Artykuł metodologiczny

Szybka synteza i badania przesiewowe chemicznie aktywowanych czynników transkrypcyjnych za pomocą reporterów opartych na GFP

16.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51153

⸱

26 listopada 2013

 ,  ,  , 
1The Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, 2Department of Molecular Biology, Princeton University, 3Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę szybkiej budowy sztucznych czynników transkrypcyjnych (ATF) z pokrewnymi reporterami GFP oraz ilościowe określenie zdolności ATF do stymulowania ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Biologia syntetyczna ma na celu racjonalne projektowanie i budowanie syntetycznych obwodów o pożądanych właściwościach ilościowych, a także dostarczanie narzędzi do badania struktury natywnych obwodów kontrolnych. W obu przypadkach przydatna może być możliwość zaprogramowania ekspresji genów w szybki i dostrajalny sposób, bez efektów niepożądanych. Skonstruowaliśmy szczepy drożdży zawierające promotor ACT1 przed kasetą URA3, a następnie domenę wiążącą ligand ludzkiego receptora estrogenowego i VP16. Przekształcając ten szczep za pomocą liniowego produktu PCR zawierającego domenę wiążącą DNA i selekcjonując pod kątem obecności URA3, w wyniku rekombinacji homologicznej można wygenerować sztuczny czynnik transkrypcyjny (ATF) o konstytutywnej ekspresji. ATF zaprojektowane w ten sposób mogą aktywować unikalny gen docelowy w obecności induktora, eliminując w ten sposób zarówno aktywację poza celem, jak i niefizjologiczne warunki wzrostu występujące w powszechnie stosowanych systemach warunkowej ekspresji genów. Opracowano również prostą metodę szybkiej budowy plazmidów reporterowych GFP, które reagują specyficznie na natywny lub sztuczny czynnik transkrypcyjny będący przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

Rozwój przełączników genetycznych u drożdży jest bardzo interesujący zarówno w badaniach akademickich, jak i przemysłowych. W idealnym przypadku przełączniki genetyczne mogą być używane do aktywacji określonego genu (lub zestawu genów) tylko wtedy, gdy jest to pożądane przez eksperymentatora. Sekwencja kodująca gen umieszczona za syntetycznym promotorem nie ulega ekspresji pod nieobecność cząsteczki indukującej: po dodaniu induktora gen powinien ulec szybkiej ekspresji. Dopiero niedawno wykazano, że taki przełącznik można zaprojektować u drożdży, gdzie przy braku induktora szczep wykazuje fenotyp delecji, ale w obecności induktora ekspresja jest aktywowana proporcjonalnie do poziomu induktora we wszystkich komórkach1,2. Historycznie rzecz biorąc, systemy ekspresji warunkowej u drożdży w dużym stopniu opierały się na sekwencjach DNA reagujących na składniki odżywcze, w tym promotorach MET, PHO i GAL (których aktywność jest wrażliwa na zewnątrzkomórkowe poziomy metioniny, fosforanu i galaktozy). Chociaż ekspresja warunkowa może być osiągnięta, odbywa się to kosztem znaczących efektów plejotropowych.

Receptory hormonalne, takie jak receptory ludzkiego estrogenu, okazały się skutecznymi przełącznikami u eukariontów3,4. W przypadku braku hormonu białko połączone z receptorem hormonalnym może zostać sekwestrowane w cytoplazmie, gdzie oddziałuje z kompleksem opiekuńczym Hsp90. Po związaniu odpowiedniego liganda receptor ulega zmianie konformacyjnej, powodując jego uwolnienie z kompleksu opiekuńczego Hsp90 i ujawniając sygnał lokalizacji jądrowej. Aby zaobserwować dynamikę lokalizacji określonego białka zawierającego receptor hormonalny, stworzyliśmy C-końcową fuzję Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, syntetyczny czynnik transkrypcyjny zawierający domenę wiążącą DNA Gal4p, domenę wiążącą ligand ludzkiego receptora estrogenowego i VP16) z GFP2. Lokalizację jądrową obserwowano w ciągu 8 minut po dodaniu nasyconych ilości induktora, ß-estradiolu, dla którego drożdże typu dzikiego są całkowicie obojętne. W tym czasie większość komórek ma wyraźnie widoczne aktywne miejsca transkrypcji dla docelowych genów GEV (oznaczane za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ), a także w pełni dojrzałe mRNA2,5. Ekspresja docelowych genów GEV wzrosła >2-krotnie w ciągu 2,5 minuty2,6 (mierzonej za pomocą mikromacierzy), co pokazuje, że potrzeba <2,5 minuty, aby chimeryczny aktywator przemieścił się do jądra, związał DNA i aktywował transkrypcję.

