Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

14.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51150

⸱

15 marca 2014

 ,  , 
1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow, Russia, 3Physiology Department, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

Mikrotubule są z natury niestabilnymi polimerami, a ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące segmentowane mikrotubule z fotoablakowalnymi czapeczkami stabilizującymi. Depolimeryzacja segmentowanych mikrotubul może być wyzwalana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób analizę ruchów z demontującymi końcami mikrotubul.

Streszczenie

Depolimeryzacja mikrotubul może dostarczyć siły do transportu różnych kompleksów białkowych i kulek pokrytych białkiem in vitro. Uważa się, że mechanizmy leżące u podstaw odgrywają istotną rolę w ruchach chromosomów zależnych od mikrotubul podczas podziału komórki, ale odpowiednie białka i ich dokładne role są słabo zdefiniowane. W związku z tym istnieje rosnąca potrzeba opracowania testów do badania takiej ruchliwości in vitro przy użyciu oczyszczonych składników i określonego środowiska biochemicznego. Mikrotubule są jednak z natury niestabilnymi polimerami; Ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Protokoły, które tutaj opisujemy, wykorzystują segmentowane mikrotubule, które są wykonane z fotoablakowalnych czapek stabilizujących. Depolimeryzacja takich segmentowanych mikrotubul może być wywołana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób badania ruchliwości na demontujących się końcach mikrotubul. Technika ta może być wykorzystana do przeprowadzenia analizy ilościowej liczby cząsteczek w znakowanych fluorescencyjnie kompleksach białkowych, które poruszają się procesowo wraz z dynamicznymi końcami mikrotubul. Aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu w tym i innych ilościowych testach fluorescencyjnych, szkiełka nakrywkowe powinny być poddawane obróbce w celu zmniejszenia niespecyficznej absorpcji rozpuszczalnych białek znakowanych fluorescencyjnie. Przedstawiono szczegółowe protokoły uwzględniające nierówności oświetlenia fluorescencyjnego i określające intensywność pojedynczego fluoroforu przy użyciu równoodległego dopasowania Gaussa. Na koniec opisujemy zastosowanie segmentowanych mikrotubul do badania zależnych od mikrotubul ruchów mikrokulek pokrytych białkiem, dostarczając wglądu w zdolność różnych białek motorycznych i niemotorycznych do łączenia depolimeryzacji mikrotubul z procesowym ruchem ładunku.

Wprowadzenie

Mikrotubule są wysoce konserwatywnymi strukturami cytoszkieletu, które są ważne dla architektury komórkowej, ruchliwości komórek, podziału komórek i transportu wewnątrzkomórkowego1. Te dynamiczne polimery łączą się z tubuliny w obecności GTP i spontanicznie przełączają się między wzrostem a skracaniem2. Mikrotubule są bardzo cienkie (tylko 25 nm średnicy), dlatego do obserwacji mikrotubul za pomocą mikroskopu świetlnego należy stosować specjalne techniki optyczne w celu zwiększenia kontrastu. Wcześniejsze prace z tymi polimerami badały ich zachowanie dynamiczne przy użyciu różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC)3. To i podobne badania in vitro wykazały, że w typowych warunkach eksperymentalnych mikrotubule ulegają katastrofie i przechodzą na depolimeryzację tylko rzadko, raz na 5-15 minut (częstotliwość ta dotyczy stężenia rozpuszczalnej tubuliny 7-15 mM badanego w temperaturze 28-32 °C)4. W związku z tym zaproponowano różne techniki indukcji depolimeryzacji mikrotubul w kontrolowany sposób. Skracanie mikrotubul można wywołać przez wypłukanie rozpuszczalnej tubuliny5,6, przecięcie mikrotubul wiązką lasera7 lub użycie mikrotubul podzielonych na segmenty8, jak opisano tutaj. Wcześniejsze prace z wykorzystaniem segmentowanych mikrotubul, a także stochastycznie przełączających się polimerów, wykazały, że małe ładunki wewnątrzkomórkowe, takie jak chromosomy, pęcherzyki i kulki pokryte białkiem, mogą poruszać się na końcach skracających się mikrotubul9-13. Uważa się, że zjawisko to ma bezpośredni wpływ na ruchy chromosomów w komórkach mitotycznych, a mechanizmy leżące u jego podstaw są obecnie aktywnie badane14-16.

Ostatnio techniki oparte na fluorescencji, w tym mikroskopia całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF), zostały wykorzystane do badania ruchliwości z dynamicznymi końcami mikrotubul17-24. Zaletą tego podejścia jest to, że umożliwia badanie interakcji między mikrotubulami a białkami wiążącymi mikrotubule w czasie rzeczywistym przy użyciu białek znakowanych różnymi fluoroforami. Stwierdzono, że kilka kompleksów białkowych porusza się procesowo z wydłużającymi się i/lub skracającymi końcami mikrotubul. Należą do nich białka związane z mikrotubulami Dam110,12,18, Ska119 i XMAP21520, a także silniki kinezynowe Kif18A21,22, MCAK23 i CENP-E24. Białka te wykazują procesywne śledzenie końcówek, które zasadniczo różnią się od klasycznych białek śledzących końcówki, takich jak EB125. Chociaż cząsteczki EB1 i związani z nimi partnerzy wydają się być stabilnie związani z dynamicznymi końcami mikrotubul, poszczególne cząsteczki pozostają związane z końcówką mikrotubuli tylko przez ~ 0,8 sekundy, szybko wymieniając się z rozpuszczalną pulą26. W przeciwieństwie do tego, procesywne urządzenia śledzące końcówki, takie jak Dam1, poruszają się z końcami mikrotubul na wiele mikronów, a ich związek z końcówkami mikrotubul może trwać przez wiele sekund. Czas asocjacji końcówki, a także wynikająca z niego szybkość śledzenia, zależy w dużym stopniu od liczby cząsteczek tworzących kompleks śledzący końcówkę27. Większe zespoły białkowe są zwykle znacznie lepszymi tropicielami końcówek. Na przykład tak złożone zespoły, jak izolowane kinetochory drożdży, mogą pozostawać sprzężone z końcami mikrotubul przez28 godzin. Stwierdzono, że niektóre białka wiążące mikrotubule, np. kompleks białkowy kinetochorowy Ndc80, nie są w stanie śledzić końców mikrotubul na poziomie pojedynczej cząsteczki, jednak Ndc80 jest bardzo skuteczny w sprzęganiu ruchu ładunku kulkowego19,29-31. Dlatego, aby zrozumieć mechanizm śledzenia końcówek przez różne kompleksy białkowe, a także ich role biologiczne, ważne jest zbadanie śledzenia końcówek jako funkcji liczby cząsteczek w kompleksie śledzenia końcówek, a także określenie zdolności tych kompleksów do wykazywania zbiorowej ruchliwości na powierzchni ładunku perełek.

