Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Podsumowanie

Mikrotubule są z natury niestabilnymi polimerami, a ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące segmentowane mikrotubule z fotoablakowalnymi czapeczkami stabilizującymi. Depolimeryzacja segmentowanych mikrotubul może być wyzwalana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób analizę ruchów z demontującymi końcami mikrotubul.

Streszczenie

Depolimeryzacja mikrotubul może dostarczyć siły do transportu różnych kompleksów białkowych i kulek pokrytych białkiem in vitro. Uważa się, że mechanizmy leżące u podstaw odgrywają istotną rolę w ruchach chromosomów zależnych od mikrotubul podczas podziału komórki, ale odpowiednie białka i ich dokładne role są słabo zdefiniowane. W związku z tym istnieje rosnąca potrzeba opracowania testów do badania takiej ruchliwości in vitro przy użyciu oczyszczonych składników i określonego środowiska biochemicznego. Mikrotubule są jednak z natury niestabilnymi polimerami; Ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Protokoły, które tutaj opisujemy, wykorzystują segmentowane mikrotubule, które są wykonane z fotoablakowalnych czapek stabilizujących. Depolimeryzacja takich segmentowanych mikrotubul może być wywołana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób badania ruchliwości na demontujących się końcach mikrotubul. Technika ta może być wykorzystana do przeprowadzenia analizy ilościowej liczby cząsteczek w znakowanych fluorescencyjnie kompleksach białkowych, które poruszają się procesowo wraz z dynamicznymi końcami mikrotubul. Aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu w tym i innych ilościowych testach fluorescencyjnych, szkiełka nakrywkowe powinny być poddawane obróbce w celu zmniejszenia niespecyficznej absorpcji rozpuszczalnych białek znakowanych fluorescencyjnie. Przedstawiono szczegółowe protokoły uwzględniające nierówności oświetlenia fluorescencyjnego i określające intensywność pojedynczego fluoroforu przy użyciu równoodległego dopasowania Gaussa. Na koniec opisujemy zastosowanie segmentowanych mikrotubul do badania zależnych od mikrotubul ruchów mikrokulek pokrytych białkiem, dostarczając wglądu w zdolność różnych białek motorycznych i niemotorycznych do łączenia depolimeryzacji mikrotubul z procesowym ruchem ładunku.

Wprowadzenie

Mikrotubule są wysoce konserwatywnymi strukturami cytoszkieletu, które są ważne dla architektury komórkowej, ruchliwości komórek, podziału komórek i transportu wewnątrzkomórkowego¹. Te dynamiczne polimery łączą się z tubuliny w obecności GTP i spontanicznie przełączają się między wzrostem a skracaniem². Mikrotubule są bardzo cienkie (tylko 25 nm średnicy), dlatego do obserwacji mikrotubul za pomocą mikroskopu świetlnego należy stosować specjalne techniki optyczne w celu zwiększenia kontrastu. Wcześniejsze prace z tymi polimerami badały ich zachowanie dynamiczne przy użyciu różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC)³. To i podobne badania in vitro wykazały, że w typowych warunkach eksperymentalnych mikrotubule ulegają katastrofie i przechodzą na depolimeryzację tylko rzadko, raz na 5-15 minut (częstotliwość ta dotyczy stężenia rozpuszczalnej tubuliny 7-15 mM badanego w temperaturze 28-32 °C)⁴. W związku z tym zaproponowano różne techniki indukcji depolimeryzacji mikrotubul w kontrolowany sposób. Skracanie mikrotubul można wywołać przez wypłukanie rozpuszczalnej tubuliny^5,6, przecięcie mikrotubul wiązką lasera⁷ lub użycie mikrotubul podzielonych na segmenty⁸, jak opisano tutaj. Wcześniejsze prace z wykorzystaniem segmentowanych mikrotubul, a także stochastycznie przełączających się polimerów, wykazały, że małe ładunki wewnątrzkomórkowe, takie jak chromosomy, pęcherzyki i kulki pokryte białkiem, mogą poruszać się na końcach skracających się mikrotubul^9-13. Uważa się, że zjawisko to ma bezpośredni wpływ na ruchy chromosomów w komórkach mitotycznych, a mechanizmy leżące u jego podstaw są obecnie aktywnie badane^14-16.

Ostatnio techniki oparte na fluorescencji, w tym mikroskopia całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF), zostały wykorzystane do badania ruchliwości z dynamicznymi końcami mikrotubul^17-24. Zaletą tego podejścia jest to, że umożliwia badanie interakcji między mikrotubulami a białkami wiążącymi mikrotubule w czasie rzeczywistym przy użyciu białek znakowanych różnymi fluoroforami. Stwierdzono, że kilka kompleksów białkowych porusza się procesowo z wydłużającymi się i/lub skracającymi końcami mikrotubul. Należą do nich białka związane z mikrotubulami Dam1^10,12,18, Ska1¹⁹ i XMAP215²⁰, a także silniki kinezynowe Kif18A^21,22, MCAK²³ i CENP-E²⁴. Białka te wykazują procesywne śledzenie końcówek, które zasadniczo różnią się od klasycznych białek śledzących końcówki, takich jak EB1²⁵. Chociaż cząsteczki EB1 i związani z nimi partnerzy wydają się być stabilnie związani z dynamicznymi końcami mikrotubul, poszczególne cząsteczki pozostają związane z końcówką mikrotubuli tylko przez ~ 0,8 sekundy, szybko wymieniając się z rozpuszczalną pulą²⁶. W przeciwieństwie do tego, procesywne urządzenia śledzące końcówki, takie jak Dam1, poruszają się z końcami mikrotubul na wiele mikronów, a ich związek z końcówkami mikrotubul może trwać przez wiele sekund. Czas asocjacji końcówki, a także wynikająca z niego szybkość śledzenia, zależy w dużym stopniu od liczby cząsteczek tworzących kompleks śledzący końcówkę²⁷. Większe zespoły białkowe są zwykle znacznie lepszymi tropicielami końcówek. Na przykład tak złożone zespoły, jak izolowane kinetochory drożdży, mogą pozostawać sprzężone z końcami mikrotubul przez²⁸ godzin. Stwierdzono, że niektóre białka wiążące mikrotubule, np. kompleks białkowy kinetochorowy Ndc80, nie są w stanie śledzić końców mikrotubul na poziomie pojedynczej cząsteczki, jednak Ndc80 jest bardzo skuteczny w sprzęganiu ruchu ładunku kulkowego^19,29-31. Dlatego, aby zrozumieć mechanizm śledzenia końcówek przez różne kompleksy białkowe, a także ich role biologiczne, ważne jest zbadanie śledzenia końcówek jako funkcji liczby cząsteczek w kompleksie śledzenia końcówek, a także określenie zdolności tych kompleksów do wykazywania zbiorowej ruchliwości na powierzchni ładunku perełek.