Podczas gdy kilka innych przełączników zostało zastosowanych w drożdżach, które wykorzystują różne małe cząsteczki lub leki (w tym klasyczne przełączniki oparte na doksycyklinie z Escherichia coli7,8 i przełącznikna bazie indygo 9 z Arabidopsis thaliana), żaden z nich nie osiągnął szybkości, specyficzności ani szczelności regulacji, jaką wykazują przełączniki oparte na hormonach. Warto wspomnieć, że szybkie wyłączniki zostały również opracowane u drożdży i zazwyczaj działają poprzez fuzję genu z proteazą lub ligazą ubikwityny ukierunkowaną na sekwencję2,10,11,12. Zdolność do szybkiego usuwania białka docelowego z komórki ułatwia badanie niezbędnych genów, a także genów, które są podatne na supresję genetyczną po usunięciu10.

Metody opisane w tym protokole służą do budowy i charakteryzowania syntetycznych przełączników u drożdży. Po pierwsze, pokazujemy, jak szybko generować zintegrowane genomowo białka fuzyjne składające się z domeny wiążącej DNA, domeny wiążącej ligand ludzkiego receptora estrogenowego i VP16 (DBD-EV). Zgodnie z naszym protokołem, białko fuzyjne ulega ekspresji z promotora ACT1. Następnie pokazujemy, jak stworzyć pokrewny plazmid reporterowy dla ATF i testujemy jego funkcjonalność za pomocą cytometrii przepływowej. Chociaż przewidujemy, że te plazmidy reporterowe będą używane z nowymi ATF (ryc. 1), mogą być również używane jako reportery dla natywnego aktywatora transkrypcji. Na koniec przedstawiono szczegółowe informacje dotyczące testowania wpływu aktywacji ATF na wzrost komórek na płytkach 96-dołkowych oraz inżynierii indukowalnych alleli genomowych.

Protokół

Rysunek 2 przedstawia schemat sekcji protokołu 1-3.

1. Tworzenie ATF-ów

  1. Stwórz startery do PCR amplifikujące domenę wiązania DNA, która Cię interesuje. Homologia do promotora ACT1 i receptora hormonalnego (jak opisano na rysunkach 3 i 4) jest dodawana za pomocą PCR, aby ułatwić prawidłową rekombinację do szczepu yMN15.
  2. PCR amplifikuje DBD będący przedmiotem zainteresowania przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności.
  3. Przekształć >1 μg oczyszczonego produktu PCR w drożdże metodąoctanu litu 13.
  4. Po transformacji obracaj komórki z maksymalną prędkością przez 15 sekund w mikrowirówce i usuń mieszankę transformacyjną.
  5. Zawiesić w ~200 μl sterylnej wody i płytce na YPD.
  6. Następnego dnia replika talerza z YPD na płytkach 5-FOA (płytki 5-FOA są wykonane zgodnie z opisem w Podręczniku drożdży Cold Spring Harbor)13.
  7. Pozwól rosnąć przez 2-4 dni i umieść co najmniej 5-10 kolonii na YPD. Wykonaj PCR kolonii przy użyciu starterów z Tabeli 1 i sekwencji w celu sprawdzenia włączenia.

