła białego.

Wyniki

Liczba CFU

Szczep N. meningitidis użyty w tych reprezentatywnych wynikach to N. meningitidis 8013 klon 12, kliniczny izolat serogrupy C, wyrażający pilinę SB klasy I, Opa^-, Opc^-, PilC1⁺/PilC2^{+ 20}. Szczep został zmodyfikowany do ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) z insercji chromosomu¹⁸. Liczbę jednostek tworzących kolonie bakteryjne ustala się poprzez zliczenie liczby kolonii na płytkach agarowych i obliczenie jtk/ml krwi lub jtk/mg tkanki ze znanych objętości platerowanych. Morfologia krwi wykazała, że 5 minut po wstrzyknięciu dożylnym 10^{6 bakterii} CFU we krwi krążyło średnio 1,5 x 10⁵ CFU/ml (ryc. 1A). Po 6 godzinach liczenie wynosiło średnio 4,8 x 10⁴ CFU/ml. Po 24 godzinach średnie liczby wynosiły 2,4 x 10⁴ CFU / ml, ale w tej grupie 10 myszy 5 nie miało wykrywalnych krążących bakterii, podczas gdy pozostałe 5 miało stosunkowo wysoką liczbę (Figura 1A). Liczba CFU pobrana z próbek skóry pokazuje, że większość myszy ma znaczne liczby w ludzkiej skórze, średnio 2,1 x 10⁴ CFU / mg tkanki po 6 godzinach i 4,4 x 10² CFU / mg tkanki po 24 godzinach (Figura 1B). Próbki skóry myszy po przeciwnej stronie nie wykazały liczby bakterii po 24 godzinach i tylko bardzo niską liczbę po 6 godzinach, co świadczy o silnej preferencji N. meningitidis do ludzkich naczyń w przeszczepionej skórze (Figura 1B). Ogólnie rzecz biorąc, liczba bakterii była bardzo niska lub niewykrywalna w innych pobranych narządach, chociaż 2 zwierzęta wykazały liczby, które można przypisać zanieczyszczeniu krwią, ponieważ korelowały one z wysoką liczbą krążących bakterii (ryc. 1C). Model może być również wykorzystany do określenia roli czynników wirulencji in vivo, na przykład pilusów typu IV. Do modelu wprowadzono szczepy bakteryjne ze zdefiniowanymi mutacjami w genie pilD²¹, w wyniku czego szczep pozbawiony jest Tfp, a także gen pilC1 ⁸, pozbawiony proponowanej "adhezyny" Tfp. Mutacje te spowodowały brak adhezji bakteryjnej w przeszczepie ludzkiej skóry, co potwierdza kluczową rolę, jaką Tfp odgrywa w adhezji in vivo (ryc. 1D).

Immunohistochemia/Histologia

W tych eksperymentach użyliśmy szczepów N. meningitidis, które wyrażają białko zielonej fluorescencji (GFP), aby umożliwić wykrywanie fluorescencji bez potrzeby wtórnego barwienia. Naczynia ludzkie barwiono za pomocą markera śródbłonka ludzkiego, CD31 (PECAM-1) lub lektyny aglutyniny Ulex europaeus (UEA)^18,22. UEA sprzężono z rodaminą, umożliwiając jednoetapowe barwienie (ryc. 2A-C). Jądra komórkowe można barwić za pomocą DAPI, aby pomóc w identyfikacji struktur tkankowych (ryc. 2A-B). Badanie histologiczne przeprowadzono przy użyciu standardowego barwienia hematoksyliną/eozyną. Granica naskórkowo-skórna skóry była wyraźnie rozpoznawalna. Stan zapalny, zakrzepica i przeciek naczyniowy koncentrowały się w naczyniach w pobliżu tej granicy 24 godziny po zakażeniu (ryc. 2D). Zakrzepica była widoczna w kilku małych naczyniach skórnych, często towarzyszyło jej przekrwienie i stan zapalny. Można było zaobserwować wyciek czerwonych krwinek do tkanek, co wskazuje na rozległy poziom uszkodzenia naczyń. Histopatologia przeszczepionej skóry u niezakażonych myszy wydawała się normalna bez zauważalnego stanu zapalnego¹⁸. W około 30% zakażeń adhezja bakteryjna w skórze prowadzi do rozwoju makroskopowo wykrywalnej plamicy (ryc. 2E i 2F).

