Iniekcja dosercowa pod kontrolą obrazowania ultrasonograficznego w celu opracowania mysiego modelu przerzutów raka piersi do mózgu, a następnie podłużnego rezonansu magnetycznego

Podsumowanie

Mysi model przerzutów do mózgu raka piersi jest tworzony za pomocą obrazowania ultradźwiękowego we wstrzyknięciu dosercowym komórek MDA-MB231/Br-GFP. Rozwój wieloogniskowych przerzutów wewnątrzczaszkowych monitorowano podłużnie za pomocą rezonansu magnetycznego 9,4 T o wysokiej rozdzielczości

.

Streszczenie

Przerzuty raka piersi do mózgu, występujące u 30% pacjentek z rakiem piersi w IV stadium, wiążą się z wysoką śmiertelnością. Mediana przeżycia wynosi tylko 6 miesięcy. Bardzo ważne jest, aby mieć odpowiednie modele zwierzęce, aby naśladować hemodynamiczne rozprzestrzenianie się komórek przerzutowych w scenariuszu klinicznym. Tutaj wprowadzamy zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego na małych zwierzętach, aby poprowadzić dokładne wstrzyknięcie komórek tropikalnego raka piersi do lewej komory atymicznym nagim myszom. Podłużny rezonans magnetyczny służy do oceny inicjacji wewnątrzczaszkowej i wzrostu przerzutów do mózgu. Iniekcja dosercowa pod kontrolą USG zapewnia nie tylko dokładne wstrzyknięcie, a tym samym wyższy wskaźnik sukcesu, ale także znacznie zmniejszoną śmiertelność w porównaniu z naszą poprzednią procedurą ręczną. Rezonans magnetyczny o wysokiej rozdzielczości in vivo umożliwia wizualizację hiperintensywnych zmian wieloogniskowych o średnicy zaledwie 310 μm na obrazach T_2-zależnych po 3 tygodniach od wstrzyknięcia. Kontrolny rezonans magnetyczny ujawnia wzrost guza wewnątrzczaszkowego i zwiększoną liczbę przerzutów, które rozprowadzają się po całym mózgu.

Wprowadzenie

Przerzuty do mózgu to najczęstszy nowotwór wewnątrzczaszkowy u dorosłych. Rokowanie jest bardzo złe, z medianą przeżycia wynoszącą 4-6 miesięcy nawet przy agresywnym leczeniu. Rak piersi jest jednym z trzech głównych nowotworów pierwotnych o wysokiej zachorowalności na przerzuty do mózgu^1-3. Kilka linii mózgowo-tropowych raka piersi jest zdolnych do rozwoju przerzutów do mózgu po wstrzyknięciu dosercowym lub doszyjkowym⁴. Bezpośrednie wstrzyknięcie komórek nowotworowych do lewej komory może ominąć łożysko naczyń włosowatych płuc, a tym samym zwiększyć częstość powstawania przerzutów do mózgu, jednocześnie minimalizując przerzuty trzewne. Linia MDA-MB231Br jest jedną z najczęściej stosowanych linii ludzkiego raka piersi do rozwoju przerzutów do mózgu w modelach gryzoni^5,6.

Podobnie jak w wielu innych badaniach^4,7, przeprowadziliśmy manualną procedurę iniekcji dosercowej w naszych poprzednich badaniach. Jednak tylko 50% wskaźnik sukcesu uzyskano przy ręcznym wstrzyknięciu, a część myszy zmarła z powodu powtarzających się procedur inwazyjnych, jeśli wcześniejsze próby zakończyły się niepowodzeniem. Tutaj wprowadzamy zastosowanie procedury pod kontrolą obrazowania, aby zapewnić wstrzyknięcie komórek raka piersi poszukujących mózgu do lewej komory myszy atymicznych. Podłużny rezonans magnetyczny o wysokiej rozdzielczości stosuje się do śledzenia wewnątrzczaszkowego rozwoju przerzutów do mózgu.

Protokół

Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Teksańskiego Southwestern Medical Center.