2. Stworzenie ATF Plasmid Reporter

  1. Określ miejsce wiązania ATF (najprawdopodobniej pochodzące z literatury).
  2. Uporządkuj żądany region wiązania jako oligonukleotydy (lub ultramery, jeśli to konieczne). Proszę zamawiać jako pasmo górne i dolne z prawidłowymi zwisami dla NotI i XbaI, jak pokazano w tabeli 2.
  3. Rozcieńczyć oligonukleotyde do stężeń równomolowych (100 μM).
  4. Fosforylować za pomocą kinazy polinukleotydowej T4, a następnie wyżarzać w termocyklerze. Warunki reakcji przedstawiono w tabeli 3.
  5. Trawić ~1-2 μg pMN8 za pomocą NotI-HF i XbaI przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (warunki reakcji w tabeli 4).
  6. Żel oczyszcza pasmo kręgosłupa.
  7. Rozcieńczyć oczyszczony szkielet do 10 ng/μl.
  8. Rozcieńczyć dwuniciowe, ufosforylowane miejsce wiązania do 5-krotności stężenia molowego szkieletu na μl.
  9. Za pomocą ligazy DNA T4 podwiązywać miejsca wiązania do strawionego szkieletu w temperaturze pokojowej przez 30 minut (Tabela 5).
  10. W celu przemiany należy dodać połowę reakcji ligacji do 50 μl standardowych, chemicznie kompetentnych Escherichia coli, takich jak XL1-Blue lub DH5-Alpha.
  11. Ogniwa szoku termicznego przez 45 sekund w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C, a następnie umieścić na lodzie na 2 minuty.
  12. Dodać 900 μl pożywki SOC do reakcji przemiany.
  13. Rosnąć w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę na bębnie rolkowym.
  14. Rozprowadzić 100-200 μl komórek na płytce LB+AMP (100 μg/ml) i inkubować przez noc.
  15. Wyhoduj E. coli w płynie LB+AMP i zbierz plazmidowe DNA. Sekwencja zweryfikować nowy plazmid reporterowy z kolonii ligacji za pomocą startera 5'-GTACCTTATATTGAATTTTC-3'.
  16. Przekształć nowy plazmid reporterowy w szczep drożdży zawierający ATF z sekcji 1 za pomocą transformacji octanu litu.

3. Ilościowe określenie wpływu indukcji ATF na ekspresję genów za pomocą GFP Reporter

Przygotowanie próbek:

  1. Przygotować 25 mM zapasu β-estradiolu (10 ml etanolu + 0,0681 g β-estradiolu). Przechowywać w lodówce.
  2. Uprawiaj odmianę zawierającą ATF + Reporter przez noc w 5 ml SC-URA.
  3. Zaopatrzyć się w dziewięć kolb wstrząsowych o pojemności 250 ml i dodać do każdej z nich 25 ml SC-URA.
  4. Dodać 0 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM lub 10 μM β-estradiolu. Najłatwiej to zrobić, wykonując 10-krotne seryjne rozcieńczenia 25 mM zapasu β-estradiolu. Aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM β-estradiolu, dodaj 10 μl 25 mM β-estradiolu do 25 ml SC-URA.
  5. Dodać 125 μl nocnych kultur do kolb (rozcieńczenie 1:200).
  6. W przypadku 2 pozostałych kolb należy zaszczepić szczepem wytwarzającym GFP i szczepem pozbawionym GFP. Są one potrzebne do kalibracji cytometru przepływowego.
  7. Wstrząsać przy 200 obr./min w 30 °C przez 12-18 godz.
    Uwaga: Optymalny czas inkubacji określa się, określając, kiedy indukcja GFP nie zmienia się już po dodaniu β-estradiolu.
  8. Weź 500 μl każdej kultury i odwiruj w oddzielnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
  9. Zassać SC-URA.
  10. Umyć raz w 1 ml PBS+0,1% Tween-20 i aspirat.
  11. Dodać 1 ml PBS+0,1% Tween-20 i zawiesić ponownie.
  12. Dodać 1 ml PBS+0,1% Tween-20 do probówek Falcon.
  13. Dodać zawieszone komórki do probówek o pojemności 5 ml (końcowa objętość = 2 ml) (można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni).
  14. Opcjonalnie: lekko sonikować komórki, aby rozbić wszelkie zlepione komórki.
    Analiza cytometrii przepływowej: Przegląd: Fluorescencja 10 000-100 000 komórek jest zwykle analizowana na próbkę. Dane mogą być przetwarzane zarówno w FlowJo, jak i za pomocą niestandardowych skryptów w MATLAB lub R. Upewnij się, że kalibrujesz napięcie kanału GFP za pomocą kontroli dodatniej i ujemnej GFP. Po wyeksportowaniu plików FCS do przetworzenia danych można użyć skryptu, takiego jak ten na rysunku 6 wraz z funkcją fca_readfcs (http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader).
  15. Wykonaj cytometrię przepływową.
    1. Użyj rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC), aby zidentyfikować komórki drożdży.
    2. Ustaw natężenie przepływu na ~3,000 komórek/sek.
    3. Pomiar GFP (kanał FITC).
    4. Po zebraniu danych wyeksportuj plik . Pliki FCS
  16. Załaduj program MATLAB.
  17. Przesuń plik . FCS, fcs_readfcs.m i skrypt podobny do tego z rysunku 6 do tego samego folderu.
  18. Zmień bieżący katalog roboczy na folder zawierający dane i skrypty.
  19. Uruchom skrypt z rysunku 6 (uwaga: legenda została wprowadzona ręcznie w celu uzyskania tego, co pokazano na rysunku 7).