Poniżej przedstawiamy szczegółowe protokoły przygotowania i przeprowadzenia eksperymentów z segmentowanymi mikrotubulami (Rysunek 1A). Po pierwsze, dostępne na rynku szkiełka szklane są modyfikowane w celu mocowania krótkich rurek z polietylenu (Protokół 1). Komora przepływowa mikroskopii wielokrotnego użytku jest następnie składana z takiego szkiełka oraz chemicznie lub plazmowo oczyszczonego i silanizowanego szkiełka nakrywkowego (protokół 2)^32-34. Uzyskana objętość komory wynosi tylko 20-25 μl (lub tak mała jak 15 μl, patrz uwaga 3 w protokole 1), wliczając w to objętość rurki doprowadzającej. Można również stosować dostępne na rynku komory przepływowe, ale ich objętość jest zwykle większa, co prowadzi do niepotrzebnego marnotrawstwa białek. W przypadku zastosowania większej komory, objętość wszystkich roztworów w poniższych protokołach powinna być skalowana proporcjonalnie. Nasiona mikrotubul są następnie przygotowywane, na przykład przy użyciu wolno hydrolizowalnego analogu GTP, GMPCPP (trifosforan guanozyno-5'-[(α,β)-metyleno]trifosforan) (protokół 3, patrz także Hyman i wsp.³⁵). Nasiona są unieruchamiane na oczyszczonym szkiełku nakrywkowym, a następnie powierzchnia jest blokowana, aby zapobiec niespecyficznemu wchłanianiu innych białek³² (protokół 4 opisuje immobilizację nasion za pomocą digoksygeniny). Segmentowane mikrotubule można następnie przygotować za pomocą protokołu 5. Głównym uzasadnieniem tego podejścia jest to, że dynamiczne polimery mikrotubul, które tworzą się w obecności GTP, mogą być tymczasowo stabilizowane przez dodanie krótkich "czapeczek" stabilnych segmentów tubuliny, które zawierają GMPCPP. Kapturki te zawierają również tubulinę znakowaną rodaminą, dzięki czemu można je usunąć po prostu oświetlając pole widzenia laserem o długości fali 530-550 nm lub lampą łukową rtęciową (Protokół 6)³⁶. Intensywność fluorescencji sygnału śledzenia końcówki może być następnie wykorzystana do oszacowania liczby cząsteczek, które przemieszczają się wraz z demontującymi się końcami mikrotubul, biorąc pod uwagę nierówności oświetlenia pola mikroskopowego (Protokół 7). Podobne podejście można zastosować do badania interakcji między mikrotubulami depolimeryzującymi a kulkami pokrytymi białkiem, przygotowanymi zgodnie z opisem w²⁷ (Protokół 8). Niektóre białka łatwo wiążą się ze ściankami segmentowanych mikrotubul, ale pęseta laserowa może być również używana do przytrzymywania kulki w pobliżu ściany mikrotubul, ułatwiając w ten sposób jej wiązanie.

Protokół

Wymagany sprzęt: Eksperymenty opisane poniżej wymagają mikroskopu świetlnego wyposażonego do obrazowania DIC i fluorescencji (Tabela 1). Oświetlenie LED w jasnym polu może być wykorzystane do znacznej poprawy wykrywania nasion mikrotubul³⁷ przyczepionych do szkiełka nakrywkowego, które są trudne do zaobserwowania za pomocą zwykłej lampy halogenowej. Aby kontrolować przepływ cieczy w komorach mikroskopowych, roztwory należy wymieniać na pompę perystaltyczną zdolną do prędkości przepływu od 10-100 μl/min. Można również użyć pompy strzykawkowej, ale należy zachować ostrożność, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, które mogą tworzyć się przy nagłej zmianie prędkości przepływu. W celu manipulowania kulkami pokrytymi białkiem, na przykład w celu zbliżenia ich do segmentowej ścianki mikrotubul, wiązka laserowa o długości fali ciągłej o długości fali 1,064 nm może zostać wprowadzona do osi optycznej mikroskopu i zogniskowana za pomocą obiektywu o dużej aperturze numerycznej (1,3 lub wyższej) w celu wytworzenia pułapki. Do ilościowej analizy intensywności fluorescencji pojedynczych cząsteczek światło wzbudzenia powinno być dostarczane przez źródło laserowe, ponieważ natężenie tego źródła światła jest bardziej stabilne niż natężenie generowane przez lampę rtęciową. Aby zminimalizować drgania mechaniczne, mikroskop należy umieścić na stole optycznym. Bardziej wyrafinowany sprzęt jest wymagany do badania ruchu kulek z końcami mikrotubul depolimeryzujących pod stałą siłą oraz do pomiaru sygnałów siły pojedynczego strzału^11,38,39, metody te zostaną opisane w innym miejscu.

1. Produkcja komór przepływowych wielokrotnego użytku

Szkiełka szklane do komór przepływowych wielokrotnego użytku można zamówić w lokalnym zakładzie produkcji szkła, korzystając ze schematów na rysunku 1B (szczegóły dotyczące naszego dostawcy znajdują się w Tabeli 2). Za pomocą frezowania ultradźwiękowego zmodyfikuj zwykłe szkiełka mikroskopowe (75 mm x 25 mm, grubość 1,0 mm), aby wykonać dwa rowki o długości 15±1 mm, szerokości 1,0±0,1 mm i głębokości 0,8±0,05 mm. Odległość między najbliższymi końcami powinna wynosić 14±1 mm; Odległość ta jest optymalna dla komory zmontowanej ze szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 mm x 22 mm. Tabela 2 zawiera wykaz innych materiałów.

