Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
MikroRNA (miRNA) stanowią potężną warstwę regulacji genów, kierując RISC do docelowych miejsc zlokalizowanych na mRNA, a w konsekwencji poprzez modulowanie ich translacyjnej represji. Wykazano, że zmiany w ekspresji miRNA są zaangażowane w rozwój wszystkich głównych złożonych chorób. Co więcej, ostatnie odkrycia wykazały, że miRNA mogą być wydzielane do środowiska zewnątrzkomórkowego i przedostawać się do krwiobiegu i innych płynów ustrojowych, gdzie mogą krążyć z dużą stabilnością. Funkcja takich krążących miRNA pozostaje w dużej mierze nieuchwytna, ale systematyczne podejścia o wysokiej przepustowości, takie jak matryce profilowania miRNA, doprowadziły do identyfikacji sygnatur miRNA w kilku stanach patologicznych, w tym zaburzeniach neurodegeneracyjnych i kilku rodzajach nowotworów. W tym kontekście, identyfikacja profilu ekspresji miRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym, jak opisano w naszym ostatnim badaniu, sprawia, że miRNA są atrakcyjnymi kandydatami do analizy biomarkerów.
Dostępnych jest kilka narzędzi do profilowania mikroRNA, takich jak mikromacierze, ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) i głębokie sekwencjonowanie. W tym miejscu opisujemy czułą metodę profilowania mikroRNA w płynach mózgowo-rdzeniowych za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Użyliśmy gotowych do użycia ludzkich paneli PCR MicroRNA Exiqon I i II V2. R, który pozwala na wykrycie 742 unikalnych ludzkich mikroRNA. Wykonaliśmy tablice w trzech seriach, a dane przetwarzaliśmy i analizowaliśmy za pomocą oprogramowania GenEx Professional 5.
Korzystając z tego protokołu, udało nam się profilować mikroRNA w różnych typach linii komórkowych i komórek pierwotnych, płynu mózgowo-rdzeniowego, osocza i tkanek zatopionych w parafinie utrwalonym w formalinie.
Wprowadzenie
MikroRNA należą do rodziny małych (21-23 nt długości) niekodujących RNA, które regulują ekspresję genów po transkrypcji. MikroRNA mogą być wydzielane w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, gdzie wydają się być względnie stabilne. Podczas gdy określanie zmian w ekspresji miRNA może być ważnym krokiem w kierunku identyfikacji biomarkerów, wykonywanie profili miRNA i obsługa dużej ilości danych może być zastraszające.
Tutaj opisujemy protokół do określania zmian w ekspresji miRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (mających zastosowanie do innych płynów ustrojowych) za pomocą czułego PCR w czasie rzeczywistym. Opisujemy również wykorzystanie oprogramowani....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Poniższy protokół opisuje standardową procedurę izolacji RNA z płynu mózgowo-rdzeniowego i profilowania mikroRNA przy użyciu gotowych płytek PCR. Należy pamiętać, że ekstrakcja do fazy organicznej jest opcjonalna, a podczas ekstrakcji do próbki dodawany jest nośnik RNA, co zapewnia maksymalne odzysk RNA. W związku z tym nie ma potrzeby ilościowego oznaczania RNA.
Ogólnie, średnio 6-8 płytek może być przepuszczonych w ciągu jednego dnia, jeśli cDNA zostanie zsyntetyzowane dzień wcześniej (około 2 godziny). Analiza danych jest wykonywana, gdy wszystkie próbki zostały sprofilowane i załadowane do oprogramowania. W zależności od liczby próbek/g....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyniki niniejszego badania zostały wcześniej opublikowane1. Rysunek 1 przedstawia wyniki analizy kandydujących referencyjnych mikroRNA z zastosowaniem aplikacji geNorm. W konsekwencji dwa mikroRNA, miR-622 oraz miR-1266, zostały zidentyfikowane jako geny referencyjne i wykorzystane do normalizacji wartości miRNA.
W badaniu płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) zastosowano trzy grupy próbek: HIV- (n=10), HIVE (n=4) oraz HIV+ bez zapalenia mózgu (HIV+,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
MikroRNA to małe niekodujące RNA, które regulują ekspresję genów poprzez hamowanie translacji i/lub promowanie degradacji mRNA2. Ze względu na ich wysoką stabilność w warunkach bezkomórkowych, mikroRNA zostały wykryte w wielu płynach ustrojowych. Co więcej, odrębny profil ekspresji mikroRNA został skorelowany ze stopniem zaawansowania i/lub progresją w różnych nowotworach u ludzi3-9.
Dostępnych jest kilka narzędzi do profilowania mikroRNA, w tym klasyczne macierze chipowe.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Opisany projekt był wspierany przez Nagrodę Numer R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) z Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego lub Narodowego Instytutu Zdrowia.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
Tabela 3. Lista urządzeń. | |||
| Pipeter wielokanałowy Finnpipette Novus | Thermo Scientific | HH05279 | |
| końcówki do pipet Finntip | Thermo Scientific | 9400613 | |
| Thermal Cycler C1000 | Biorad | ||
| 0,2 ml Low Profile, Przezroczyste probówki do PCR | Biorad | TLS0801 | |
| Paski z płaską nakrętką | Biorad | TLS0803 | |
LightCycler 480 System PCR w czasie rzeczywistym | |||
LightCycler 480 Folia uszczelniająca | 04 729 757 001 | ||
| Wirówka z chłodzeniem 5804R | Eppendorf | ||
| Wirnik uchylny, 4-miejscowy | Eppendorf | A-4-44 | |
| Mini wirówka stołowa | Fisher | 05-090-100 | |
| Wir laboratoryjny | Fisher | ||
| 1,5 ml Probówki do mikrowirówek, sterylizowane | Fisher | 02-681-5 | |
| Matrix Zbiornik na odczynniki, 25 ml | Thermo Scientific | 8093 | |
| Thermomixer Confort | Eppendorf | ||
Wirówka stacjonarna Sigma 1-15 | Sigma | ||
| Wir laboratoryjny | Velp Scientifica | F202A0173 | |
Tabela 4. Lista odczynników. | |||
| Uniwersalny zestaw do syntezy c-DNA, 16-32 rxns | Exiqon | 203300 | |
| SYBR Green master mix, Uniwersalny RT, 25 ml | Exiqon | 203400 | |
| Ultraczysta dnaza destylowana wody, Bez rnazy | Invitrogen | 10977-015 | |
| MicroRNA Gotowe do użycia panele ludzkie PCR (I+II) V2.R | Exiqon | 203608 | |
mirVana miRNA Zestaw do izolacji, 40 izolacji | Ambion | AM1556 | |
| MS2 nośnik RNA | Roche Applied Science | 10165948001 | |
2-merkaptoetanol 98% | Sigma Aldrich | M3148-25ml | |
| Etanol 100% | Carlo Erba | 64-17-5 | |
| Woda wolna od nukleaz | Qiagen | 1039480 | |
| <>RNAz Zap | Ambion | AM9780 |
Bibliografia
- Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (20....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