4. Ilościowe określenie wpływu indukcji ATF na wzrost komórek

  1. Z zamrożonych wywarów wytrzyj zarówno (1) szczep zawierający ATF, jak i (2) szczep pozbawiony ATF (taki jak yMN15) na oddzielnych płytkach YPD.
  2. Po 2 dniach wzrostu zaszczepić każdy szczep w oddzielnych probówkach hodowlanych zawierających 5 ml płynu YPD i hodować przez noc w temperaturze 30 °C.
  3. Wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenia 0,25 mM roztworu podstawowego β-estradiolu do 10 000 razy (0,025 μM β-estradiolu) w 100% etanolu.
  4. Dodać 40 μl nocnych kultur do 10 ml płynu YPD (rozcieńczenie 1-250).
  5. Dla każdego szczepu dodać 96 μl rozcieńczonych komórek do 18 dołków 96-dołkowej płytki.
  6. Dodaj 4 μl β-estradiolu do komórek. Istotną kwestią jest upewnienie się, że każda studnia ma taką samą ilość etanolu ogółem. (Alternatywnie, można użyć bardziej skoncentrowanego zapasu β-estradiolu, a następnie rozcieńczyć go do punktu, w którym nie można zmierzyć wpływu etanolu na wzrost).
  7. Wykonać w trzech egzemplarzach. Trzy studzienki dla każdego szczepu powinny być kontrolne wyłącznie na bazie etanolu.
  8. Przykryj 96-dołkową płytkę membraną przepuszczającą gaz.
  9. Monitoruj wzrost (OD600) w czytniku płytek.
  10. Określ ilościowo tempo wzrostu za pomocą dowolnej liczby standardowych metod, takich jak znalezienie maksymalnego nachylenia.
    Uwaga: Odnieśliśmy duży sukces z pakietem oprogramowania open source grofit14, który działa w środowisku programistycznym R. Warto wspomnieć, że chociaż tempo wzrostu obliczone na podstawie 96-dołkowych testów płytkowych w porównaniu z kolbami wstrząsowymi (25 ml kultur) niekoniecznie jest takie samo (ze względu na różnice zarówno w fizjologii, jak i oprzyrządowaniu), zaobserwowaliśmy, że względne tempo wzrostu jest podobne (choć nie zawsze tak jest).

5. Tworzenie indukowalnych alleli genomowych

  1. Otrzymaj pMN10, plazmid niecentromerowy z promotorem reagującym na ATF z pMN8 połączonym z KanMX (w odwrotnej orientacji).
  2. Ograniczenie trawi szkielet wektora i ekstrakt żelowy, jak w sekcji 2.
  3. Oligonukleotydy wyżarzające, fosforylowane i ligatowate zawierające odpowiednie miejsca wiązania, jak opisano w sekcji 2.
  4. Weryfikacja sekwencji. Ten plazmid będzie teraz służył jako matryca DNA do tworzenia indukowalnego allelu.
  5. Otrzymać szczep drożdży wyrażający odpowiadający mu ATF, który jest przedmiotem zainteresowania.
  6. PCR amplifikować kasetę KanMX-Promoter (~2 kb) przy użyciu starterów z Tabeli 6.
  7. Przekształć produkt PCR w szczep wykazujący ekspresję ATF przy użyciu metody octanu litu.
  8. Tabliczka na YPD i tabliczka repliki na YPD+ G418 następnego dnia.
  9. Potwierdzić prawidłowe wprowadzenie promotora za pomocą startera do przodu (5'-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3') i startera wstecznego wewnętrznego do genu, którego promotor został zastąpiony. Odwrócony starter jest zwykle projektowany tak, aby znajdował się w zakresie 200-300 pz za pierwszym ATG15. Końcowy produkt PCR to ~1,2 kb.