Poniżej przedstawiamy szczegółowe protokoły przygotowania i przeprowadzenia eksperymentów z segmentowanymi mikrotubulami (Rysunek 1A). Po pierwsze, dostępne na rynku szkiełka szklane są modyfikowane w celu mocowania krótkich rurek z polietylenu (Protokół 1). Komora przepływowa mikroskopii wielokrotnego użytku jest następnie składana z takiego szkiełka oraz chemicznie lub plazmowo oczyszczonego i silanizowanego szkiełka nakrywkowego (protokół 2)32-34. Uzyskana objętość komory wynosi tylko 20-25 μl (lub tak mała jak 15 μl, patrz uwaga 3 w protokole 1), wliczając w to objętość rurki doprowadzającej. Można również stosować dostępne na rynku komory przepływowe, ale ich objętość jest zwykle większa, co prowadzi do niepotrzebnego marnotrawstwa białek. W przypadku zastosowania większej komory, objętość wszystkich roztworów w poniższych protokołach powinna być skalowana proporcjonalnie. Nasiona mikrotubul są następnie przygotowywane, na przykład przy użyciu wolno hydrolizowalnego analogu GTP, GMPCPP (trifosforan guanozyno-5'-[(α,β)-metyleno]trifosforan) (protokół 3, patrz także Hyman i wsp.35). Nasiona są unieruchamiane na oczyszczonym szkiełku nakrywkowym, a następnie powierzchnia jest blokowana, aby zapobiec niespecyficznemu wchłanianiu innych białek32 (protokół 4 opisuje immobilizację nasion za pomocą digoksygeniny). Segmentowane mikrotubule można następnie przygotować za pomocą protokołu 5. Głównym uzasadnieniem tego podejścia jest to, że dynamiczne polimery mikrotubul, które tworzą się w obecności GTP, mogą być tymczasowo stabilizowane przez dodanie krótkich "czapeczek" stabilnych segmentów tubuliny, które zawierają GMPCPP. Kapturki te zawierają również tubulinę znakowaną rodaminą, dzięki czemu można je usunąć po prostu oświetlając pole widzenia laserem o długości fali 530-550 nm lub lampą łukową rtęciową (Protokół 6)36. Intensywność fluorescencji sygnału śledzenia końcówki może być następnie wykorzystana do oszacowania liczby cząsteczek, które przemieszczają się wraz z demontującymi się końcami mikrotubul, biorąc pod uwagę nierówności oświetlenia pola mikroskopowego (Protokół 7). Podobne podejście można zastosować do badania interakcji między mikrotubulami depolimeryzującymi a kulkami pokrytymi białkiem, przygotowanymi zgodnie z opisem w27 (Protokół 8). Niektóre białka łatwo wiążą się ze ściankami segmentowanych mikrotubul, ale pęseta laserowa może być również używana do przytrzymywania kulki w pobliżu ściany mikrotubul, ułatwiając w ten sposób jej wiązanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wymagany sprzęt: Opisane poniżej eksperymenty wymagają mikroskopu świetlnego wyposażonego w moduły do obrazowania DIC i fluorescencyjnego (Tabela 1). Oświetlenie LED w polu jasnym może być wykorzystane do znacznego usprawnienia detekcji przymocowanych do szkiełka przedmiotowego zarodków mikrotubul37, których obserwacja przy użyciu zwykłej lampy halogenowej jest utrudniona. W celu kontrolowania przepływu cieczy w komorach mikroskopowych roztwory powinny być wymieniane za pomocą pompy perystaltycznej zdolnej do osiągania prędkości przepływu od 10-100 μl/min. Można również zastosować pompę strzykawkową, jednak należy zachować ostrożność, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, które mogą powstać przy gwałtownej zmianie prędkości przepływu. Do manipulowania kulkami pokrytymi białkiem, na przykład w celu zbliżenia ich do ściany segmentowanej mikrotubuli, do osi optycznej mikroskopu można wprowadzić wiązkę lasera ciągłego o długości fali 1064 nm i skupić ją za pomocą obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej (1,3 lub wyższej), aby stworzyć pułapkę optyczną. Do ilościowej analizy intensywności fluorescencji pojedynczych cząsteczek światło wzbudzenia powinno pochodzić z źródła laserowego, ponieważ natężenie tego źródła światła jest bardziej stabilne niż w przypadku lampy rtęciowej. Aby zminimalizować wibracje mechaniczne, mikroskop powinien zostać umieszczony na stole optycznym. Do badania ruchu kulek wraz z depolimeryzującymi końcami mikrotubul pod stałą siłą oraz do pomiaru sygnałów siły w pojedynczych pomiarach11,38,39 wymagany jest bardziej zaawansowany sprzęt; metody te zostaną opisane w innym opracowaniu.

1. Wykonywanie komór przepływowych wielokrotnego użytku

Szklane płytki do wielorazowych komór przepływowych można zamówić w lokalnym zakładzie produkcji szkła, korzystając ze schematów przedstawionych na Rysunku 1B (szczegóły dotyczące dostawcy znajdują się w Tabeli 2). Za pomocą frezowania ultradźwiękowego należy zmodyfikować standardowe płytki mikroskopowe (75 mm x 25 mm, grubość 1,0 mm), aby wykonać dwa rowki o długości 15±1 mm, szerokości 1,0±0,1 mm i głębokości 0,8±0,05 mm. Odległość między najbliższymi końcami rowków powinna wynosić 14±1 mm; odległość ta jest optymalna dla komory montowanej z szkiełkiem nakrywnym o wymiarach 22 mm x 22 mm. Listę pozostałych materiałów znajduje się w Tabeli 2.

  1. W każdym rowku w szkiełku przedmiotowym umieść rurkę polietylenową o długości 100 mm (średnica zewnętrzna 0,61 mm, Tabela 2), pozostawiając ok. 5 mm wystawania poza wewnętrzne końce rowków. Przymocuj rurki wewnątrz rowków za pomocą kleju cyjanoakrylowego, całkowicie zatapiając rurki w rowkach.
  2. Wypełnij rowki klejem epoksydowym, unikając przedostania się kleju do wnętrza rurek. Pozostaw klej do wyschnięcia na ok. 1 dzień.
  3. Ostrym ostrzem brzytwy odetnij utwardzoną masę kleju 3-4 mm od dystalnego końca każdego miejsca mocowania, usuwając części znajdujące się proksymalnie względem centrum szkiełka. Rurki powinny pozostać w swoich rowkach. Usunięcie części proksymalnych spowoduje również odcięcie i usunięcie wewnętrznych wystających fragmentów, tworząc płaską powierzchnię z dwoma otworami rurek.
  4. Napełnij strzykawkę wodą i sprawdź, czy rurki działają prawidłowo. Jeśli ciecz przepływa swobodnie, nanieś kroplę kleju epoksydowego (o średnicy ok. 5 mm) na zewnętrzne końce rowków i pozostaw do wyschnięcia na 1 dzień (Rysunek 1D). Dzięki temu komory będą trwalsze, co pozwoli na ich wielokrotne użytkowanie przez wiele miesięcy.
    Uwaga 1: Aby przygotować komorę do mikroskopu odwróconego, należy dodatkowo zmodyfikować szkiełka, wykonując dwa małe otwory na przeciwległych końcach rowków (Rysunek 1C). Przełóż rurki przez otwory w szkiełku, zegnij je i ciasno dopasuj wewnątrz rowków (Rysunek 1E). Postępuj zgodnie z krokami 1.2-1.4, ale usuń klej epoksydowy z całej powierzchni, która będzie służyć do wykonania komory przepływowej.
    Uwaga 2: Aby zmniejszyć objętość komory, zastosuj frezowanie, aby wykonać dwa wgłębienia o głębokości 0,050±0,005 mm, pozostawiając środkową część szkiełka o szerokości 5,0±0,5 mm i lekkim wyniesieniu (patrz „obszary trawione” na Rysunku 1B i 1C). Po zmontowaniu komory przepływowej (zgodnie z opisem poniżej) umieść taśmę dwustronną w tych wgłębieniach.
    Uwaga 3: Aby ponownie wykorzystać zmodyfikowane szkiełka, po zakończeniu eksperymentów usuń szkiełko nakrywkę i taśmę dwustronną za pomocą brzytwy. Usuń uszczelniacz, odrywając go i przecierając szkiełko 70% etanolem. Umieść szkiełko w pojemniku z 1-2% roztworem laboratoryjnego detergentu do mycia naczyń, podłącz rurki do pompy perystaltycznej i przepłucz 50-70 ml, a następnie taką samą objętością wody dejonizowanej, wysusz i przechowuj w bezpyłowym przedziale.