1. Umieść rurkę polietylenową o długości 100 mm (OD 0,61 mm, tabela 2) w każdym rowku w prowadnicy, pozostawiając zwisy ~5 mm na wewnętrznych końcach rowków. Przymocuj rurki wewnątrz rowków za pomocą kleju cyjanoakrylowego, całkowicie osadzając rurki w rowkach.
2. Wypełnij rowki klejem epoksydowym, unikając rozlewania kleju do wnętrza tubek. Pozostaw klej do wyschnięcia na ~1 dzień.
3. Ostrą żyletką odetnij zestaloną masę kleju 3-4 mm od dystalnego końca każdego miejsca mocowania, usuwając części proksymalnie do środka szkiełka. Rurki powinny pozostać w swoich rowkach. Usunięcie części proksymalnych spowoduje również przecięcie i usunięcie wewnętrznych zwisów, tworząc płaską powierzchnię z dwoma otworami rurowymi.
4. Napełnij strzykawkę wodą i sprawdź, czy rurki działają prawidłowo. Jeśli ciecz płynie swobodnie, nałóż kroplę kleju epoksydowego (o średnicy ~5 mm) na zewnętrzne końce rowków, susz przez 1 dzień (rysunek 1D). Dzięki temu komory będą trwalsze, dzięki czemu będą mogły być używane wielokrotnie przez wiele miesięcy.
   Uwaga 1: Aby wykonać komorę dla mikroskopu odwróconego, szkiełka należy dodatkowo zmodyfikować tak, aby wykonać dwa małe otwory na przeciwległych końcach rowków (rysunek 1C). Włóż rurki przez otwory w suwaku, zegnij rurki i dopasuj je ciasno do rowków (Rysunek 1E). Wykonaj kroki 1.2-1.4, ale usuń klej epoksydowy z całej powierzchni, która zostanie użyta do wykonania komory przepływowej.
   Uwaga 2: Aby zmniejszyć objętość komory, należy użyć frezowania, aby wykonać dwa wgłębienia o głębokości 0,050±0,005 mm, pozostawiając środkową część szkiełka o szerokości 5,0±0,5 mm i lekko uniesioną (patrz "wytrawione obszary" na rysunkach 1B i 1C). Po zmontowaniu komory przepływowej (zgodnie z opisem poniżej) umieść taśmę dwustronną w tych wgłębieniach.
   Uwaga 3: Aby ponownie użyć tych zmodyfikowanych szkiełek, po zakończeniu eksperymentów usuń szkiełko nakrywkowe i taśmę dwustronną za pomocą żyletki. Usuń szczeliwo, odklejając je i przecierając szkiełko 70% etanolem. Umieść szkiełko w pojemniku z 1-2% laboratoryjnym detergentem do mycia naczyń, podłącz rurkę do pompy perystaltycznej i przelej 50-70 ml, następnie dodaj równą objętość wody dejonizowanej, wysusz i przechowuj w komorze bezpyłowej.

2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych

Ten protokół zajmuje 6-8 godzin i pomoże przygotować 12 szkiełek nakrywkowych. Będziesz potrzebował jednego ceramicznego uchwytu na szkiełko nakrywkowe i 3 słoików do barwienia szkiełek nakrywkowych z pokrywkami; Objętość słoika powinna wynosić 15 ml, więc każdy pomieści 4 szkiełka nakrywkowe ułożone razem. Szklany słoik z pokrywką (250 ml) powinien być używany do inkubacji szkiełek nakrywkowych z silanem. Używaj zwykłych szkiełek nakrywkowych nr 1 (22 mm x 22 mm lub 22 mm x 30 mm, lista materiałów znajduje się w tabelach 2 i 3). Wszystkie czynności należy wykonywać pod wyciągiem, w rękawiczkach.

1. Włóż szkiełka nakrywkowe do szklanych słoików do barwienia szkiełek nakrywkowych i napełnij słoiki acetonem. Inkubować przez 1 godzinę, przemyć 10x wodą dejonizowaną.
2. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 10 minut z etanolem i ponownie przemyć 10x wodą dejonizowaną.
3. Przygotuj roztwór "piranii". Wlej 60 ml roztworu nadtlenku wodoru (30% w wodzie) do żaroodpornego szklanego naczynia i powoli dodaj 100 ml kwasu siarkowego (ostateczny stosunek kwasu do roztworu nadtlenku wodoru wynosi 5:3). Roztwór się nagrzeje, jest to normalne, ale należy zachować ostrożność. Roztwór piranii jest niezwykle! Używaj grubego fartucha laboratoryjnego, rękawic i gogli!
4. Napełnij słoiki do barwienia szkiełek nakrywkowych roztworem "piranii", zamknij pokrywki i umieść słoiki w łaźni wodnej podgrzanej do 90 °C na 1 godzinę.
5. Odlej roztwór "piranii" i wyrzuć zgodnie z instrukcjami przepisów bezpieczeństwa w Twoim miejscu pracy. Szkiełka nakrywkowe umyć 10x wodą dejonizowaną.
6. Napełnij słoiki do barwienia szkiełek nakrywkowych 0,1 M KOH, inkubuj 10 minut i umyj 10x wodą dejonizowaną. To zneutralizuje wszelkie pozostałości kwasów pozostawione na szkiełkach nakrywkowych po zabiegu "pirania".
7. Suche szkiełka nakrywkowe pojedynczo, przytrzymując każde szkiełko nakrywkowe pęsetą o płaskich krawędziach pokrytą teflonem (w celu zminimalizowania uszkodzeń szklanej powierzchni) i jednocześnie wdmuchując sprężony suchy azot. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są całkowicie wysuszone, ponieważ roztwór silanu jest wysoce reaktywny z wodą.
8. Wysuszone szkiełka nakrywkowe ułóż w ceramicznych uchwytach (12 szkiełek nakrywkowych na uchwyt), które należy dokładnie wysuszyć azotem. Uchwyty ceramiczne należy przykryć, aby zapobiec przywieraniu kurzu do powierzchni szkiełka nakrywkowego.
9. Przykryj dno szklanego słoika o pojemności 250 ml (o średnicy 6 cm) sitami molekularnymi klasy 564 w celu wchłonięcia wody.
10. Napełnij słoik 200 ml roztworu PlusOne Repel Silane i powoli zanurz ceramiczny uchwyt z szkiełkami nakrywkowymi w słoiku, zamknij pokrywkę i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Spowoduje to utworzenie powłoki hydrofobowej na powierzchni szkiełka nakrywkowego.
11. Powoli wyjmij uchwyt z szkiełkami nakrywkowymi ze słoika i przenoś szkiełka nakrywkowe pojedynczo do słoików do barwienia szkiełek nakrywkowych wypełnionych metanolem.
12. Umieść metalowy lub szklany postument w zbiorniku wodnym kąpieli sonicznej, tak aby słoik do barwienia szkiełek nakrywkowych był zanurzony na 2/3 jego wysokości. Sonikować przy 70 W przez 20 minut, zmieniając roztwór metanolu co 5 minut, a następnie spłukać 10x wodą dejonizowaną. Jeśli silanizacja zadziałała prawidłowo, szkiełka nakrywkowe będą wyglądały na suche po wyjęciu z wody.
13. Dokładnie usuń resztki wody za pomocą azotu, jak powyżej.
14. Szkiełka nakrywkowe należy nakładać chusteczkami Kimwipe, aby uniknąć kontaktu powierzchni z powierzchnią między szkiełkami nakrywkowymi. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej.
    Uwaga 1: Kroki 2.1-2.6 można zastąpić, czyszcząc szkiełka nakrywkowe środkiem do czyszczenia plazmowego przez 15 minut przy 30 W, co znacznie skraca całkowity czas przygotowania. Ciśnienie wewnątrz komory czyszczącej jest ustawione na 100-200 mTorr. Można stosować zarówno tlen atmosferyczny, jak i sprężony. Ułóż oczyszczone plazmowo szkiełka nakrywkowe w ceramicznych uchwytach i przejdź do kroku 2.7.