1. Przygotowanie komórek MDA-MB231/Br-GFP

1. Pobrać i wyhodować komórki MDA-MB231 / Br-GFP (uprzejmie dostarczone przez dr Palmieri i Steega, NCI) w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS, 1% glutaminy i 1% penicyliny/streptomycyny.
2. Obserwuj stan komórek i kolor pożywki i wymieniaj pożywkę co 2-3 dni.
3. Trypsynizuj i zbieraj komórki, gdy zostanie osiągnięte 80% zbiegu, jak opisano w krokach 1.3.1-1.3.5:
   1. Całkowicie usuń starą pożywkę i dodaj 5 ml PBS (1x), aby delikatnie umyć komórki. Wyjmij PBS z naczynia.
   2. Dodaj 1,5 ml trypsyny do naczynia; delikatnie przechyl naczynie, aby upewnić się, że wszystkie komórki są pokryte trypsyną. Włożyć naczynie z powrotem do inkubatora komórkowego i utrzymywać je w temperaturze 37 °C przez 1 minutę.
   3. Wyjmij naczynie z inkubatora i obserwuj komórki pod mikroskopem optycznym, aby upewnić się, że komórki odłączają się od naczynia.
   4. Dodaj 3 ml pożywki, aby zatrzymać działanie trypsyny. Zebrać mieszaninę komórek w probówce wirówkowej. Odwirować mieszaninę z prędkością 2 000 obr./min przez 5 min.
   5. Ostrożnie usunąć pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki wolnej od surowicy do uzyskania jednorodnej konsystencji.
4. Policz odpowiednią liczbę komórek i zawieś je ponownie w pożywce DMEM wolnej od surowicy o końcowym stężeniu 1,75 x 10⁵ komórek w objętości 100 μl.
   1. Weź 50 μl mieszanki komórek i dodaj 50 μl błękitu trypanowego. Po wymieszaniu weź 10 μl mieszaniny i ostrożnie dodaj do szkiełka do liczenia komórek. Użyj wielu próbek, aby zapewnić dokładne oszacowanie liczby komórek.
   2. Przyklej suwak do liczenia komórek, jeden koniec na raz, a licznik komórek zacznie liczyć automatycznie. Weź średnią ze wszystkich wyników zliczania i oblicz całkowitą liczbę komórek.
   3. Ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić je w odpowiedniej objętości pożywki wolnej od surowicy, aby uzyskać końcowe stężenie 1,75 x 10⁵ komórek/objętość 100 μl.
5. Umieść komórki na lodzie przed wstrzyknięciem dosercowym.

2. Iniekcja dosercowa pod kontrolą obrazowania ultrasonograficznego

1. Użyj samic nagich myszy (BALB/c nu/nu) w wieku 6-8 tygodni.
2. Zaloguj się do systemu obrazowania. Zainicjuj przetwornik 704 (40 MHz).
3. Rozpocznij nowe badanie i uzupełnij informacje.
4. Znieczulenie (3% izofluranu/100%_O2 w komorze indukcyjnej) i utrzymywanie zwierząt z izofluranem (2%) w 100%_O2 (1 dm³/min) przez cały zabieg za pomocą stożka nosowego. Znieczulenie potwierdza się, gdy nie obserwuje się odruchu odstawienia z uszczypnięciem palca u nogi.
5. Ustaw temperaturę stołu do obrazowania na 37 °C. Przyklej znieczuloną mysz do podgrzewanego stołu obrazowania w pozycji leżącej.
6. Żel do ultradźwięków należy przechowywać w temperaturze 37 °C przed obrazowaniem. Nałóż żel na klatkę piersiową myszy.
7. Zamontuj przetwornik w uchwycie. Opuść przetwornik, aż do osiągnięcia żądanej głębokości obrazowania. Przesuwaj stolik, aż lewa komora zostanie zidentyfikowana z aortą wstępującą jako punkt orientacyjny (ryc. 1A). Zablokuj scenę, gdy widoczny jest wyraźny widok lewej komory.
8. Pobrać 100 μl mieszaniny komórek do strzykawki o pojemności 1 ml za pomocą igły 22 G. Umieścić i zamocować strzykawkę na uchwycie strzykawki.
9. Przesunąć strzykawkę do przodu w kierunku klatki piersiowej myszy i ostrożnie przesuwać ją na boki, aż końcówka igły znajdzie się w polu obrazowania view (przed wejściem do myszy).
10. Dostosuj wysokość i kąt igły, aby wycelować w dół lewej komory.
11. Natychmiast wbić igłę strzykawki w przestrzeń międzyprzybrzeżną przez warstwy skóry i mięśni do lewej komory pod kierunkiem obrazowania ultrasonograficznego.
    Oznaką udanego wprowadzenia igły do lewej komory jest refluks świeżej krwi tętniczej (różowy kolor w przeciwieństwie do ciemnoczerwonej krwi żylnej) do strzykawki
12. Powoli wstrzykiwać mieszaninę komórek (ryc. 1B).
13. Po zakończeniu wyjmij igłę, podnieś przetwornik, wyczyść żel ultradźwiękowy zwilżoną gazą i usuń taśmę.
14. Przygotuj czystą klatkę z podgrzaną podkładką.
15. Umieść zwierzę na podkładce i obserwuj je aż do pełnego wyzdrowienia.
16. Monitoruj zachowanie zwierzęcia co 24 godziny przez dwa dni.
17. Warunki ogólne i neurologiczne objawy powikłań u myszy eksperymentalnych są rutynowo monitorowane.