2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych

Ten protokół zajmuje od 6 do 8 h i pozwala na przygotowanie 12 szkiełek coverglass. Będzie potrzebny jeden ceramiczny uchwyt na szkiełka coverglass oraz 3 słoiczki do barwienia szkiełek z pokrywkami; objętość słoiczka powinna wynosić 15 ml, tak aby każdy mógł pomieścić 4 ułożone jedno na drugim szkiełka coverglass. Do inkubacji szkiełek z silanem należy użyć szklanego słoika z pokrywką (250 ml). Należy używać standardowych szklanych szkiełek coverglass nr 1 (22 mm x 22 mm lub 22 mm x 30 mm, lista materiałów znajduje się w Tabelach 2 i 3). Wszystkie etapy należy przeprowadzić w komorze z wyciągiem (dygestorium), nosząc rękawice.

  1. Umieścić szkiełka nakrywkowe w szklanych naczyniach do barwienia i wypełnić je acetonem. Inkubować przez 1 hr, a następnie przepłukać 10x wodą dejonizowaną.
  2. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 10 min w etanolu i ponownie przepłukać 10x wodą dejonizowaną.
  3. Przygotować roztwór „piranha”. Wlać 60 ml roztworu nadtlenku wodoru (30% w wodzie) do odpornego na ciepło naczynia szklanego i powoli dodać 100 ml kwasu siarkowego (końcowy stosunek kwasu do roztworu nadtlenku wodoru wynosi 5:3). Roztwór ulegnie nagrzaniu, co jest zjawiskiem normalnym, jednak należy zachować ostrożność. Roztwór „piranha” jest niezwykle żrący! Należy używać grubego fartucha laboratoryjnego, rękawiczek i gogli ochronnych!
  4. Wypełnić naczynia do barwienia szkiełek nakrywkowych roztworem „piranha”, zamknąć pokrywki i umieścić naczynia w kąpieli wodnej wstępnie podgrzanej do 90 °C na 1 hr.
  5. Odlać roztwór „piranha” i zutylizować go zgodnie z przepisami BHP obowiązującymi w miejscu pracy. Przepłukać szkiełka nakrywkowe 10x wodą dejonizowaną.
  6. Wypełnić naczynia do barwienia szkiełek nakrywkowych 0.1 M KOH, inkubować przez 10 min i przepłukać 10x wodą dejonizowaną. Pozwoli to zneutralizować wszelkie pozostałości kwasu na szkiełkach nakrywkowych po obróbce roztworem „piranha”.
  7. Osuszyć szkiełka nakrywkowe pojedynczo, trzymając każde z nich pęsetą z płaskimi końcówkami pokrytą teflonem (aby zminimalizować uszkodzenia powierzchni szkła) i dmuchając sprężonym suchym azotem. Należy upewnić się, że szkiełka nakrywkowe są całkowicie suche, ponieważ roztwór silanu jest wysoce reaktywny w obecności wody.
  8. Ułożyć osuszone szkiełka nakrywkowe w uchwytach ceramicznych (12 szkiełek na uchwyt), które powinny zostać wcześniej dokładnie osuszone azotem. Uchwyty ceramiczne należy trzymać przykryte, aby zapobiec osadzaniu się kurzu na powierzchni szkiełek nakrywkowych.
  9. Wypełnić dno szklanego słoja o pojemności 250 ml (średnica 6 cm) sitami molekularnymi, Grade 564, w celu absorpcji wody.
  10. Wypełnić słój 200 ml roztworu silanu PlusOne Repel i powoli zanurzyć w nim uchwyt ceramiczny ze szkiełkami nakrywkowymi, zamknąć pokrywkę i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej. Pozwoli to na utworzenie powłoki hydrofobowej na powierzchni szkiełka nakrywkowe.
  11. Powoli wyjąć uchwyt ze szkiełkami nakrywkowymi ze słoja i przekładać szkiełka nakrywkowe pojedynczo do naczyń do barwienia wypełnionych metanolem.
  12. Umieścić metalowy lub szklany piedestał w zbiorniku z wodą kąpieli ultradźwiękowej w taki sposób, aby naczynie do barwienia szkiełek było zanurzone do 2/3 jego wysokości. Sonikować przy mocy 70 W przez 20 min, wymieniając roztwór metanolu co 5 min, a następnie przepłukać 10x wodą dejonizowaną. Jeśli silanizacja przebiegła prawidłowo, szkiełka nakrywkowe będą wydawać się suche po wyjęciu z wody.
  13. Dokładnie usunąć resztki wody za pomocą azotu, jak opisano powyżej.
  14. Przekładać szkiełka nakrywkowe chusteczkami Kimwipes, aby uniknąć kontaktu powierzchni szkiełek ze sobą. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w szczelnym pojemniku przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej.
    Uwaga 1: Kroki 2.1-2.6 można zastąpić czyszczeniem szkiełek nakrywkowych w urządzeniu Plasma Cleaner przez 15 min przy mocy 30 W, co znacznie skraca całkowity czas przygotowania. Ciśnienie w komorze czyszczącej ustawia się na 100-200 mTorr. Można stosować zarówno tlen atmosferyczny, jak i sprężony. Oczyszczone plazmowo szkiełka nakrywkowe należy ułożyć w uchwytach ceramicznych i przejść do kroku 2.7.

3. Przygotowanie zarodków mikrotubul stabilizowanych GMPCPP

Procedura ta zajmie około 1 hr, a otrzymane zarodniki mikrotubul są stabilne przez 1-2 dni w temperaturze pokojowej. Listę odczynników przedstawiono w Table 4.

  1. Wymieszać na lodzie:
    • 10 μl nieznakowanej tubuliny (100 μM, Tabela 4) w buforze BRB-80 (80 mM Pipes, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl2, pH 6.9 przy użyciu KOH; uzupełnić o 1-2 mM DTT, używając świeżej porcji dla każdego eksperymentu).
    • 2,6 μl tubuliny znakowanej digoksigeniną (Tabela 4). Dostosować objętość w zależności od preparatu, tak aby końcowy stosunek tubuliny znakowanej do nieznakowanej wynosił ~1:10. Dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie.
    • 1,4 μl 10 mM GMPCPP (stężenie końcowe 1 mM)
  2. Inkubować przez 15 min w temperaturze 35 °C; zarodki urosną do długości 2-3 μm. Dostosować czas, jeśli pożądana jest inna długość mikrotubul.
  3. Dodać 35 μl BRB-80 (podgrzanego wcześniej do 35 °C), wymieszać poprzez pipetowanie i wirować przez 15 min przy 25 000 x g w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad z zarodków.
  4. Odlać nadsącz i wypłukać osad, delikatnie dodając i usuwając 50 μl ciepłego buforu BRB-80.
  5. Dokładnie resuspender osad w 25 μl BRB-80.

4. Przytwierdzanie zarodników mikrotubul do szkiełek nakrywkowych

Protokoły 4 i 5 będą wymagać 2-3 hr, dlatego każdego dnia wykorzystuje się dwie komory przepływowe.