3. Przygotowanie nasion mikrotubul stabilizowanych GMPCPP

Ta procedura zajmie ~1 godzinę, a powstałe nasiona mikrotubul są stabilne przez 1-2 dni w temperaturze pokojowej. Tabela 4 zawiera wykaz odczynników.

1. Wymieszać na lodzie:
   • 10 μl nieznakowanej tubuliny (100 μM, tabela 4) w buforze BRB-80 (80 mM rury, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl₂, pH 6,9 z KOH; uzupełnić 1-2 mM DTT przy użyciu świeżej podwielokrotności dla każdego eksperymentu).
   • 2,6 μl tubuliny znakowanej digoksygeniną (Tabela 4). Dostosuj objętość w zależności od przygotowania, tak aby ostateczny stosunek znakowanej do nieznakowanej tubuliny wynosił ~1:10. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.
   • 1,4 μl 10 mM GMPCPP (stężenie końcowe 1 mM)
2. Inkubować 15 minut w temperaturze 35 °C, nasiona osiągną długość 2-3 μm. Dostosuj czas, jeśli pożądana jest inna długość mikrotubul.
3. Dodać 35 μl BRB-80 (podgrzanego do 35 °C), wymieszać pipetując i wirować przez 15 minut przy 25 000 x g, aby granulować nasiona w temperaturze pokojowej.
4. Odrzucić supernatant, umyć osad, delikatnie dodając i usuwając 50 μl ciepłego BRB-80.
5. Ponownie zawiesić pelet w 25 μl BRB-80.

4. Przyczepianie nasion mikrotubul do szkiełek nakrywkowych

Protokoły 4 i 5 wymagają 2-3 godzin, więc używane są dwie komory przepływu dziennie.

1. Zamontuj komorę przepływową zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą silanizowanych szkiełek nakrywkowych i przejdź do kroku 4.2. Jeśli używasz szkiełek nakrywkowych wykonanych na zamówienie (Protokół 1), postępuj zgodnie z poniższymi krokami.
   1. Przymocuj dwa kawałki taśmy dwustronnej (5 mm x 30 mm) wzdłuż środkowego obszaru o szerokości ~5 mm, połóż silanizowane szkiełko nakrywkowe na taśmie, mocno dociśnij.
   2. Napełnij komorę BRB-80 przez jedną z probówek i zatkaj obie rurki okrągłymi wykałaczkami.
   3. Wyciśnij małą kroplę dwukolorowego uszczelniacza Kwik Cast na małą plastikową szalkę Petriego i szybko, ale dokładnie wymieszaj za pomocą wykałaczki. Szczeliwo zmieni kolor na zielony; Nałożyć natychmiast, ostrożnie uszczelniając wszystkie krawędzie szkiełka nakrywkowego. Jeśli szczeliwo wnika zbyt głęboko pod szkiełko nakrywkowe, otwórz jedną z rurek, wyjmując zatyczkę wykałaczki i delikatnie dociśnij, aby zapobiec wyciekaniu szczeliwa do wnętrza rurek.
   4. Pozostaw komorę do wyschnięcia na 10 minut i upewnij się, że przepływ nie jest ograniczony przed kontynuowaniem.
2. Umieścić komorę na stoliku mikroskopowym podgrzanym do temperatury 32 °C i podłączyć jedną z rurek do pompy, która wypompuje ciecz. Długość rurki wlotowej powinna być zminimalizowana, aby uniknąć niepotrzebnych strat odczynników: zalecana długość to 5-7 cm. Zanurzyć ten koniec w fiolce o pojemności 0,5 ml z buforem BRB-80. To i wszystkie poniższe roztwory należy wstępnie podgrzać do 32-35 °C.
3. Delikatnie dociśnij pompą lub po prostu podnieś koniec rurki wylotowej, aby wycisnąć pęcherzyki powietrza, które mogą tworzyć się od czasu do czasu po wyjęciu korka rurki wlotowej.
4. Ustawić szybkość pompy na 100 μl/min. Przemyć 2 objętościami komory przeciwciał anty-digoksygeninowych rozcieńczonych w stosunku 1:30 w BRB-80, inkubować 15 minut, aby umożliwić adsorpcję przeciwciał.
5. Przemyć 5-10 objętościami komory ciepłego BRB-80, inkubować 10 minut z 1% Pluronic F-127 w BRB-80, aby zablokować hydrofobową powierzchnię silanizowanego szkiełka nakrywkowego.
6. Przemyć 5-10 objętościami komory buforu ruchliwości (BRB-80 uzupełniony 0,4 mg/ml kazeiny).
7. Zmniejsz prędkość pompy do 10 μl/min i perflanduj nasiona mikrotubul rozcieńczone w stosunku 1:200-1:600 w buforze o ruchliwości 30-40 μl. Inkubować przez 15 minut, aby ułatwić wiązanie nasion z przeciwciałami zaadsorbowanymi przez szkiełko nakrywkowe.
8. Przemyć komorę z prędkością 100 μl/min 400 μl buforu do pomiaru ruchliwości, aby usunąć niezwiązany materiał.
   Uwaga 1: Uzyskana gęstość nasion powinna wynosić 10-30 na pole mikroskopu (rysunek 2A). Aby rozwiązać problem, użyj fluorescencyjnie znakowanej tubuliny podczas polimeryzacji (krok 3.1), aby ułatwić wykrywanie nasion przyczepionych do szkiełka nakrywkowego.
   Uwaga 2: Aksonemy przygotowane z Chlamydomonas⁴⁰ lub innych źródeł biologicznych, jak również błonki lizowanych i zdecylitowanych komórek Tetrahymena⁴¹ mogą być również stosowane jako nukleatory mikrotubul. Te nukleatory są przydatne do tworzenia małych układów mikrotubul i są preferowane, gdy pożądane są mikrotubule o określonej liczbie protofilamentów (nasiona GMPCPP zarodkują jedną mikrotubulę, która zawiera ≥14 protofilamentów⁴²). Struktury te mogą być przyłączone do oczyszczonych szkiełek nakrywkowych poprzez absorpcję niespecyficzną, ale nasadka jest zwykle mniej stabilna w porównaniu z mocowaniem opartym na przeciwciałach, zwłaszcza w przypadku stosowania silanizowanych szkiełek nakrywkowych.