Rysunek 1. Liczy się CFU. (A) Liczba bakteryjnych CFU na ml krwi po 5 minutach, 6 godzinach i 24 godzinach po zakażeniu. (B) Liczba bakteryjnych CFU z próbek skóry porównujących skórę ludzką (HS) i skórę myszy (MS) zarówno po 6 godzinach, jak i 24 godzinach po zakażeniu. (C) Liczba bakteryjnych CFU z innych narządów pobrana 24 godziny po zakażeniu. (D) Porównanie liczby bakteryjnych CFU z próbek skóry ludzkiej i mysiej pobranych 24 godziny po zakażeniu od myszy zakażonych dzikim typem N. meningitidis 2C43 (WT), szczepu z mutacją w genie pilD (pilD) lub szczepu z mutacją w genie pilC1 (pilC1). Wszystkie wykresy są wyświetlane jako surowe dane z medianą. Rysunek jest zmodyfikowany na podstawie Melicanet al.¹⁸ Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 2. Mikroskopia. (A) Projekcja stosu konfokalnego ukazująca ludzkie mikronaczynie zabarwione lektyną UEA (czerwoną) w pobliżu granicy skóry (d) naskórka (e). Naczynie jest zakażone N. meningitidis (zielony) 2 godziny po zakażeniu. (B) Wycinek optyczny i projekcja wycinka (C) pokazująca mikrokolonie N. meningitidis (zielone) zakażenie ludzkiego naczynia (UEA – czerwony) w przeszczepie skóry 2 godziny po zakażeniu. (D) Barwienie hematoksyliną/eozyną przeszczepu skóry ludzkiej zakażonego przez 24 godziny N. meningitidis. Wyraźnie widoczna jest granica naskórka (e), skóry (d), a w skórze właściwej widoczna jest rozległa zakrzepica i przekrwienie mikronaczyń (strzałki). Można również zidentyfikować stan zapalny i pewien wyciek naczyniowy (grot strzały). (E) Przeszczep ludzkiej skóry przed zakażeniem. (F) Ten sam przeszczep skóry, co (E) 24 godziny po zakażeniu N. meningitidis z zaznaczonymi obszarami purpurowymi (strzałki). Rysunki 2B, 2D, 2E i 2F zostały zmodyfikowane na podstawie Melican et al.¹⁸ Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Dyskusja

Modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie dla badań nad patogenezą bakterii. Niemożliwe jest pełne naśladowanie środowiska in vivo w hodowli komórkowej i staje się oczywiste, że na interakcję gospodarz-patogen wpływa wiele czynników dynamicznych. Swoistość dla człowieka niektórych klinicznie ważnych patogenów, takich jak N. meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes i Salmonella typhi , ograniczyła stosowanie modeli in vivo w przypadku tych zakażeń. Jednak, gdy zaczynamy rozumieć, jakie zakaźne etapy są zaangażowane w specyfikę, opracowywane są humanizowane modele. Opisany tutaj protokół jest tego demonstracją z wprowadzeniem ludzkich mikronaczyń do myszy, co pozwala na rozległe zakażenie in vivo N. meningitidis, powodujące uszkodzenie naczyń krwionośnych, a czasami rozwój wysypki purpurowej.