  1. Zmontować komorę przepływową zgodnie z instrukcjami producenta, używając silanizowanych szkiełek nakrywkowych, i przejść do kroku 4.2. W przypadku użycia szkiełek nakrywkowych wykonanych na zamówienie (Protokół 1), należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Przykleić dwa kawałki dwustronnej taśmy (5 mm x 30 mm) wzdłuż środkowego obszaru o szerokości ok. 5 mm, położyć silanizowane szkiełko nakrywkowe na taśmie i mocno docisnąć.
    2. Wypełnić komorę buforem BRB-80 przez jedną z rurek, a następnie zatkać obie rurki okrągłymi wykałaczkami.
    3. Wycisnąć małą kroplę dwukolorowego uszczelniacza Kwik Cast na mały plastikowy szalkę Petriego i szybko, ale dokładnie wymieszać wykałaczką. Uszczelniacz zmieni kolor na zielony; należy go natychmiast nałożyć, starannie uszczelniając wszystkie krawędzie szkiełka nakrywkowego. Jeśli uszczelniacz wniknie zbyt głęboko pod szkiełko nakrywkowe, należy otworzyć jedną z rurek, usuwając wykałaczkę, i wywrzeć delikatny nacisk, aby zapobiec wyciekaniu uszczelniacza do wnętrza rurek.
    4. Pozostawić komorę do wyschnięcia na 10 min i potwierdzić, że przepływ nie jest ograniczony przed dalszą procedurą.
  2. Umieścić komorę na stoliku mikroskopu podgrzanym wcześniej do 32 °C i podłączyć jedną z rurek do pompy, która będzie wypompowywać ciecz. Długość rurki wlotowej powinna być zminimalizowana, aby uniknąć niepotrzebnej utraty odczynników: zalecana długość to 5-7 cm. Zanurzyć ten koniec w fiolce o pojemności 0,5 ml z buforem BRB-80. Ten oraz wszystkie poniższe roztwory powinny być podgrzane wcześniej do 32-35 °C.
  3. Wywrzeć delikatny nacisk za pomocą pompy lub po prostu unieść koniec rurki wylotowej, aby usunąć pęcherzyki powietrza, które mogą sporadycznie powstawać po usunięciu korka z rurki wlotowej.
  4. Ustawić szybkość pompowania na 100 μl/min. Przemyć 2 objętościami komory przeciwciałami anty-digoksygeninnymi rozcieńczonymi 1:30 w BRB-80, inkubować przez 15 min, aby umożliwić adsorpcję przeciwciał.
  5. Przemyć 5-10 objętościami komory ciepłym buforem BRB-80, inkubować przez 10 min z 1% Pluronic F-127 w BRB-80, aby zablokować hydrofobową powierzchnię silanizowanego szkiełka nakrywkowego.
  6. Przemyć 5-10 objętościami komory buforem do motylości (BRB-80 uzupełniony o 0,4 mg/ml kazeiny).
  7. Zmniejszyć prędkość pompy do 10 μl/min i przefuzywać zarodniki mikrotubul rozcieńczone 1:200-1:600 w 30-40 μl buforu do motylości. Inkubować przez 15 min, aby wspomóc wiązanie zarodników do przeciwciał zaadsorbowanych na szkiełku nakrywkowym.
  8. Przemyć komorę przy 100 μl/min za pomocą 400 μl buforu do motylości, aby usunąć materiał niewiązany.
    Uwaga 1: Powstała gęstość zarodników powinna wynosić 10-30 na pole widzenia mikroskopu (Rysunek 2A). W celu rozwiązania problemów należy użyć tubuliny znakowanej fluorescencyjnie podczas polimeryzacji (krok 3.1), co ułatwi wykrycie zarodników przytwierdzonych do szkiełka nakrywkowego.
    Uwaga 2: Jako nukleatory mikrotubul można również wykorzystać aksonemy przygotowane z Chlamydomonas40 lub innych źródeł biologicznych, a także pelikuly lizeowanych i odciliowanych komórek Tetrahymena41. Nukleatory te są przydatne do tworzenia małych macierzy mikrotubul i są preferowane, gdy pożądana jest konkretna liczba protofilamentów w mikrotubulach (zarodniki GMPCPP nukleują jedną mikrotubulę zawierającą ≥14 protofilamentów42). Struktury te mogą być przytwierdzone do oczyszczonych szkiełek nakrywkowych poprzez niespecyficzną adsorpcję, jednak przytwierdzenie to jest zazwyczaj mniej stabilne w porównaniu z przytwierdzeniem opartym na przeciwciałach, szczególnie przy użyciu silanizowanych szkiełek nakrywkowych.

5. Przygotowanie mikrotubul segmentowanych

Wszystkie poniższe objętości roztworów dotyczą objętości komory 15-20 μl; w przypadku zastosowania większej komory należy zwiększyć je proporcjonalnie.

  1. Podgrzej wcześniej mieszaninę nieznakowanej tubuliny (45 μl buforu do badania ruchliwości uzupełnionego o 1 mM Mg-GTP oraz 10-15 μM nieznakowanej tubuliny) przez 30 s w temperaturze 35 °C. Przepłucz z przepływem 30 μl/min.
  2. Monitoruj wzrost mikrotubul za pomocą optyki DIC (Rycina 2B, Wideo 1). Podczas inkubacji trwającej 5-7 min mikrotubule zazwyczaj osiągają długość ~10 μm.
  3. Przygotuj mieszaninę tubuliny z rhodaminą (65 μl buforu do badania ruchliwości uzupełnionego o 0,5 mM GMPCPP oraz 2-5 μM tubuliny znakowanej rhodaminą z molowym stosunkiem rhodaminy do tubuliny wynoszącym 0,5-1) i podgrzej roztwór w temperaturze 35 °C przez 30 s.
  4. Przepłucz natychmiast z przepływem 30 μl/min. Inkubuj przez 8-10 min, aby wspomóc tworzenie stabilnych fluorescencyjnych czapeczek na końcach mikrotubul. Stabilne segmenty mikrotubul będą również nukleować spontanicznie i będą widoczne w optyce DIC.
  5. Dokładnie wypłucz komorę 100 μl buforu do badania ruchliwości z przepływem 20 μl/min, aby usunąć tubuliny i nukleotydy, a także rozpuszczalne fragmenty mikrotubul.
  6. Za pomocą DIC potwierdź, że mikrotubule są widoczne (Rycina 2D); ich liczba powinna jednak zmaleć, ponieważ wiele mikrotubul ulega rozmontowaniu podczas tworzenia czapeczek (Wideo 2 pokazuje typowe pole z segmentowanymi mikrotubulami).
    Uwaga 1: Segmentowane mikrotubule są bardzo stabilne i mogą być używane przez co najmniej 2 h. Jednak czas życia tych mikrotubul skraca się przy nadmiernej wymianie roztworu lub w przypadku zastosowania 2-merkaptoetanolu w buforze do obrazowania.

6. Eksperymentalna obserwacja śledzenia białek przez depolimeryzujące końce mikrotubul

  1. Wprowadzić 30-50 μl białka fluorescencyjnego (0,1–20 nM) do komory przy 10 μl/minJeśli zaobserwowane zostanie przyleganie białka do szkiełka nakrywkowe, należy uzupełnić bufor do badania ruchliwości o BSA w stężeniu 4–8 mg/ml. Śledzenie końców białka Alexa488-Dam1 wymaga dodatkowo zastosowania 10 mM DTT lub 0,5–1% βME.10.
  2. Ogranicz pole oświetlenia za pomocą przysłony polowej mikroskopu, aby uniknąć niepotrzebnego blaknięcia i depolimeryzacji mikrotubul.
  3. Rozpocząć akwizycję wideo przy użyciu kostki filtru GFP, a następnie przełączyć się na kostkę filtru Rhodamine bez przerywania rejestracji obrazu. Czerwone segmenty na końcach mikrotubul powinny być wyraźnie widoczne; zaczną one szybko blednąć i ulegać rozpadowi (Wideo 3).
  4. Kontynuuj naświetlanie, aż czapki niemal całkowicie znikną (zazwyczaj trwa to od 10 do 20 s, lecz tym razem czas ten będzie dłuższy dla czapek z niższym stosunkiem znakowania rodaminą), a następnie przełącz z powrotem na kanał GFP, aby zarejestrować śledzenie białek podczas depolimeryzacji mikrotubul.
  5. Analizę uzyskanych sekwencji należy przeprowadzić poprzez konstrukcję kymografów, t. j. obrazy dwuwymiarowe ukazujące intensywność fluorescencji wzdłuż osi mikrotubuli w różnych punktach czasowych podczas obserwacji) przy użyciu programu MetaMorph, bezpłatnego programu ImageJ lub innego oprogramowania do przetwarzania obrazów (Rysunek 2E).
    Uwaga 1: Szybkość akwizycji powinna zostać dostosowana do czasu wystąpienia obserwowanych zdarzeń. Zalecana szybkość to 2-3 klatki na sekundę (fps) w przypadku powolnie poruszających się kompleksów Dam1 o strukturze pierścienia.27 lecz czas akwizycji dla pojedynczych cząsteczek powinien wynosić >20 kl./s19.
    Uwaga 2: Wysokoczuła kamera EMCCD, np. Do szybkiej rejestracji zdarzeń śledzenia końców depolimeryzujących mikrotubul wymagana jest kamera ANDOR iXon3. Zalecane ustawienia kamery Andor iXon3 to: wzmocnienie (gain) 5x, wzmocnienie EM (EM gain) 200, prędkość odczytu 1 MHz, 16-bitowy tryb sensora oraz czas ekspozycji 80 ms.
    Uwaga 3: Zastosowanie mikroskopii TIRF pozwoli poprawić stosunek sygnału do szumu, jednak należy użyć krótszych mikrotubul, tak aby fluorescencyjne kapturki stabilizujące znajdowały się w zasięgu pola ewanescentnego.