5. Przygotowanie segmentowanych mikrotubul

Wszystkie poniższe objętości roztworu dotyczą objętości komory 15-20 μl; zwiększają się proporcjonalnie, jeśli używana jest większa komora.

1. Wstępnie ogrzać nieznakowaną mieszaninę tubuliny (45 μl buforu ruchliwości uzupełnionego 1 mM Mg-GTP i 10-15 μM nieznakowanej tubuliny) przez 30 sekund w temperaturze 35 °C. Perfuzja w temperaturze 30 μl/min.
2. Monitoruj wzrost mikrotubul za pomocą optyki DIC (Rysunek 2B, Wideo 1). Podczas 5-7 minutowej inkubacji mikrotubule zwykle osiągają długość ~10 μm.
3. Przygotować mieszaninę rodaminy i tubuliny (65 μl buforu ruchliwości uzupełnionego 0,5 mM GMPCPP i 2-5 μM tubuliny znakowanej rodaminą o stosunku molowym rodaminy do tubuliny 0,5-1) i ogrzewać roztwór w temperaturze 35 °C przez 30 sekund.
4. Natychmiast przeprowadzić fuzję z prędkością 30 μl/min. Inkubować przez 8-10 minut, aby ułatwić tworzenie stabilnych czapeczek fluorescencyjnych na końcach mikrotubul. Stabilne segmenty mikrotubul będą również zarodkować spontanicznie i będą widoczne dla optyki DIC.
5. Dobrze umyć komorę 100 μl buforu ruchliwości o stężeniu 20 μl/min w celu usunięcia tubuliny i nukleotydów, a także rozpuszczalnych fragmentów mikrotubul.
6. Za pomocą DIC upewnij się, że mikrotubule są widoczne (ryc. 2D); ich liczba powinna się jednak zmniejszyć, ponieważ wiele mikrotubul rozpada się podczas zamykania (film 2 pokazuje typowe pole z segmentowanymi mikrotubulami).
   Uwaga 1: Mikrotubule segmentowe są bardzo stabilne i mogą być używane przez co najmniej 2 godziny. Jednak żywotność tych mikrotubul zmniejsza się wraz z nadmierną wymianą roztworu lub jeśli w buforze obrazowania stosuje się 2-merkaptoetanol.

6. Eksperymentalna obserwacja śledzenia białek za pomocą depolimeryzujących końców mikrotubul

1. Wprowadzić do komory 30-50 μl białka fluorescencyjnego (0,1-20 nM) z prędkością 10 μl/min. Jeśli białko przykleja się do szkiełka nakrywkowego, należy uzupełnić bufor ruchliwości o 4-8 mg/ml BSA. Śledzenie końcówek Alexa488-DAM1 wymaga dodatkowo 10 mM DTT lub 0,5-1% βME¹⁰.
2. Ogranicz pole oświetlenia za pomocą membrany pola mikroskopu, aby uniknąć niepotrzebnego wybielania i demontażu mikrotubul.
3. Rozpocznij akwizycję wideo za pomocą kostki filtra GFP, a następnie przełącz się na kostkę filtra rodaminy bez przerywania nagrywania obrazu. Czerwone segmenty na końcach mikrotubul powinny być wyraźnie widoczne; zaczną szybko zanikać i rozpadać się (Wideo 3).
4. Kontynuuj oświetlenie, aż kapelusze prawie znikną (zwykle na 10-20 sekund, ale ten czas będzie dłuższy w przypadku czapek wyhodowanych z niższym współczynnikiem znakowania rodaminy) i przełącz się z powrotem na kanał GFP, aby zarejestrować śledzenie białka z demontażem mikrotubul.
5. Analizuj powstałe sekwencje, konstruując kimografy, tj. dwuwymiarowe obrazy, które pokazują intensywność fluorescencji wzdłuż osi mikrotubul przez różne czasy obserwacji) za pomocą MetaMorph, ogólnodostępnego ImageJ lub innego oprogramowania do przetwarzania obrazu (Rysunek 2E).
   Uwaga 1: Szybkość akwizycji powinna być dostosowywana w zależności od czasu obserwowanych zdarzeń. Zalecana szybkość to 2-3 klatki na sekundę (fps) dla wolno poruszających się kompleksów Dam1 o wielkości pierścienia²⁷, ale czas akwizycji dla pojedynczych cząsteczek powinien wynosić >20 kl./s¹⁹,
   Uwaga 2: Wysoce czuły EMCCD, >np. ANDOR iXon3, jest wymagany do szybkiego rejestrowania zdarzeń śledzenia końcówek za pomocą mikrotubul depolimeryzujących. Zalecane ustawienia dla kamery Andor iXon3 to: wzmocnienie 5x, wzmocnienie EM 200, prędkość odczytu 1 MHz, 16-bitowy tryb czujnika, czas naświetlania 80 ms.
   Uwaga 3: Zastosowanie mikroskopii TIRF poprawi stosunek sygnału do szumu, jednak należy stosować krótsze mikrotubule, tak aby fluorescencyjne czapeczki stabilizujące pozostawały w zasięgu pola ulotnego.