Wyniki

Rycina 5 przedstawia indukcję GFP przez Z3EV, Z4EV lub GEV w funkcji czasu. Zauważalny jest wzrost produkcji GFP w odpowiedzi na ATF zawierające domeny wiążące DNA pochodzenia niedrożdżowego. Niedawno wysunięto hipotezę, że wynika to z faktu, iż czynniki te osiągają swoistość wobec pojedynczego genu w genomie drożdżowym1. Sama indukcja GEV prowadzi do aktywacji/represji setek genów, podczas gdy Z3EV i Z4EV aktywują jedynie ekspresję genu docelowego umieszczonego poniżej syntetycznego promotora zawierającego odpowiednie miejsca wiązania (odpowiednio 5'-GCGTGGGCG-3' i 5'-GCGGCGGAGGAG-3')1. Rycina 7 demonstruje ścisłą regulację systemu (brak induktora skutkuje brakiem wykrywalnego GFP) oraz fakt, że wszystkie komórki ulegają indukcji w odpowiedzi na induktor. Zdolność Z3EV do indukcji GFP w zależności od stężenia β-estradiolu przedstawiono na Rycynie 8.

Schemat szlaku sygnałowego hormonów; wiązanie czynnika transkrypcyjnego, aktywacja plazmidu reporterowego, ekspresja GFP.
Rycina 1. Sztuczne czynniki transkrypcyjne oddziałują z Hsp90 w obecności β-estradiolu. Po związaniu β-estradiolu z ATF, Hsp90 dysocjuje, co umożliwia ATF wniknięcie do jądra i aktywację ekspresji z plazmidu reporterowego.

Proces tworzenia sztucznego czynnika transkrypcyjnego; PCR, konstrukcja plazmidu, cytometria przepływowa; schemat biologiczny.
Rysunek 2. Schemat protokołu inżynierii szczepów zawierających sztuczne czynniki transkrypcyjne oraz budowy i testowania pokrewnych reporterów GFP.

Schemat procesu rekombinacji DNA; dopasowanie sekwencji, homologia starterów PCR dla edycji genów.
Rycina 3. Sekwencja ACT1pr-URA3-EV w szczepie yMN15 w locus LEU2.

Startery do PCR amplifikujące domenę wiążącą DNA, szczegóły sekwencji, metoda amplifikacji.
Rycina 4. Projekt starterów PCR do amplifikacji interesującej domeny wiążącej DNA z dodatkową homolgią sekwencji w celu wygenerowania nowego białka fuzyjnego po udanej transformacji do szczepu yMN15.

Wykres ekspresji GFP; czas względem intensywności w trzech warunkach (Z4EV, GEV, Z3EV); wynik eksperymentalny.
Rycina 5. Indukcja GFP przez trzy różne pary promotorów ATF w odpowiedzi na 1 µM β-estradiolu.

Skrypt MATLAB do analizy histogramu fluorescencji GFP; przetwarzanie danych FCS i generowanie wykresów.
Rysunek 6. Skrypt MATLAB do przetwarzania danych z cytometrii przepływowej. Skrypt ten został zaadaptowany z http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data.

Wykres analizy intensywności fluorescencji dla ekspresji GFP przy różnych stężeniach estradiolu.
Rycina 7. Indukcja GFP przez Z3EV w odpowiedzi na 0 µM β-estradiolu oraz 1 µM β-estradiolu po 18 hr indukcji. Fluorescencję mierzono również w komórkach pozbawionych GFP, aby zilustrować ścisłą regulację systemu Z3EV. Rycina ta została wygenerowana przy użyciu kodu przedstawionego na Rycynie 6.

Odpowiedź fluorescencyjna: wykres w skali logarytmicznej (A), analiza krzywej dawka-odpowiedź (B), dopasowanie dla β-estradiolu.
Rysunek 8. Zależność między stężeniem induktora a poziomem ekspresji ma charakter stopniowy ze współczynnikiem Hilla wynoszącym ~1. (A) Rozkłady ekspresji GFP w funkcji stężenia β-estradiolu. (B) Średnia fluorescencja rozkładów z punktu (A). Dane dopasowano do funkcji G(D) = Gmin + (Gmax−Gmin)Dn/(Kn+Dn), gdzie D to dawka β-estradiolu, Gmin i Gmax to odpowiednio minimalne i maksymalne wartości GFP, n to współczynnik Hilla, a K to dawka β-estradiolu dająca ½ (Gmax + Gmin).