7. Analiza ilościowa rozmiaru cząsteczkowego kompleksów śledzących końcówki mikrotubul

Uzasadnieniem dla tego podejścia jest określenie liczby cząsteczek w kompleksie śledzącym wierzchołek poprzez wyznaczenie stosunku całkowitej intensywności fluorescencji kompleksu śledzącego wierzchołek do intensywności pojedynczego fluoroforu. Podejście to można zastosować do fuzji białek z GFP oraz białek znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi, jednak może ono zaniżać liczbę cząsteczek w kompleksach śledzących wierzchołek, jeśli niektóre cząsteczki białek w preparatach nie wykazują fluorescencji.

  1. Zarejestruj kinetykę fotoblaknięcia dla cząsteczek białek znakowanych fluorescencyjnie.
    1. Zmontuj standardową komorę mikroskopową, używając niemodyfikowanego szkiełka przedmiotowego, dwóch pasków dwustronnej taśmy klejącej oraz czystego szkiełka nakrywki, którą można przygotować zgodnie z całym Protokołem 2 lub wyłącznie etapami 2.1–2.6 niniejszego protokołu.
    2. Dodać około 50 nM białka w buforze do badań motylości, krótko przemyć buforem do badań motylości, a następnie zamknąć komorę za pomocą VALAP (Tabela 4). Zoptymalizować stężenie białka, aby uzyskać pole z równomiernie rozproszonymi plamkami (Rysunek 3A), reprezentujące pojedyncze cząsteczki i ich niewielkie agregaty (trimery i tetramery, które mogą tworzyć się spontanicznie w roztworze lub mogą pojawić się, gdy kilka pojedynczych cząsteczek znajduje się blisko siebie i nie można ich rozróżnić). Ten krok jest bardzo ważny dla uzyskania wielopiątkowego rozkładu stopni fotoblaknięcia i dokładnego wyznaczenia wielkości stopnia (patrz poniżej).
    3. Zminimalizuj natężenie lasera wzbudzającego do poziomu, przy którym poszczególne punkty fluorescencyjne są nadal widoczne; przy niższym natężeniu oświetlenia czas fotowybielania ulega wydłużeniu, co pozwala na uzyskanie dłuższych przebiegów fotowybielania. Zminimalizuj również czas ekspozycji, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wybielenia więcej niż jednego fluoroforu w jednej klatce. Zalecane ustawienia dla kamery Andor iXon3: wzmocnienie (gain) 5,0x, wzmocnienie EM (EM gain) 999, szybkość odczytu 10 MHz, czas ekspozycji 50–100 ms.
    4. Ustaw ostrość na powierzchni szkiełka nakrywkowego, zamknij migawkę oświetlenia, przenieś się do nowego pola, otwórz migawkę oświetlenia i wykonaj zdjęcia aż do całkowitego wybielenia wszystkich kompleksów (dalej określanych jako img(x,y)).
  2. Skoryguj uzyskane obrazy pod kątem nierównomierności oświetlenia (Rysunek 3B).
    1. Przygotować roztwór dowolnego fluoroforu, np. 1 µM Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) w buforze BRB-80. Taki roztwór można przygotować wcześniej, podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Złożyć komorę zgodnie z opisem w sekcji 7.1.1, używając jednak zwykłej szkiełka nakrywkowego. Dodać roztwór fluoroforu i uszczelnić komorę za pomocą VALAP.
    3. Zbierz >50 obrazów całego pola widzenia mikroskopu: przemieścić stolik w nowy, niewybielony obszar przy zamkniętej migawce oświetlenia, a następnie zarejestrować obrazy natychmiast po otwarciu migawki.
    4. Utwórz średnią projekcję tego stosu i przefiltruj ją za pomocą rozmycia gaussowskiego o promieniu 5 pikseli, korzystając z programu ImageJ lub innego oprogramowania (Rycina 3C). Powstały obraz przedstawia rozkład natężenia oświetlenia pola (Illum(x,y), gdzie Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. i y odpowiadają współrzędnym piksela).
    5. Wyznacz maksymalną jasność piksela tego obrazu (Max(Illum)).
    6. Przy zamkniętej migawce oświetlenia i korzystając z tych samych ustawień kamery, co w sekcji 7.2.3, należy wykonać jedno zdjęcie i wyznaczyć średnią intensywność pikseli tego obrazu; wartość ta odpowiada CN, szumowi kamery.
    7. Wykorzystaj powyższe wartości oraz obraz (Oświetlenie(x,y)) w celu normalizacji obrazu eksperymentalnego (img(x,y)) przy użyciu następującego wyrażenia:
      Image normalization formula: img^norm(x,y) = (Max(IIlum)-CN)/(IIlum(x,y)-CN) diagram.
      Użyj otrzymanego obrazu obraznorma(x,y) do analizy ilościowej jasności stacjonarnych kompleksów fluorescencyjnych, a także do normalizacji obrazów za pomocą kompleksów referencyjnych (tip-tacking complexes) (Rysunek 3D).
  3. Wyznaczanie intensywności pojedynczego fluoroforu.