7. Analiza ilościowa wielkości molekularnej kompleksów śledzących końcówki mikrotubul

Uzasadnieniem dla tego podejścia jest określenie liczby cząsteczek w kompleksie śledzącym końcówki poprzez znalezienie stosunku całkowitej intensywności fluorescencji kompleksu śledzącego końcówkę do intensywności pojedynczego fluoroforu. Podejście to można zastosować do fuzji białek GFP i białek znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi, ale może ono zaniżać liczbę cząsteczek w kompleksach śledzących końcówki, jeśli niektóre cząsteczki białka w preparatach nie są fluorescencyjne.

1. Rejestruj kinetykę fotowybielania dla znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek białka.
   1. Zmontuj zwykłą komorę mikroskopową za pomocą niemodyfikowanego szkiełka podstawowego, dwóch pasków taśmy dwustronnej i czystego szkiełka nakrywkowego, które można przygotować przy użyciu całego Protokołu 2 lub tylko kroków 2.1-2.6 tego protokołu.
   2. Dodać około 50 nM białka do buforu ruchliwości, przemyć krótko buforem do pomiaru ruchliwości i uszczelnić komorę VALAP (Tabela 4). Zoptymalizuj stężenie białka, aby uzyskać pole z równomiernie rozproszonymi plamkami (ryc. 3A), reprezentującymi pojedyncze cząsteczki i ich małe agregaty (trimery i tetramery, które mogą tworzyć się spontanicznie w roztworze lub mogą pojawić się, gdy kilka pojedynczych cząsteczek znajduje się blisko siebie i nie można ich rozwiązać). Ten krok jest bardzo ważny dla uzyskania wieloszczytowego rozkładu etapów fotowybielania i dokładnego określenia wielkości kroku (patrz poniżej).
   3. Zminimalizuj intensywność oświetlenia lasera, przy którym poszczególne plamki fluorescencyjne są nadal widoczne; przy niższym oświetleniu czas fotowybielania wydłuża się, dzięki czemu można uzyskać dłuższe ślady fotowybielania. Zminimalizuj również czas ekspozycji, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wybielania więcej niż jednym fluoroforem podczas jednej klatki. Zalecane ustawienie dla kamery Andor iXon3: wzmocnienie 5,0x, wzmocnienie EM 999, prędkość odczytu 10 MHz, czas naświetlania 50-100 ms.
   4. Ustaw ostrość na powierzchni szkiełka nakrywkowego, zamknij migawkę oświetleniową, przejdź do nowego pola, otwórz migawkę iluminacyjną i uzyskuj obrazy, aż wszystkie kompleksy wybielą się (odtąd określane jako img(x,y)).
2. Skoryguj uzyskane obrazy pod kątem nierówności oświetlenia (Rysunek 3B).
   1. Przygotować roztwór dowolnego fluoroforu, np. 1 μM izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) w BRB-80. Taki roztwór można przygotować z wyprzedzeniem, porcjować i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   2. Zmontować komorę jak w sekcji 7.1.1, ale użyć zwykłego szkiełka nakrywkowego. Dodać roztwór fluoroforu i uszczelnić komorę za pomocą VALAP.
   3. Zbierz >50 obrazów całego pola mikroskopu: przesuń stolik do nowego, niewybielonego obszaru, gdy migawka oświetleniowa jest zamknięta, i uzyskaj obrazy natychmiast po otwarciu migawki.
   4. Utwórz średnią projekcję tego stosu i przefiltruj za pomocą rozmycia gaussowskiego o promieniu 5 pikseli za pomocą ImageJ lub innego oprogramowania (Rysunek 3C). Otrzymany obraz przedstawia rozkład natężenia oświetlenia pola (Illum(x,y), gdzie x i y odpowiadają współrzędnym piksela).
   5. Określ maksymalną jasność pikseli tego obrazu (Max(Illum)).
   6. Przy zamkniętej przesłonie oświetleniowej i przy użyciu tych samych ustawień kamery, co w rozdziale 7.2.3, należy uzyskać jeden obraz, określić średnią intensywność pikseli tego obrazu; wartość ta odpowiada CN, szumowi kamery.
   7. Użyj powyższych wartości i obrazu (Illum(x,y)), aby znormalizować obraz eksperymentalny (img(x,y)) przy użyciu następującego wyrażenia:
      
      Uzyskany obraz img^norm(x,y) można wykorzystać do ilościowej analizy jasności stacjonarnych kompleksów fluorescencyjnych, a także do normalizacji obrazów za pomocą kompleksów typu tip-tacking (ryc. 3D).
3. Określ intensywność pojedynczego fluoroforu.
   1. Korzystając ze znormalizowanych obrazów, img^norm(x,y) i dowolnego oprogramowania do przetwarzania obrazu, wybierz plamkę fluorescencyjną z okrągłym obszarem (o średnicy 5-6 pikseli) i określ jej integralną intensywność dla wszystkich klatek, generując ślady fotowybielania. Unikaj bardzo jasnych kropek (> 5-krotnie jaśniejszych niż ciemniejsze).
   2. Korzystając z tego samego narzędzia obszaru kołowego, wybierz co najmniej 3 obszary wolne od plam, wygeneruj odpowiednie ślady fotowybielania, uśrednij i dopasuj do funkcji rozkładu wykładniczego.
   3. Sporządź tę krzywą intensywności tła w tabeli, aby dopasować ją do eksperymentalnych punktów czasowych i odejmij ją od krzywych fotowybielania.
   4. Wygładź krzywe fotowybielania (średnia z przesuwnym oknem 3-5 punktów). Sprawdź wzrokowo powstałe krzywe i odrzuć wszelkie krzywe, które wykazują nagły wzrost fluorescencji lub brak widocznego wybielania (Rysunek 3E).
   5. Dla każdej z pozostałych krzywych (zwykle 50-70% całkowitej liczby krzywych) wizualnie wybierz końcowy płaskowyż, gdy plamka fluorescencyjna wybieli. Skróć ten segment, aby zostawić tylko ~100 punktów i uśrednić te intensywności. Odejmij tę wartość od skróconej krzywej fotobielenia, aby zminimalizować niewielkie różnice w poziomach tła i zmniejszyć rozmiar piku tła (poniżej).
   6. Narysuj histogram intensywności dla wszystkich punktów czasowych z 20 lub więcej krzywych fotowybielania (>1,000 punktów czasowych). Histogram powinien wykazywać co najmniej 4 wyraźne piki (zob. uwaga 2).
   7. Dopasuj histogram do równoodległego rozkładu Gaussa^10,43 za pomocą MATLAB, Mathematica lub podobnego oprogramowania (Rysunek 3F):
      
