Artykuł metodologiczny

Warunkowanie strachu śladowego u myszy

DOI:

10.3791/51180

⸱

20 marca 2014

 ,  , 
1Department of Psychology and Neuroscience, Baylor University, 2Institute of Biomedical Studies, Baylor University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W poniższym eksperymencie opisujemy protokół warunkowania strachu śladowego u myszy. Ten rodzaj pamięci asocjacyjnej obejmuje okres śladowy, który oddziela bodziec neutralny od bodźca bezwarunkowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym eksperymencie prezentujemy technikę pomiaru uczenia się i pamięci. W przedstawionym tutaj protokole warunkowania strachu śladowego istnieje pięć par między bodźcem neutralnym a bodźcem bezwarunkowym. Istnieje 20-sekundowy okres śledzenia, który oddziela każdą próbę kondycjonowania. Następnego dnia mierzy się zamrożenie podczas prezentacji bodźca kondycjonowanego (CS) i okresu śladowego. Trzeciego dnia odbywa się 8-minutowy test mierzący pamięć kontekstową. Reprezentatywne wyniki pochodzą od myszy, u których przedstawiono awersyjny bodziec bezwarunkowy (szok) w porównaniu z myszami, które otrzymały prezentacje tonalne bez bodźca bezwarunkowego. Warunkowanie strachu śladowego zostało z powodzeniem wykorzystane do wykrywania subtelnych deficytów uczenia się i pamięci oraz ulepszeń u myszy, których nie stwierdzono przy użyciu innych metod warunkowania strachu. Uważa się, że ten rodzaj warunkowania strachu jest zależny od połączeń między przyśrodkową korą przedczołową a hipokampem. Jedną z obecnych kontrowersji jest to, czy uważa się, że metoda ta jest niezależna od ciała migdałowatego. Dlatego potrzebne są inne testy warunkowania strachu, aby zbadać efekty uczenia się i pamięci zależne od ciała migdałowatego, takie jak warunkowanie strachu z opóźnieniem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W warunkowaniu strachu neutralny bodziec (NS) jest sparowany z awersyjnym bodźcem bezwarunkowym (US). NS jest zwykle tonem i staje się bodźcem warunkowym (CS) poprzez wielokrotne parowanie z USA. CS może następnie wywołać reakcję warunkową (CR), taką jak zamrożenie, w przypadku braku awersyjnego US. Powszechnie stosowanym protokołem warunkowania strachu jest warunkowanie opóźnione. W tym protokole początek NS i USA jest ciągły lub w pewnym stopniu nakłada się na siebie w prezentacji bodźca. Mimo że warunkowanie strachu przed opóźnieniem jest jednym z najczęściej stosowanych typów warunkowania czasowego asocjacyjnego, istnieje kilka innych rodzajów warunkowania asocjacyjnego układów czasowych: warunkowanie jednoczesne, warunkowanie wsteczne i warunkowanie śladowe1. W warunkowaniu strachu śladowego między NS a USA występuje kilkusekundowy interwał wolny od bodźców, co skutkuje okresem "śladu".

Kilka badań wykazało deficyty w warunkowaniu strachu śladowego, gdy w strukturach wprowadzających do hipokampa2-5 powstają zmiany neurotoksyczne, lub gdy stosowane są środki farmakologiczne do blokowania funkcji receptora w hipokampie. Uszkodzenie hipokampa powoduje deficyty w warunkowaniu śladowym i warunkowaniu kontekstowym, ale nie upośledza warunkowania strachu opóźniającego8. Istnieje kilka korzyści płynących ze stosowania warunkowania strachu śladowego. Protokół warunkowania strachu można osiągnąć w ciągu trzydniowego okresu testowego i pozwala na pamięć zależną od hipokampa, która nie jest zależna przestrzennie. Warunkowanie strachu śladowego może być stosowane jako test uzupełniający do labiryntu wodnego Morrisa, test rozpoznawania nowych obiektów lub inne testy labiryntu w badaniu pamięci zależnej od hipokampa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy użyte w poniższym eksperymencie zostały wygenerowane i trzymane na Uniwersytecie Baylor w temperaturze otoczenia 22 °C, z 14-godzinnym jasnym i 10-godzinnym ciemnym (20:00 do 6:00) cyklem dobowym. Myszom zapewniono ad libitum dostęp do pożywienia i wody. Wszystkie procedury na myszach były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, a protokół na zwierzętach został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Baylor.