    1. Wykorzystanie obrazów znormalizowanych obraznorma(x,y) i dowolne oprogramowanie do przetwarzania obrazów; wybierz fluorescencyjną plamkę z obszarem kołowym (o średnicy 5–6 pikseli) i wyznacz jej intensywność całkowitą (integralną) dla wszystkich klatek, generując krzywe fotowyblakowania. Unikaj bardzo jasnych punktów (> 5-krotnie jaśniejsze od tych słabszych).
    2. Używając tego samego narzędzia do zaznaczania obszarów kołowych, wybierz co najmniej 3 obszary wolne od plamek, wygeneruj odpowiadające im krzywe fotowyblakania, oblicz średnią i dopasuj do funkcji zaniku wykładniczego.
    3. Ztabuluj tę krzywą natężenia tła, aby dopasować ją do eksperymentalnych punktów czasowych, a następnie odejmij ją od krzywych fotoblurkowania.
    4. Wygładź krzywe fotoblokowania (wyciągnij średnią z ruchomego okna obejmującego 3-5 punktów). Przeanalizuj wizualnie otrzymane krzywe i odrzuć każdą krzywą, która wykazuje gwałtowny wzrost fluorescencji lub brak wyraźnego blokowania (Rysunek 3E).
    5. Dla każdej z pozostałych krzywych (zazwyczaj 50–70% całkowitej liczby krzywych) należy wizualnie wyznaczyć końcowe plateau, osiągnięte po wygaszeniu fluorescencji plamki. Skrócić ten odcinek tak, aby pozostało około 100 punktów, a następnie obliczyć średnią z tych intensywności. Wartość tę należy odjąć od skróconej krzywej fotowygaszania, aby zminimalizować niewielkie wahania poziomu tła oraz zredukować wielkość piku tła (poniżej).
    6. Narysuj histogram intensywności dla wszystkich punktów czasowych z 20 lub więcej krzywych fotoblachingu (>1000 punktów czasowych). Histogram powinien wykazywać co najmniej 4 wyraźne piki (patrz Uwaga 2).
    7. Dopasuj do histogramu ekwidystansowy rozkład Gaussa10,43 korzystając z programu MATLAB, Mathematica lub podobnego oprogramowania (Rycina 3F):
      Summation formula, Gaussian distribution; mathematical equation relevant to data fitting.
      gdzie Ai i σi , d i N są parametrami dopasowania. Parametry Ai i σi odpowiadają amplitudzie i szerokości i-ty pik; d jest odległością między pikami; N jest liczbą całkowitą, która odpowiada całkowitej liczbie pików w rozkładzie. Jeśli centra pierwszych 3 lub więcej pików wykazują wizualnie dobrą zgodność z dopasowaną linią, odległość między tymi pikami (parametr d) odpowiada intensywności fluorescencji pojedynczego fluoroforu.
      Uwaga 1: Liczbę badanych punktów (Rozdział 7.3.6) należy zwiększyć, jeśli system mikroskopowy wykazuje znaczne wibracje lub istnieje inne źródło szumów (np. niestabilna wiązka lasera).
      Uwaga 2: Niezbędne jest uzyskanie >3 piki dla dokładnej analizy z równoodległym dopasowaniem gaussowskim. Jeśli uzyskano mniej pików, fałszywy (np. podwójny) rozmiar kroku mógł zostać uzyskany w warunkach nieoptymalnego oświetlenia, np. gdy kropki blakną zbyt szybko i pojedyncze stopnie nie są wyraźnie rozdzielone.
  4. Wyznacz rozmiar cząsteczkowy kompleksu śledzącego końce mikrotubul (tip-tracking complex).
    1. Należy wykorzystać obrazy zebrane zgodnie z Protokołem 6 i wybrać pierwsze 2–4 klatki, które zostały pozyskane bezpośrednio po otwarciu migawki. Jeśli pole było oświetlone przez pewien czas przed zaobserwowaniem śledzenia końcówki, oryginalną intensywność należy oszacować na podstawie kinetyki fotoblaknięcia w tych samych warunkach eksperymentalnych.
    2. Wyciągnij średnią z wybranych klatek i znormalizuj otrzymany obraz zgodnie z opisem w sekcjach 7.2.5-7.2.7.
    3. Zmierz całkowitą intensywność kompleksu fluorescencyjnego służącego do śledzenia końcówki, używając tej samej wielkości obszaru, co w sekcji 7.3.1.
    4. Zmierz intensywność całkowitą trzech obszarów tła znajdujących się w pobliżu kompleksu śledzącego wierzchołek i, korzystając z tego samego obszaru, oblicz średnią z tych wartości, a następnie odejmij ją od intensywności kompleksu śledzącego wierzchołek z sekcji 7.4.3.
    5. Oblicz liczbę cząsteczek fluoroforu w kompleksie, dzieląc intensywność fluorescencji uzyskaną w rozdziale 7.4.4 przez intensywność pojedynczego fluoroforu uzyskaną w rozdziale 7.3.5.
      Uwaga 1: Zaleca się, aby ustawienia oświetlenia i akwizycji dla protokołu 7.4 były takie same jak w protokole 7.1. Jeśli w trakcie tych kroków zmieniono czas ekspozycji lub intensywność lasera, otrzymane wartości fluorescencji należy odpowiednio przeskalować. Dokładność takiego skalowania powinna zostać jednak zweryfikowana poprzez obrazowanie tej samej próbki (np. czasu fluorescencji) w tych różnych warunkach i obliczając stosunek uzyskanych intensywności.