      gdzie A_i i σ_{i ,} d i N są parametrami dopasowania. Parametry A_i σ_{i i i} odpowiadają amplitudzie i szerokości i-tego piku; d oznacza odległość między szczytami; N jest liczbą całkowitą, która odpowiada całkowitej liczbie pików w rozkładzie. Jeśli środki pierwszych 3 lub więcej pików wykazują wizualnie dobre dopasowanie do dopasowanej linii, odległość między tymi pikami (parametr d) odpowiada intensywności fluorescencji pojedynczego fluoroforu.
      Uwaga 1: Liczba badanych punktów (sekcja 7.3.6) powinna być zwiększona, jeśli system mikroskopowy wykazuje znaczne drgania lub istnieje inne źródło hałasu (np. niestabilna wiązka laserowa).
      Uwaga 2: Niezbędne jest uzyskanie >3 pików w celu dokładnej analizy z równoodległym dopasowaniem Gaussa. Jeśli uzyska się mniej pików, fałszywy (np. podwójny) rozmiar kroku można uzyskać, gdy warunki oświetlenia nie są optymalne, np. gdy kropki bledną zbyt szybko, a pojedyncze kroki nie są dobrze rozdzielone.
4. Określ rozmiar molekularny kompleksu śledzącego końcówkę.
   1. Użyj zdjęć zebranych za pomocą Protokołu 6 i wybierz pierwsze 2-4 klatki, które zostały zarejestrowane natychmiast po otwarciu migawki. Jeśli pole było oświetlone przez jakiś czas przed zaobserwowaniem śledzenia końcówki, oszacuj pierwotną intensywność na podstawie kinetyki fotowybielania w tych samych warunkach eksperymentalnych.
   2. Uśrednij wybrane klatki i znormalizuj wynikowy obraz, jak w sekcjach 7.2.5-7.2.7.
   3. Zmierzyć natężenie całkowania kompleksu śledzenia końcówki fluorescencyjnej, używając tej samej wielkości obszaru, co w sekcji 7.3.1.
   4. Zmierzyć natężenie całkowania 3 obszarów tła znajdujących się w pobliżu kompleksu śledzenia końcówek i używając tego samego regionu, uśrednić te wartości i odjąć od intensywności kompleksu śledzenia końcówek z sekcji 7.4.3.
   5. Obliczyć liczbę cząsteczek fluoroforu w kompleksie, dzieląc intensywność fluorescencji otrzymaną w sekcji 7.4.4 przez intensywność pojedynczego fluoroforu otrzymaną w sekcji 7.3.5.
      Uwaga 1: Pożądane jest, aby ustawienia oświetlenia i akwizycji dla protokołu 7.4 były takie same jak w protokole 7.1. Jeśli podczas tych etapów dostosowano czas ekspozycji lub intensywność lasera, uzyskane wartości fluorescencji należy odpowiednio przeskalować. Dokładność takiego skalowania powinna być jednak weryfikowana poprzez obrazowanie tej samej próbki (np. czas fluorescencji) w tych różnych warunkach i obliczenie stosunku uzyskanych intensywności.

8. Śledzenie końcówek mikrotubul za pomocą kulek powlekanych białkiem

1. Przeprowadź eksperymenty z koralikami śledzącymi końcówki, uruchamiając demontaż MT, jak w protokole 6. Intensywność źródła światła DIC powinna zostać zmniejszona, aby umożliwić oglądanie fluorescencji rodaminy jednocześnie z obrazowaniem DIC.
2. Przygotuj koraliki jak w Grishchuk i wsp.¹⁰ oraz Asbury i wsp.¹¹ Wprowadzić do komory 30-50 μl zawiesiny kulek z prędkością 10 μl/min. Sugerowane stężenie ściegu to 10-16-10-17 M.
3. Jeśli używasz mikroskopu pionowego, wyjmij komorę ze stolika mikroskopu i odwróć ją na 5-10 minut, aby kulki osadzały się na szkiełku nakrywkowym. Sprzyja to lepszemu wiązaniu kulki z mikrotubulami przywiązanymi do szkiełka nakrywkowego, ale ta procedura nie jest skuteczna w przypadku kulek polistyrenowych o wielkości 0,5 μm, które wykazują niewielką sedymentację grawitacyjną w tak krótkim czasie.
4. Wybierz koralik, który jest przymocowany do mikrotubuli na uwięzi szkiełka nakrywkowego; koralik powinien poruszać się po wyraźnym łuku⁴⁴ (Rysunek 4A). Koralik na uwięzi powinien znajdować się w odległości 1-3 μm od powierzchni szkiełka nakrywkowego, która jest wyraźnie widoczna dzięki okazjonalnym koralikom przymocowanym do szkiełka nakrywkowego, które pozostają nieruchome.
5. Przełącz się na kostkę filtra Rhodamine i rozpocznij zbieranie obrazów podczas korzystania z oświetlenia DIC.
6. Otwórz migawkę, aby oświetlić pole obrazowania (ograniczone przysłoną polową) lampą rtęciową lub laserem 530-550 nm. Kontynuuj nagrywanie, aż koralik odczepi się lub przesunie wraz z demontującym końcem mikrotubuli (rysunki 4D, 4F i 4G).
   Uwaga 1: Pułapka optyczna może być stosowana do promowania interakcji między ścianą mikrotubuli a kulką pokrytą białkiem. Jest to szczególnie przydatne podczas pracy z koralikami pokrytymi silnikami kinezynowymi (rysunki 4E-G). Postępuj zgodnie z tymi samymi protokołami, co powyżej, ale uzupełnij bufor ruchliwości o 2 mM Mg-ATP. W kroku 8.3 uchwyć swobodnie pływający koralik za pomocą wiązki laserowej o długości fali 1,064 nm, przesuń stolik, aby zbliżyć uwięziony koralik do segmentowej ścianki mikrotubul. Rozpocznij obrazowanie od DIC przy słabym oświetleniu i przez kostkę filtra rodaminy i poczekaj, aż koralik zacznie iść w kierunku zamkniętego końca mikrotubul. Po zaobserwowaniu skierowanego ruchu ściegu zamknij przesłonę, aby zablokować wiązkę i otwórz migawkę, aby uzyskać oświetlenie fluorescencyjne. Kontynuuj nagrywanie, aż koralik odczepi się lub połączy z demontującym końcem mikrotubuli.