Korzystając z tego modelu, byliśmy w stanie określić, że właściwości adhezyjne Tfp są zaangażowane w kolonizację naczyń krwionośnych in vivo przy użyciu mutantów bakteryjnych i że uszkodzenie naczyń jest zmniejszone przy braku adhezji¹⁸. Wcześniej krążące produkty bakteryjne były zaangażowane w to uszkodzenie, ale nasze wyniki sugerują decydującą rolę w lokalnej adhezji i kolonizacji naczyń. Otwiera to nowe możliwości w zakresie opracowywania nowych celów terapeutycznych. Gdyby udało się farmaceutycznie zablokować adhezję bakterii chorobotwórczych, mogłoby to zapobiec rozwojowi zmian skórnych i doprowadzić do lepszych wyników dla osób, które przeżyły meningokoki, w zakresie martwicy tkanek, oczyszczenia i amputacji. Prace wykazały również złożoność infekcji oraz udział kaskady odpowiedzi immunologicznej i krzepnięcia. Zidentyfikowaliśmy sygnalizację cytokin ludzkich w surowicy zakażonych myszy pomimo stosunkowo niewielkiej ilości ludzkiego śródbłonka¹⁸. Wskazywało to na znaczącą odpowiedź cytokinową, wraz z infiltracją populacji komórek odpornościowych myszy w tym obszarze.

Modele zwierzęce oczywiście nigdy nie są w stanie w pełni odtworzyć ludzkiej choroby i wszystkie uzyskane z nich wyniki muszą być brane pod uwagę w tym kontekście. Na przykład w tym modelu krew i krążące komórki są pochodzenia mysiego i nie możemy wykluczyć, że mogą zachowywać się inaczej niż komórki ludzkie. Zaletą tego jednak, jak wykazano w naszej niedawnej publikacji¹⁸, jest zdolność do różnicowania sygnalizacji pochodzącej z ludzkiego śródbłonka od sygnalizacji krążących komórek myszy. Tło z obniżoną odpornością myszy wykorzystanych w tym modelu pozwoliłoby również na allogeniczny transfer populacji ludzkich komórek odpornościowych, dodając kolejny aspekt "humanizacji". Tło myszy z obniżoną odpornością może jednak maskować rolę limfocytów NK, T lub B, których brakuje lub są wadliwe w tym modelu. Stosunkowo krótki przedział czasowy (24 godziny) stosowany w tym modelu dotyczy głównie odpowiedzi wrodzonej, ale w przypadku długotrwałych infekcji i rozwoju odporności może być konieczne zbadanie innych opcji.

Skóra jest ważnym miejscem zakażenia N. meningitidis, ale stosunkowo niewielka liczba ludzkich naczyń krwionośnych oznacza również, że ekstrapolacja danych na infekcję ogólnoustrojową obejmującą wiele narządów jest trudna. Chociaż model ten pozwala na badanie rozwoju zmian skórnych, nie uwzględniono w nim ważnych etapów infekcji meningokokowej, takich jak nabłonek i skrzyżowanie krwi z mózgiem. Konieczny jest dalszy rozwój tych humanizowanych modeli, aby zająć się tymi innymi aspektami infekcji. Niemniej jednak model ten oferuje ogromny potencjał dla wielu patogenów specyficznych dla człowieka, szczególnie tych atakujących naczynia krwionośne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Gibco Invitrogen	31885-023
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Gibco Invitrogen	10010-056
Ketamina 500	Virbac Francja		nr partii VAL4243
Xylazine	Bayer Healthcare	AMM N° FR/8146715 2/1980	nr partii KPO809S
Optigel	Europhta
Lacrigel	Medicament Autorisé
Tronothane	Lisa Pharma
GC baza agarowa	Conda	1106
Śródbłonek ludzki Pożywka	SFM Gibco Invitrogen	11111
Surowica bydlęca	płodu P A A	A15-101
Transferyna ludzka	Sigma-Aldrich	T3309
UEA lektyna - rodamina	Vector Labs	RL-1062
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H9627
Eosin	Sigma-Aldrich	E4009
Xylene	Sigma-Aldrich	534056
Trzeźwy dermatom rąk	Humeca BV, Holandia	4.SB01
Pomieszczenia dla zwierząt	Innowacyjny	M-BTM-C8
Dziurkacz do biopsji (4 mm)	Dominic Dutscher	30737
Rurki M z matrycą lizującą Fast-Prep	MP Bio 116923050
MagNA Lyzer Green Beads	Roche	3358941001
MagNA Lyzer	Roche	3358976001
nośniki montażowe VECTASHIELD	Vector Labs	H-1000
Vetbond	3M	1469SB	Klej tkankowy
OCT tka	Sakura	4583