8. Śledzenie końcówek mikrotubul za pomocą kulek pokrytych białkiem

  1. Przeprowadź eksperymenty z kuleczkami śledzącymi końce mikrotubul, wywołując depolimeryzację MT zgodnie z protokołem 6. Intensywność źródła światła DIC powinna zostać zmniejszona, aby umożliwić jednoczesną obserwację fluorescencji Rodaminy i obrazowanie DIC.
  2. Przygotuj kuleczki zgodnie z metodami Grishchuk et al.10 oraz Asbury et al.11. Wprowadź 30-50 μl zawiesiny kuleczek do komory z prędkością 10 μl/min. Sugerowane stężenie kuleczek wynosi 10-16-10-17 M.
  3. W przypadku użycia mikroskopu odwróconego, zdejmij komorę ze stolika mikroskopu i odwróć ją na 5-10 min, aby umożliwić sedymentację kuleczek na szkiełku nakrywek. Sprzyja to lepszemu wiązaniu kuleczki z mikrotubulami przytwierdzonymi do szkiełka, jednak procedura ta nie jest skuteczna w przypadku kuleczek polistyrenowych o średnicy 0,5 μm, które wykazują niewielką sedymentację grawitacyjną w tak krótkim czasie.
  4. Wybierz kuleczkę przytwierdzoną do mikrotubuli związanej ze szkiełkiem; kuleczka powinna poruszać się po wyraźnym łuku44 (Rysunek 4A). Przytwierdzona kuleczka powinna znajdować się w odległości 1-3 μm od powierzchni szkiełka nakrywkowego, co jest wyraźnie widoczne dzięki sporadycznie występującym kuleczkom przyczepionym do szkiełka, które pozostają nieruchome.
  5. Przełącz na kostkę filtracyjną dla Rodaminy i rozpocznij zbieranie obrazów przy jednoczesnym zastosowaniu oświetlenia DIC.
  6. Otwórz migawkę, aby oświetlić pole obrazowania (ograniczone przysłoną polową) za pomocą lampy rtęciowej lub lasera o długości fali 530-550 nm. Kontynuuj rejestrację do momentu, aż kuleczka się oderwie lub zacznie przemieszczać się wraz z depolimeryzującym końcem mikrotubuli (Rysunki 4D, 4F oraz 4G).
    Uwaga 1: Można zastosować pułapkę optyczną, aby wspomóc interakcję między ścianą mikrotubuli a kuleczką pokrytą białkiem. Jest to szczególnie przydatne podczas pracy z kuleczkami pokrytymi silnikami kinezynowymi (Rysunki 4E-G). Postępuj zgodnie z powyższymi protokołami, ale uzupełnij bufor ruchowy o 2 mM Mg-ATP. W kroku 8.3 przechwyć swobodnie pływającą kuleczkę wiązką lasera 1 064 nm, a następnie przesuń stolik, aby zbliżyć uwięzioną kuleczkę do odcinkowej ściany mikrotubuli. Rozpocznij obrazowanie przy słabym świetle DIC i poprzez kostkę filtracyjną Rodaminy, a następnie poczekaj, aż kuleczka zacznie poruszać się w stronę zablokowanego końca mikrotubuli. Po zaobserwowaniu ukierunkowanego ruchu kuleczki zamknij migawkę wiązki pułapkującej i otwórz migawkę oświetlenia fluorescencyjnego. Kontynuuj rejestrację do momentu, aż kuleczka się oderwie lub zacznie śledzić depolimeryzujący koniec mikrotubuli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Śledzenie białek na depolimeryzujących końcach mikrotubul. Drożdżowy komponent kinetochory Dam1 jest zdecydowanie najlepszym białkiem śledzącym końce depolimeryzujących mikrotubul14. Ten 10-podjednostkowy kompleks znakowany GFP może być łatwo ekspresowany i oczyszczany z komórek bakteryjnych18,38, dlatego zalecamy jego stosowanie jako kontroli pozytywnej w teście śledzenia końców. Białko fluorescencyjne, które śledzi depolimeryzujący koniec mikrotubuli, jest widoczne jako jasny fluo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wiele testów jednocząsteczkowych obecnie rutynowo wykorzystuje specjalnie przygotowane szkiełka nakrywkowe, aby drastycznie zmniejszyć niespecyficzne przywieranie białek. Procedura, którą tutaj opisujemy, jest modyfikacją oryginalnego protokołu opracowanego w laboratorium Howarda32 i stwierdzamy, że silanizacja szkiełek nakrywkowych jest warta wysiłku, nawet w przypadku testów perełkowych opartych na DIC, które nie wykorzystują fluorescencji. Komory wyposażone w takie szkiełka nakrywkowe wykazują znacznie czys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować F. I. Ataullakhanovowi za pomoc w projektowaniu i produkcji komór przepływowych wielokrotnego użytku, N. Daszkiewiczowi, N. Gudimczukowi i A. Korbalewowi za dostarczenie zdjęć do rysunków, N. Gudimchukowi i P. Zacharowowi za opracowanie protokołu i dostarczenie odczynników do przygotowania nasion mikrotubul znakowanych digoksygeniną, A. Potapenko za pomoc w edycji tekstu oraz innym członkom laboratorium Griszczuk za wskazówki i dyskusje. Praca ta była częściowo wspierana przez grant NIH GM R01-098389 oraz grant pilotażowy z Pennsylvania Muscle Institute dla E.L.G., który jest stypendystą Kimmela, przez granty RFBR 12-04-00111-a, 13-04-40190-H i 13-04-40188-H, Prezydium Rosyjskiej Akademii Nauk (Mechanizmy Integracji Systemów Molekularnych oraz programy Molekularnej i Molekularnej Biologii Komórki) dla F. I. Ataullakhanova, NIH przyznał GM R01 GM033787 J.R. McIntoshowi oraz stypendium podoktorskie Fundacji Dmitrija Zimina dla V.A.V.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tabela 1. Mikroskopia i inny sprzęt.
MicroscopeZeiss
Nikon		Axio Imager 2
Eclipse Ti		można stosować inne modele mikroskopów zdolne do obrazowania DIC i epifluorescencji
ObiektywZeiss
Nikon		420490-9900-000
CFI Apo 100x Olej 1.49		100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Grzejnik obiektywowyBioptechs150803, 150819-19
Kostka filtra fluorescencyjnegoChroma49004 lub 49008
41017 lub 49020		zoptymalizowana pod kątem fluorescencji rodaminy 
zoptymalizowany pod kątem fluorescencji GFP
Oprogramowanie do akwizycjifreeware MicroManager
Molecular Devices		nie dotyczy
MetaMorph 7.5		http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/
inne oprogramowanie może być używane do pozyskiwania obrazów i śledzenia cząstek
Kamera EMCCDAndoriXon3, DU-897E-cs0-#BVKamera EMCCD o wysokiej czułości
Laser pułapkującyIPG PhotonicsYLR-10-1064-LPLaser 1,064 nm, 10 W
Lasery fluorescencyjnewzbudzające Coherent, Inc.
Coherent, Inc.		Szafir 488 LP
Szafir 552 LP		wzbudzenie zielonych fluoroforów
wzbudzenie czerwonych fluoroforów
Myjka plazmowaHarrick PlasmaPDC-001
Komercyjne komory przepływoweWarner InstrumentsRC-20 lub RC-30
Pompa perfuzyjnaCole Palmer
Harvard Aparatura		Masterflex 77120-52
Pico Plus		Obie pompy zapewniają wymaganą szybkość przepływu cieczy, ale pompa perystaltyczna może pulsować z bardzo małą prędkością. Przepływ z pompą strzykawkową jest bardziej spójny dla szerokiego zakresu szybkości, ale ta pompa ma bezwładność.
Tabela 2. Przygotowanie komory mikroskopowej.
Zmodyfikowane szkiełka mikroskopowe do komór wielokrotnego użytkuPrecyzyjne szkła w KoloradoNiestandardowe zamówienie www.precisionglassblowing.comSzczeliny soniczne w szkiełkach na podstawie schematów w Rysunek 1
Rurka polietylenowaIntramedic427410ID 0,58 mm, OD 0,965 mm; Użyj tych rurek, aby połączyć zmontowaną komorę z pompą i pojemnikiem na odpady
Rurka polietylenowaIntramedic427400ID 0,28 mm, OD 0,61 mm; Użyj tych rurek do wykonania komory wielokrotnego użytku
Zwykłe szkiełka mikroskopoweVWR48312-003Można stosować inne podobne szkiełka
nakrywkowe VWR48393-150, 48366-067Można stosować inne podobne szkiełka nakrywkowe
Uszczelniacz silikonowyWorld Precision InstrumentsKIT, USZCZELNIACZ SILIKONOWY 5 MIN UTWARDZANIE
Klej epoksydowyLoctite83082
Klej cyjanoakrylowyScotch 3MAD114Lub klej cyjanoakrylowy innych producentów
Tabela 3. Czyszczenie i powlekanie szkiełek nakrywkowych.
Molecular Sitves, klasa 564Macron4490-04
Słoik do barwienia szkła nakrywkowegoTed Pella, Inc.21036
Ceramiczny uchwyt na szkiełko nakrywkoweThomas Scientific8542e40
PlusOne Repel SilaneGE Healthcare Biosciences17-1332-01
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
Anti-digoksygenina ABRoche Applied Science11093274910
Tabela 4. Przygotowanie nasion i segmentowanych mikrotubul.
Tubulinoczyszczona z mózgów krów
Cytoskeleton, Inc
T238P		Aby zapoznać się z protokołami oczyszczania, patrz 49– 51
Nieznakowana tubulina
Znakowana tubulinaCytoskeleton, Inc
Invitrogen
Invitrogen		TL590M
C1171 (rodamina)
A-2952 (digoksygenina)		Tubulina wieprzowa znakowana rodaminą
Tubulina może być znakowana dowolnym barwnikiem reagującym z aminami, jak w referencji52.
GMPCPPJena BiosciencesNU-405Aliquot i przechowywać w temperaturze -70 & deg; C
VALAPWazelina, lanolina i parafina w proporcji 1:1:2 masowopatrz odniesienie9
wieprzowa