Wyniki

Śledzenie białek za pomocą depolimeryzujących końców mikrotubul. Składnik kinetochoru drożdżowego Dam1 jest zdecydowanie najlepszym trackerem końcówek mikrotubul depolimeryzujących¹⁴. Ten kompleks 10-podjednostkowy znakowany GFP może być łatwo eksprymowany i oczyszczany z komórek bakteryjnych^18,38, dlatego zalecamy stosowanie go jako kontroli pozytywnej do testu śledzenia końcówki. Białko fluorescencyjne, które podąża za depolimeryzującym końcem mikrotubuli, jest postrzegane jako ja...

Dyskusja

Wiele testów jednocząsteczkowych obecnie rutynowo wykorzystuje specjalnie przygotowane szkiełka nakrywkowe, aby drastycznie zmniejszyć niespecyficzne przywieranie białek. Procedura, którą tutaj opisujemy, jest modyfikacją oryginalnego protokołu opracowanego w laboratorium Howarda³² i stwierdzamy, że silanizacja szkiełek nakrywkowych jest warta wysiłku, nawet w przypadku testów perełkowych opartych na DIC, które nie wykorzystują fluorescencji. Komory wyposażone w takie szkiełka nakrywkowe wykazują znacznie czys...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabela 1. Mikroskopia i inny sprzęt.
Microscope	Zeiss Nikon	Axio Imager 2 Eclipse Ti	można stosować inne modele mikroskopów zdolne do obrazowania DIC i epifluorescencji
Obiektyw	Zeiss Nikon	420490-9900-000 CFI Apo 100x Olej 1.49	100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Grzejnik obiektywowy	Bioptechs	150803, 150819-19
Kostka filtra fluorescencyjnego	Chroma	49004 lub 49008 41017 lub 49020	zoptymalizowana pod kątem fluorescencji rodaminy  zoptymalizowany pod kątem fluorescencji GFP
Oprogramowanie do akwizycji	freeware MicroManager Molecular Devices	nie dotyczy MetaMorph 7.5	http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ inne oprogramowanie może być używane do pozyskiwania obrazów i śledzenia cząstek
Kamera EMCCD	Andor	iXon3, DU-897E-cs0-#BV	Kamera EMCCD o wysokiej czułości
Laser pułapkujący	IPG Photonics	YLR-10-1064-LP	Laser 1,064 nm, 10 W
Lasery fluorescencyjne	wzbudzające Coherent, Inc. Coherent, Inc.	Szafir 488 LP Szafir 552 LP	wzbudzenie zielonych fluoroforów wzbudzenie czerwonych fluoroforów
Myjka plazmowa	Harrick Plasma	PDC-001
Komercyjne komory przepływowe	Warner Instruments	RC-20 lub RC-30
Pompa perfuzyjna	Cole Palmer Harvard Aparatura	Masterflex 77120-52 Pico Plus	Obie pompy zapewniają wymaganą szybkość przepływu cieczy, ale pompa perystaltyczna może pulsować z bardzo małą prędkością. Przepływ z pompą strzykawkową jest bardziej spójny dla szerokiego zakresu szybkości, ale ta pompa ma bezwładność.
Tabela 2. Przygotowanie komory mikroskopowej.
Zmodyfikowane szkiełka mikroskopowe do komór wielokrotnego użytku	Precyzyjne szkła w Kolorado	Niestandardowe zamówienie www.precisionglassblowing.com	Szczeliny soniczne w szkiełkach na podstawie schematów w Rysunek 1
Rurka polietylenowa	Intramedic	427410	ID 0,58 mm, OD 0,965 mm; Użyj tych rurek, aby połączyć zmontowaną komorę z pompą i pojemnikiem na odpady
Rurka polietylenowa	Intramedic	427400	ID 0,28 mm, OD 0,61 mm; Użyj tych rurek do wykonania komory wielokrotnego użytku
Zwykłe szkiełka mikroskopowe	VWR	48312-003	Można stosować inne podobne szkiełka
nakrywkowe VWR		48393-150, 48366-067	Można stosować inne podobne szkiełka nakrywkowe
Uszczelniacz silikonowy	World Precision Instruments	KIT, USZCZELNIACZ SILIKONOWY 5 MIN UTWARDZANIE
Klej epoksydowy	Loctite	83082
Klej cyjanoakrylowy	Scotch 3M	AD114	Lub klej cyjanoakrylowy innych producentów
Tabela 3. Czyszczenie i powlekanie szkiełek nakrywkowych.
Molecular Sitves, klasa 564	Macron	4490-04
Słoik do barwienia szkła nakrywkowego	Ted Pella, Inc.	21036
Ceramiczny uchwyt na szkiełko nakrywkowe	Thomas Scientific	8542e40
PlusOne Repel Silane	GE Healthcare Biosciences	17-1332-01
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Anti-digoksygenina AB	Roche Applied Science	11093274910
Tabela 4. Przygotowanie nasion i segmentowanych mikrotubul.
Tubulin	oczyszczona z mózgów krów Cytoskeleton, Inc	T238P	Aby zapoznać się z protokołami oczyszczania, patrz 49– 51 Nieznakowana tubulina
Znakowana tubulina	Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen	TL590M C1171 (rodamina) A-2952 (digoksygenina)	Tubulina wieprzowa znakowana rodaminą Tubulina może być znakowana dowolnym barwnikiem reagującym z aminami, jak w referencji52.
GMPCPP	Jena Biosciences	NU-405	Aliquot i przechowywać w temperaturze -70 & deg; C
VALAP	Wazelina, lanolina i parafina w proporcji 1:1:2 masowo		patrz odniesienie9