Przegląd

Zadanie strachu uwarunkowanego śladem opiera się na procedurach opisanych przez Wiltgena i współpracowników9.

1. Przygotowanie sprzętu

Komora aparatu do kondycjonowania strachu (26 cm x 22 cm x 18 cm) składa się z dwóch stron akrylowych, dwóch stron metalowych i siatki podłogowej, która służy do dostarczania łagodnego wstrząsu stopy. Komora badawcza jest umieszczona w komorze wyciszającej. Komora jest również szczelna na światło, aby światło zewnętrzne nie wpływało na oprogramowanie do wykrywania ruchu.

  1. Skalibruj poziomy wstrząsów, poziomy światła i poziomy natężenia dźwięku w komorze testowej. Zmierz poziom tła w komorze testowej. Hałas tła w tej komorze wynosi 65 dB. Użyj miernika dźwięku, aby zmierzyć ten poziom. Miernik powinien być ustawiony na 70 dB, ustawiony na C i na powolne ustawienie wykrywania.
    1. Skalibruj poziom wstrząsów na 0.5 mA. Użyj zewnętrznego urządzenia kalibracyjnego, aby prawidłowo skalibrować poziom wstrząsów (patrz tabela materiałów). Wewnętrzny pomiar generatora wstrząsów nie jest dokładny. Generator wstrząsów podaje zakodowany wstrząs, którego nie można dokładnie zmierzyć za pomocą standardowego amperomierza.
    2. Umieść jeden przewód na jednym z prętów siatki, a drugi przewód umieść na 3 lub 4 prętach. Użyj generatora wstrząsów, aby podać wstrząs. Dostosuj poziom wstrząsów, aż do osiągnięcia prawidłowego poziomu. Zrób to dla każdej komory kondycjonującej strach.
    3. Zamknij drzwiczki komory podczas pomiaru poziomu światła w komorze. Skalibruj poziom światła do około 1.0. Jest to liczba specyficzna dla oprogramowania FreezeFrame użytego w tym eksperymencie. Zewnętrzny światłomierz wskaże to jako 2 luksy. Poziom światła można regulować, przesuwając położenie światła w domu lub regulując kondensor soczewki. Po wyregulowaniu upewnij się, że dokręciłeś regulacyjne obiektywu.
    4. Skalibruj poziom decybeli dźwięku do 85 dB. Użyj zewnętrznego miernika decybeli wewnątrz klatki testowej, aby skalibrować poziom decybeli (patrz Tabela materiałów). Prezentowany dźwięk będzie miał brzmienie 2 700 Hz. Uwaga: Jeśli używasz myszy starszych niż 6 miesięcy, lepiej jest użyć białego szumu, ponieważ starsze myszy mogą mieć ubytki słuchu .
  2. Po przygotowaniu aparatury należy zabrać badanych do oddzielnego pomieszczenia do przetrzymywania. Uwaga: Nie umieszczaj myszy w tym samym pomieszczeniu, w którym znajduje się pomieszczenie testowe.
  3. Oznacz ogon myszy, które będą testowane, w kolejności testowania. Najlepiej jest ograniczyć nadmierne obchodzenie się z nim przed badaniem. Alternatywnie, ogony mogą być oznaczone dzień przed eksperymentem, aby zmniejszyć stres związany z obsługą. Po oznakowaniu myszy pozwól im zaaklimatyzować się w pomieszczeniu przez 30 minut. Miej dodatkowe czyste klatki do trzymania myszy po zakończeniu testów.