Bibliografia

  1. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13, 83-117 (1997).
  2. Mitchison, T. M., Kirschner, M. W. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  3. Walker, R. A., Brien, O., et al. Dynamic Instability of Individual Microtubules Analyzed by Video Light Microscopy: Rate Constants and Transition Frequencies. J. Cell Biol. 107, 1437-1448 (1988).
  4. Gardner, M. K., Zanic, M., Gell, C., Bormuth, V., Howard, J. Depolymerizing Kinesins Kip3 and MCAK Shape Cellular Microtubule Architecture by Differential Control of Catastrophe. Cell. 147 (5), 1092-1103 (2011).
  5. Lombillo, V. A., Stewart, R. J., McIntosh, J. R. Minus-end-directed motion of kinesin-coated microspheres driven by microtubule depolymerization. Nature. 373, 161-164 (1995).
  6. Franck, A. D., Powers, A. F., Gestaut, D. R., Gonen, T., Davis, T. N., Asbury, C. L. Tension applied through the Dam1 complex promotes microtubule elongation providing a direct mechanism for length control in mitosis. Nat. Cell Biol. 9 (7), 832-837 (2007).
  7. Tran, P. T., Walker, R. A., Salmon, E. D. A metastable intermediate state of microtubule dynamic instability that differs significantly between plus and minus ends. J. Cell Biol. 138 (1), 105-117 (1997).
  8. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438, 384-388 Forthcoming.
  9. Coue, M., Lombillo, A., Richard, J. Microtubule Depolymerization Promotes Particle and Chromosome Movement In Vitro. J. Cell Biol. 112 (6), 1165-1175 (1991).
  10. Grishchuk, E. L., Spiridonov, I. S., et al. Different assemblies of the DAM1 complex follow shortening microtubules by distinct mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (19), 6918-6923 (2008).
  11. Asbury, C. L., Gestaut, D. R., Powers, A. F., Franck, A. D., Davis, T. N. The Dam1 kinetochore complex harnesses microtubule dynamics to produce force and movement. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (26), 9873-9878 (2006).
  12. Westermann, S., Wang, H. -W., Avila-Sakar, A., Drubin, D. G., Nogales, E., Barnes, G. The Dam1 kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends. Nature. 440 (7083), 565-569 (2006).
  13. Grissom, P. M., Fiedler, T., Grishchuk, E. L., Nicastro, D., West, R. R., Mcintosh, J. R. Kinesin-8 from Fission Yeast A Heterodimeric , Plus-End – directed Motor that Can Couple Microtubule Depolymerization to Cargo Movement. Mol. Biol. Cell. 20, 963-972 (2009).
  14. McIntosh, J. R., Volkov, V., Ataullakhanov, F. I., Grishchuk, E. L. Tubulin depolymerization may be an ancient biological motor. J. Sci. 123, 3425-3434 (2010).
  15. Grishchuk, E. L., McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Force generation by dynamic microtubule polymers. Compr. Biophys. 4, 93-117 (2012).
  16. Asbury, C. L., Tien, J. F., Davis, T. N. Kinetochores' gripping feat: conformational wave or biased diffusion. Trends Cell Biol. (1), 38-46 (2011).
  17. Tien, J. F., Umbreit, N. T., et al. Cooperation of the Dam1 and Ndc80 kinetochore complexes enhances microtubule coupling and is regulated by aurora B. Cell Biol. 189 (4), 713-723 (2010).
  18. Gestaut, D. R., Graczyk, B., et al. Phosphoregulation and depolymerization-driven movement of the Dam1 complex do not require ring formation. Nat. Biol. 10 (4), 407-414 (2008).
  19. Schmidt, J. C., Arthanari, H., et al. The Kinetochore-Bound Ska1 Complex Tracks Depolymerizing Microtubules and Binds to Curved Protofilaments. Dev. Cell. 23 (5), 968-980 (2012).
  20. Brouhard, G. J., Stear, J. H., et al. XMAP215 is a processive microtubule polymerase. Cell. 132 (1), 79-88 (2008).
  21. Stumpff, J., Du, Y., et al. A Tethering Mechanism Controls the Processivity and Kinetochore-Microtubule Plus-End Enrichment of the Kinesin-8 Kif18A. Mol. Cell. 43 (5), 764-775 (2011).
  22. Su, X., Qui, W., Gupta, M., Pereira-Leal, J., Reck-Peterson, S. L., Pellman, D. Mechanisms underlying the dual-mode regulation of microtubule dynamics by Kip3/kinesin-8. Mol. Cell. 43 (5), 751-763 (2011).
  23. Helenius, J., Brouhard, G., Kalaidzidis, Y., Diez, S., Howard, J. The depolymerizing kinesin MCAK uses lattice diffusion to rapidly target microtubule ends. Nature. 441 (7089), 115-119 (2006).
  24. Gudimchuk, N., Vitre, B., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nat. Cell Biol. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  25. Akhmanova, A., Steinmetz, M. Microtubule +TIPs at a glance. J. Sci. 20 (Pt 20), 3415-3419 (2010).
  26. Dixit, R., Barnett, B., Lazarus, J., Tokito, M., Goldman, Y., Holzbaur, E. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (2), 492-497 (2009).
  27. Grishchuk, E. L., Efremov, A. K., et al. The Dam1 ring binds microtubules strongly enough to be a processive as well as energy-efficient coupler for chromosome motion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (40), 15423-15428 (2008).
  28. Akiyoshi, B., Sarangapani, K. K., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  29. McIntosh, J. R., Grishchuk, E. L., et al. Fibrils Connect Microtubule Tips with Kinetochores A Mechanism to Couple Tubulin Dynamics to Chromosome Motion. Cell. 135 (2), 322-333 (2008).
  30. Powers, A. F., Franck, A. D., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  31. Umbreit, N. T., Gestaut, D. R., et al. The Ndc80 kinetochore complex directly modulates microtubule dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (40), 16113-16118 (2012).
  32. Gell, C., Bormuth, V., et al. Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods Biol. 95, 221-245 (2010).
  33. Dixit, R., Ross, J. L. Studying Plus-End Tracking at Single Molecule Resolution Using TIRF Microscopy. Methods Cell Biol. 95, 543-554 (2010).
  34. Beausang, F. J., Sun, Y., Quinlan, E. M., Forkey, N. J., Goldman, Y. Construction of Flow Chambers for Polarized Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (polTIRFM). Cold Spring Harbour Protoc. 6, 712-715 (2012).
  35. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP Hydrolysis in Microtubule Dynamics: Information from a Slowly Hydrolyzable Analogue, GMPCPP. Mol. Biol. Cell. 3, 1155-1167 (1992).
  36. Grishchuk, E. L., Ataullakhanov, F. I. In Vitro Assays to Study the Tracking of Shortening Microtubule Ends and to Measure Associated Forces. Methods Cell Biol. 95, 657-676 (2010).
  37. Gutiérrez-Medina, B., Block, S. M. Visualizing individual microtubules by bright field microscopy. Am. J. Phys. 78 (11), 1152-1159 (2010).
  38. Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., et al. Long tethers provide high-force coupling of the Dam1 ring to shortening microtubules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (19), 7708-7713 (2013).
  39. Laan, L., Pavin, N., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
  40. Myster, S. H., Knott, J. A., O'Toole, E., Porter, M. E. The Chlamydomonas Dhc1 gene encodes a dynein heavy chain subunit required for assembly of the I1 inner arm complex. Mol. Biol. Cell. 8, 607-620 (1997).
  41. Lombillo, V. A., Coue, M., McIntosh, J. R. In vitro motility assays using microtubules tethered to Tetrahymena pellicles. Methods Cell Biol. 39, 149-165 (1993).
  42. Hyman, A., Chrétien, D., Arnal, I., Wade, R. Structural changes accompanying GTP hydrolysis in microtubules: information from a slowly hydrolyzable analogue guanylyl-(alpha,beta)-methylene-diphosphonate. J. Cell Biol. 128 (1-2), 117-125 (1995).
  43. Park, M., Kim, H., Kim, D., Song, N. W. Counting the Number of Fluorophores Labeled in Biomolecules by Observing the Fluorescence-Intensity Transient of a Single Molecule. Bull. Chem. Soc. Jap. 78, 1612-1618 (2005).
  44. Welburn, J. P. I., Grishchuk, E. L., Backer, C. B., Wilson-Kubalek, E. M., Yates, J. R., Cheeseman, I. M. The human kinetochore Ska1 complex facilitates microtubule depolymerization-coupled motility. Dev. Cell. 16 (3), 374-385 (2009).
  45. Efremov, A., Grishchuk, E. L., Mcintosh, J. R., Ataullakhanov, F. I. In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (48), 19017-19022 (2007).
  46. Itoh, T., Hisanaga, S., Hosoi, T., Kishimoto, T., Hotani, H. Phosphorylation states of microtubule-associated protein 2 (MAP2) determine the regulatory role of MAP2 in microtubule dynamics. Biochemistry. 36 (41), 12574-12582 (1997).
  47. Oguchi, Y., Uchimura, S., Ohki, T., Mikhailenko, S. V., Ishiwata, S. The bidirectional depolymerizer MCAK generates force by disassembling both microtubule ends. Nat. Biol. (6), 1-8 (2011).
  48. Kishino, A., Yanagida, T. Force measurements by micromanipulation of a single actin filament by glass needles. Nature. 334, 74-76 (1988).
  49. Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro. Ann. NY Acad. Sci. 253, 107-132 (1975).
  50. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S., Kirschner, M. W. A Protein Factor Essential for Microtubule Assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  51. Widlund, P. O., Podolski, M., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Mol. Biol. Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  52. Hyman, A., Drechsel, D., et al. Preparation of Modified Tubulins. Methods Enzymol. 196, 478-485 (1991).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Depolimeryzacja mikrotubulkapsułki fotoablacyjnemontaż komory przepływowejanaliza śledzenia końcówbiałka znakowane GFPkoraliki pokryte białkiemperfuzja buforem do analizy ruchliwościmonitorowanie optyką DICpomiar intensywności fluorescencji
Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.