Sekwencja oligonukleotydówNazwa
5’-TTGAAACCA
AACTCGCCTCT-3’		Kontrola DBD w kierunku przód
5’-tccagagac
ttcagggtgct-3’		Kontrola DBD Reverse

Tabela 1. Startery służące do potwierdzenia prawidłowej fuzji wybranego DBD z receptorem estrogenowym. Starter przedni (forward) jest homologiczny do promotora ACT1, a starter odwrotny (reverse) jest homologiczny do receptora estrogenowego. Dla typowych DBD (~300 bp) produkt PCR ma wielkość <1,5 kb.

Sekwencja oligonukleotydowaNazwa
5'-ggccgc…miejsce wiązania DBD... t-3'Górny oligonukleotyd
5’-ctaga…odwrotna sekwencja wiązania DNA…gc-3’  Dolny oligonukleotyd
5'-gccgcGTGGGCGTGCGTGGGCGGG
CGTGGGCGTGCGTGGGCGGGCGTG
GGCGTGCGTGGGCGt-3'		Górny oligo + 6x miejsc wiązania Zif268
5’-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC
CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC
CACGCACGCCCACgc-3’ 		Dolny oligonukleotyd + 6x miejsc wiązania Zif268

Tabela 2. Struktura starterów do tworzenia dsDNA zawierającego interesujące miejsca wiązania. Do stworzenia promotora responsywnego na Z3EV wykorzystano oligonukleotydy Top oligo + 6x Zif268 Binding Sites oraz Bottom oligo + 6x Zif268 Binding. Sekwencje służące do tworzenia odpowiednich nawisów DNA zapisano małymi literami. Konsensusowa sekwencja wiązania Zif268, GCGTGGGCG, została podkreślona w górnym oligonukleotydzie.

OdczynnikIlość
Bufor do kinazy polinukleotydowej T45 µl
kinaza polinukleotydowa T4 (@10 000 j./ml)1 µl
Górny oligonukleotyd (100 µM)1.5 µl
Dolny oligonukleotyd (100 µM)1.5 µl
Woda41 µl

Tabela 3. Przeprowadź fosforylację i wyżarzanie starterów w termocyklerze, używając 50 µl opisanej powyżej mieszaniny reakcyjnej. Proces w termocyklerze składa się z dwóch etapów. Etap 1: 37 °C przez 30 min (fosforylacja) oraz etap 2: 95 °C przez 30 sec (obniżanie temperatury o 1 °C co 30 sec aż do osiągnięcia 4 °C; wyżarzanie).

OdczynnikIlość
XbaI1 µl
NotI-HF1 µl
Plazmidowe DNA5 µl (1-2 µg)
Bufor 10x Cut Smart5 µl
Woda38 µl

Tabela 4. Trawienie restrykcyjne plazmidu pMN8 za pomocą XbaI i NotI.

OdczynnikIlość
Bufor do ligazy T42 µl
Ligaza T40.2 µl
Szkielet @ 10 ng/µl1 µl
Sekwencje wiążące w 5-krotnym stężeniu molowymµl1 µl
Woda15.8 µl

Tabela 5. Ligacja miejsc wiązania do DNA plazmidowego.

StarterOpis
~40 bp powyżej ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3’Starter bezpośredni do amplifikacji promotora KanMX
5’-odwrotna komplementarna sekwencja(ATG + ~37bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3’Starter odwrotny do amplifikacji promotora KanMX
5’-caatttgtctgctcaagaaaataaa
ttaaatacaaataaaCGCAC
TTAACTTCGCATCTG-3’		Starter bezpośredni do wytwarzania GCN4 wymiana promotora
5’-tggatttaaagcaaataaacttgg
ctgatattcggacatTATAGTT
TTTTCTCCTTGACG-3’		Starter odwrotny do przygotowania GCN4 wymiana promotora

Tabela 6. Amplifikacja PCR promotora KanMX w celu stworzenia allelu tytrowalnego.

Dyskusja

Opisane tutaj przełączniki oparte na hormonach mają niezliczone zastosowania, od badania natywnej biologii komórki po testowanie zdolności interesującej nas domeny wiążącej DNA do celowania w sekwencję DNA in vivo. System posiada wiele pożądanych cech, w tym stopniowaną reakcję na induktor, szybkie działanie i ścisłą regulację (tj. brak mierzalnej nieszczelności, patrz rysunek 7). Wciąż jednak jest miejsce na ulepszenia i ekspansję.