2. Kondycjonowanie śladowe Dzień 1

  1. Wyjmij każdą mysz z klatki i umieść ją w osobnych klatkach w celu transportu do komory kondycjonowania strachu. Używaj czystej ściółki do każdej klatki. Umieść karteczkę samoprzylepną na klatce transferowej, aby kolejność testowania myszy była prawidłowa. Uwaga: Jeśli myszy są trzymane pojedynczo, można je transportować w klatce domowej.
  2. Umieść mysz w komorze testowej i zamknij drzwi. Uruchom oprogramowanie.
  3. W dniu treningu pozwól myszom eksplorować komorę przez 3 minuty. Następnie oprogramowanie wyświetla zwierzęciu 20-sekundowy sygnał dźwiękowy (85 dB, 2 700 Hz). Po upływie 20 sekund zwierzęciu podaje się łagodny wstrząs (2 sekundy, 0,5 mA).
  4. Nagraj reakcję badanego, aby potwierdzić, że otrzymał bodźce awersyjne, oglądając wideo. 200-sekundowy odstęp między próbami oddziela 5 prób kondycjonowania. Każda próba składa się z 20-sekundowego dźwięku, po którym następuje 20-sekundowe opóźnienie, a następnie wstrząs.
  5. Po zakończeniu badania pozwól zwierzęciu pozostać w komorze testowej przez 1 minutę przed wyjęciem go z klatki do badań.
  6. Umieść zwierzę z powrotem w klatce transferowej i umieść je z powrotem w klatce domowej. Jeśli w ich klatce domowej znajdują się dodatkowe myszy, należy indywidualnie trzymać mysz, aż wszystkie myszy zakończą testy. Zmniejszy to stres u innych myszy, które nie zostały przetestowane. Alternatywnym rozwiązaniem byłoby trzymanie wszystkich myszy pojedynczo na tydzień przed badaniem, aby zmniejszyć wpływ ciągłego usuwania myszy z jednej klatki.
  7. Wyczyść komorę testową 30% izopropanolem po każdym badaniu zwierzęcia.
  8. Powtórz kroki 2.2-2.7 dla wszystkich myszy w kohorcie testowej.
  9. Przywróć wszystkie myszy do ich pokoju kolonijnego po przetestowaniu ostatniej myszy w kohorcie.

3. Warunkowanie strachu śladowego Dzień 2: Testowanie pamięci śladowej

  1. Testowanie pamięci śladowej odbędzie się w dniu 2. W tym protokole znajdują się prezentacje 3 tonów. Umieść myszy w nowym kontekście do testu kondycjonowania śladowego.
  2. Przygotuj oprogramowanie do uruchomienia programu z 2-minutowym okresem bazowym, po którym następują trzy 20-sekundowe prezentacje tonowe. Pomiędzy każdą prezentacją tonu jest 220 sekund ITI.
  3. Aby uzyskać nowy warunek kontekstowy, umieść przezroczyste wkładki akrylowe na podłodze komory, aby zmienić kształt, teksturę i kolor komory kondycjonowania.
  4. Zmień zapach w komorze, umieszczając ekstrakt waniliowy w łódce do ważenia pod wkładem podłogowym.
  5. Wyczyść komorę 70% etanolem zamiast 30% izopropanolu. Uwaga: Pomoże to stworzyć nowy kontekst.
  6. Przynieś myszy do pomieszczenia przetrzymywania i w razie potrzeby ponownie oznacz ich ogony do testów.
  7. Przygotuj nowatorskie klatki do przenoszenia kontekstu, zastępując ściółkę rozdrobnionym papierem. Uwaga: Pomoże to w stworzeniu nowego kontekstu.
  8. Umieść myszy w komorze testowej, a następnie uruchom program. Po zakończeniu testów wyczyść komorę 70% etanolem.
  9. Przywróć myszy do ich klatki domowej po zakończeniu kondycjonowania śladów. Przywróć wszystkie myszy do ich pokoju kolonijnego, gdy wszystkie myszy zostaną przetestowane.