3. Monitorowanie MRI rozwoju guza wewnątrzczaszkowego

1. Użyj magnesu o natężeniu 9,4 Tesli, aby monitorować wewnątrzczaszkowy rozwój przerzutów do mózgu.
2. Rozpocznij rezonans magnetyczny dwa tygodnie po implantacji guza i powtarzaj raz w tygodniu przez okres do trzech tygodni.
3. Uspokoić zwierzęta 3% izofluranem i utrzymywać je w znieczuleniu ogólnym (1,5% izofluranu).
4. Monitoruj i utrzymuj stałą temperaturę ciała i oddech zwierzęcia przez cały czas trwania eksperymentu.
5. Obrazy koronalne T 1- i T 2-zależne o wysokiej rozdzielczości (14 warstw o grubości 1 mm, bez przerwy) T₁- i_{T 2-zależne} obrazy koronalne, obejmujące obszar od płata czołowego do tylnego dołu, są pozyskiwane z następującymi parametrami: obrazy T_1-zależne: spin echo multiple slice (SEMS), TR/TE = 400 ms/20 ms, matryca: 256 x 256, Pole widzenia 20 x 20 mm, w płaszczyźnie rozdzielczość: 78 x 78 μm². T_2-ważone obrazy: szybkie sekwencje wielowarstwowe echa wirowego (FSEMS), TR/TE = 2500 ms/48 ms, 8 ciągów echa, matryca: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, rozdzielczość w płaszczyźnie: 78 x 78 μm ^28,9,9,<br /> Zmiany nowotworowe wydają się jaśniejsze niż normalne tkanki mózgowe na obrazach T_2-zależnych.
6. Wielkość guza określa się na obrazach T_2-zależnych poprzez ręczne obrysowanie wzmacniającej części masy na każdym obrazie za pomocą programów MATLAB napisanych przez nas⁸.
   Biorąc pod uwagę, że większość średnic guza jest mniejsza niż grubość plastra (1 mm), rozmiar guza jest przedstawiany jako obszar płaski, a nie objętość.

4. Barwienie H&E potwierdzające przerzuty

1. Złóż myszy, poświęć je natychmiast po ostatnim badaniu MR, wypreparuj mózgi zawierające guz i umieść je w pożywce OCT i zamrożone w temperaturze -80 °C.
2. Przekrój serię koronalnych próbek mózgu o grubości 10 μm za pomocą kriostatu.
3. Wykonaj barwienie H&E na odcinkach mózgu.

Wyniki

Dzięki wysokiej rozdzielczości przestrzennej MRI (rozdzielczość w płaszczyźnie 78 µm), można zidentyfikować hiperintensywne zmiany o średnicy nawet 310 µm (Rycina 2). Ponieważ przerzuty w niniejszym badaniu są bardzo małe, a rozwój martwicy i obrzęku jest minimalny, hiperintensywna zmiana w obrazach T₂-zależnych faktycznie reprezentowała masę guza.

Podłużne badania MRI umożliwiają nieinwazyjną ocenę wzrostu guza in vivo. Jak pokazano na Rysunku 3

Dyskusja

W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że wstrzyknięcie do lewej komory pod kontrolą obrazowania ultrasonograficznego zapewnia dokładność, dzięki której u każdego zwierzęcia w tym badaniu rozwinęły się przerzuty do mózgu i nie zaobserwowano śmierci zwierzęcia. Piękno iniekcji sterowanej obrazem polega na tym, że ścieżka penetracji igły przez skórę i ostatecznie do lewej komory może być monitorowana i dostosowywana pod obrazem, co różni się od procedury ręcznej wymagającej ścisłych anatomicznych punktów orientacyjnych, któryc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
	DMEM HyClone	SH30022.01
Trypsyna	Mediatech	25-051-C1
Automatyczny licznik komórek	BioRad	TC10
Isoflurane	Baxter International, Inc.	1001936060
System obrazowania o wysokiej rozdzielczości VisualSonics Vevo 770	Visual Sonics Inc.
Magnes z otworem poziomym 9,4 T z systemem Varian INOVA Unity	Agilent
Związek O.C.T	Sakura Finetek USA	4583