Ostatnie prace w dziedzinie biologii syntetycznej kładą nacisk na multipleksowanie systemów syntetycznych i rozszerzanie repertuaru dobrze scharakteryzowanych, programowalnychczęści DNA. Niezależna, warunkowa ekspresja odrębnych genów docelowych wymaga zarówno wielu induktorów, jak i domen wiążących DNA, które nie mają nakładającej się specyficzności. Dostępność zmodyfikowanych i naturalnie występujących receptorów zapewnia duży zestaw części, za pomocą których można opracować nowe sztuczne czynniki transkrypcyjne. Poszerzenie repertuaru wzajemnie ortogonalnych przełączników zostało znacznie ułatwione przez podejścia oparte na ukierunkowanej ewolucji17,18. Obecne wysiłki zmierzające do przeprogramowania swoistości wiążącej ligand naszych sztucznych czynników transkrypcyjnych zostaną przedstawione w przyszłości.

Wcześniej fenotypowe konsekwencje delecji/nadekspresji genów były szeroko badane u drożdży19,20. Jednak nie było łatwo zbadać wpływ ekspresji na różne fenotypy w zakresie poziomów ekspresji. Podstawową cechą przedstawionego tu systemu jest jego stopniowany charakter (rysunek 8). Choć często się zakłada, związek między ekspresją genów a fenotypami będącymi przedmiotem zainteresowania niekoniecznie musi być monotonny. Sztuczne czynniki transkrypcyjne, takie jak Z3EV i Z4EV, ułatwią zadanie oceny odpowiedzi fenotypowych na zmiany w ekspresji genów.

Wreszcie, protokoły omówione w tym manuskrypcie służą do inżynierii i charakteryzowania sztucznych czynników transkrypcyjnych, które reagują na β-estradiol; jednak ważną alternatywą dla domen reagujących chemicznie jest użycie domen reagujących na światło (takich jak PhyB/Pif3, Lov i BLUF), których działanie jest odwracalne bez konieczności zakłócania pożywki hodowlanej21-23. Systemy oparte na świetle ułatwiają czasoprzestrzenną kontrolę ekspresji genów, interakcji białko-białko, transportu jonów i aktywności enzymatycznej, które już okazały się potężne21-26.

Podsumowując, przedstawiono metody szybkiej budowy indufikowalnych, sztucznych czynników transkrypcyjnych w drożdżach. Protokół ten zawiera szablon do ich budowy w połączeniu z pokrewnymi reporterami GFP, a także metody analizy danych reporterowych za pomocą cytometrii przepływowej i oznaczania wpływu aktywacji ATF na wzrost.

Oświadczenia

McIsaac, Noyes i Botstein (wraz z innymi) przedłożyli część tego systemu jako Ujawnienie Patentu.

Podziękowania

R.S.M. dziękuje za finansowanie z Stypendium Naukowego dla Absolwentów NSF. M.B.N. dziękuje za finansowanie ze stypendium Lewisa-Siglera i daru Petera Lewisa. D.B. dziękuje za finansowanie z NIH (GM046406) Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych, Centrum Biologii Ilościowej (GM071508). Dziękujemy Christinie DeCoste za pomoc w eksperymentach z cytometrią przepływową.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nazwa firmy odczynnikowejNumer katalogowyKomentarze 
Rozwiń system PCR o wysokiej wiernościRoche11 732 650 001
Ligaza DNA T4NEBM0202S
Kompetentny E. coliLife Technologies18258-012
EstradiolTocris Biosciences2824
AmpicillinFisher ScientificBP1760-5
T4 Kinaza polinukleotydowaNEBM0201
PBSLife Technologies10010-23
Tween-20Sigma-Aldrich9005-64-5
clonNATJena BioscienceAB-102L
XbaINEBR0145S
NotHFNEBR3189S
Bufor CutSmartNEBB7204S
GlukozaFisher ScientificD15-500
Bacto-PeptoneBD Biosciences211677
Ekstrakt drożdżowyBD Biosciences210929
AgarozaBD Biosciences214010
100% etanolDecon Laboratories04-355-222
G418Life Technologies11811-031
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27104
Dwuwodny octan lituSigma-AldrichL-6883
DNA nasienia łososiaSigma-Aldrich93283
PEG 3350Sigma-AldrichP-3640
Plazmidy pMN8 i pMN10; szczep drożdży yMN15Noyes lub Botstein labs
Bulion LuriaSigma-AldrichL3397
SPRZĘT:
Cyometr przepływowy LSRII BD BiosciencesRóżne modele
MATLAB lub FlowJoMATLAB lub FlowJoOprogramowanie do analizy . Pliki FCS z eksperymentów cytometrii przepływowej
ROpen SourceDo analizy danych o tempie wzrostu z czytnika płytek. 
Probówki FalconBD Biosciences352052
1,7 ml Eppendorf  ProbówkiGeneMateC3262-1
250 ml Shake FlaskCorning4446-250
96-dołkowe, płaskie płytki CzytnikCostar3635
(wielomodowy czytnik płytek Synergy H1)BioTekH1MG
Oddychające membranySigma-AldrichZ380059-1PAK
Termocyklerróżne firmyRóżne modele
SC-Ura w proszkuMP Biomedicals114410622
5-FOAZymo ResearchF9001-1
płytek

Bibliografia

  1. McIsaac, R. S., et al. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic acids res. 41, e57(2013).
  2. McIsaac, R. S., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. cell. 22, 4447-4459 (2011).
  3. Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast. Gene. 131, 129-134 (1993).
  4. Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., Evan, G. I. A modified oestrogen receptor ligand-binding domain as an improved switch for the regulation of heterologous proteins. Nucleic acids res. 23, 1686-1690 (1995).
  5. McIsaac, R. S., et al. Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (76), e50382(2013).
  6. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Mol. Biol. cell. 23, 2993-3007 (2012).
  7. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic acids res. 26, 942-947 (1998).
  8. Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Meth. Enzymol. 327, 401-421 (2000).
  9. Kodama, S., Okada, K., Akimoto, K., Inui, H., Ohkawa, H. Recombinant aryl hydrocarbon receptors for bioassay of aryl hydrocarbon receptor ligands in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 7, 119-128 (2009).
  10. Hickman, M. J., et al. Coordinated regulation of sulfur and phospholipid metabolism reflects the importance of methylation in the growth of yeast. Mol. Biol. cell. 22, 4192-4204 (2011).
  11. Taxis, C., Stier, G., Spadaccini, R., Knop, M. Efficient protein depletion by genetically controlled deprotection of a dormant N-degron. Mol. Syst. Biol. 5, 267(2009).
  12. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nat. methods. 6, 917-922 (2009).
  13. Burke, D. J., Amberg, D. C., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
  14. Kahm, M., Hasenbrink, G., Lichtenberg-Frate, H., Ludwig, J., Kschischo, M. grofit: Fitting Biological Growth Curves with R. J. Stat. Softw. 33, 1-21 (2010).
  15. Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol. Biol. 132, 365-386 (2000).
  16. Khalil, A. S., et al. A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions. Cell. 150, 647-658 (2012).
  17. Chockalingam, K., Chen, Z., Katzenellenbogen, J. A., Zhao, H. Directed evolution of specific receptor-ligand pairs for use in the creation of gene switches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5691-5696 (2005).
  18. McLachlan, M. J., Chockalingam, K., Lai, K. C., Zhao, H. Directed evolution of orthogonal ligand specificity in a single scaffold. Angewandte Chemie. 48, 7783-7786 (2009).
  19. Jorgensen, P., Nishikawa, J. L., Breitkreutz, B. J., Tyers, M. Systematic identification of pathways that couple cell growth and division in yeast. Science. 297, 395-400 (2002).
  20. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol. cell. 21, 319-330 (2006).
  21. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat. biotechnol. 20, 1041-1044 (2002).
  22. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J. Am. Chem. Soc. 134, 16480-16483 (2012).
  23. Losi, A., Gartner, W. Old chromophores, new photoactivation paradigms, trendy applications: flavins in blue light-sensing photoreceptors. Photochem. Photobiol. 87, 491-510 (2011).
  24. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  25. Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
  26. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nat. biotechnol. 29, 1114-1116 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sztuczne czynniki transkrypcyjnetransformacja dro d yplazmid reporterowy GFPcytometria przep ywowaindukcja beta estradiolemdomena wi ca DNArekombinacja homologicznawarunkowa ekspresja gen wpromotor syntetycznymetoda octanu litu

Powiązane artykuły