4. Warunkowanie strachu śladowego Dzień 3: Testowanie pamięci kontekstowej

  1. Trzeciego dnia przeprowadza się warunkowanie kontekstowe. Przygotuj oprogramowanie do uruchomienia programu rejestrującego zachowanie podczas zawieszania się przez 8 minut.
  2. Wyczyść komorę 30% izopropanolem przed testem i po przetestowaniu każdej myszy. Kontekst powinien być identyczny jak w dniu 1. Klatki transferowe powinny być takie same jak w dniu 1.
  3. Przyprowadź myszy do pomieszczenia przetrzymywania i oznacz ich ogony do testów.
  4. Umieść każdą mysz w komorze testowej, a następnie uruchom program. Po zakończeniu badania wyczyść komorę 30% izopropanolem.
  5. Po zakończeniu przywróć wszystkie myszy do ich pokoju kolonijnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla reprezentatywnych wyników prezentujemy dane od kontrolnych dorosłych myszy C57BL/6J, które otrzymały neutralny bodziec parujący z bodźcem bezwarunkowym (stan szoku), w porównaniu do myszy, które otrzymały neutralny bodziec, ale nie otrzymały bodźca bezwarunkowego (stan braku szoku). Ważne jest, aby uruchomić ten warunek podczas pierwszej konfiguracji tego testu behawioralnego, aby określić, czy protokół został wykonany poprawnie.

Dane na rysunku 1 reprezentują dzień trenin...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadzono kilka badań, które wyjaśniły obwody neuronalne, które leżą u podstaw warunkowania strachu. Uważa się, że warunkowanie strachu śladowego obejmuje CA1 hipokampa12-14. Istnieją również dowody na to, że przyśrodkowa kora przedczołowa (mPFC) odgrywa dużą rolę w warunkowaniu śladowego mrugania oczami15, a stwierdzono, że mPFC jest zaangażowana w warunkowanie śladowego strachu. Jedno z badań wykazało, że neurony mPFC zapewniają ciągłą aktywność w okresie śladu, zapewniając w ten sposób struk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez grant Rady Badawczej Uniwersytetu Baylor oraz z grantu badawczego od Fundacji Epilepsji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FreezeFrameCoulbourn
30% IsopropanolKup 90% izopropanolu i rozcieńcz go do 30%
70% Ethanol
Amp-meterMed-AssociatesENV-420Kompatybilny z Windows XP, Vista i 7 (tylko 32-bitowy)
Cyfrowy miernik33-2055
Ekstrakt waniliowyMcCormick Czysty ekstrakt
Karteczki samoprzylepnePost-it3 cale x 3 cale
poziomu dźwięku waniliowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Powell, R. A., Honey, P. L., Symbaluk, D. G. Introduction to learning and behavior. , 4th ed, Wadsworth Cengage Learning. Forthcoming.
  2. Tsaltas, E., Preston, G. C., Gray, J. A. The effects of dorsal bundle lesions on serial and trace conditioning. Behav. Brain Res. 10, 361-374 (1983).
  3. McAlonan, G. M., Dawson, G. R., Wilkinson, L. O., Robbins, T. W., Everitt, B. J. The effects of AMPA-induced lesions of the medial septum and vertical limb nucleus of the diagonal band of Broca on spatial delayed non-matching to sample and spatial learning in the water maze. Eur. J. Neurosci. 7, 1034-1049 (1995).
  4. Chowdhury, N., Quinn, J. J., Fanselow, M. S. Dorsal hippocampus involvement in trace fear conditioning with long, but not short, trace intervals in mice. Behav. Neurosci. 119, 1396-1402 (2005).
  5. Quinn, J. J., Oommen, S. S., Morrison, G. E., Fanselow, M. S. Post-training excitotoxic lesions of the dorsal hippocampus attenuate forward trace, backward trace, and delay fear conditioning in a temporally specific manner. Hippocampus. 12, 495-504 (2002).
  6. Misane, I., et al. Time-dependent involvement of the dorsal hippocampus in trace fear conditioning in mice. Hippocampus. 15, 418-426 (2005).
  7. Quinn, J. J., Loya, F., Ma, Q. D., Fanselow, M. S. Dorsal hippocampus NMDA receptors differentially mediate trace and contextual fear conditioning. Hippocampus. 15, 665-674 (2005).
  8. McEchron, M. D., Bouwmeester, H., Tseng, W., Weiss, C., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts auditory trace fear conditioning and contextual fear conditioning in the rat. Hippocampus. 8, 638-646 (1998).
  9. Wiltgen, B. J., Sanders, M. J., Ferguson, C., Homanics, G. E., Fanselow, M. S. Trace fear conditioning is enhanced in mice lacking the delta subunit of the GABAA receptor. Learn. Mem. 12, 327-333 (2005).
  10. Davis, R. R., et al. Genetic basis for susceptibility to noise-induced hearing loss in mice. Hear. Res. 155, 82-90 (2001).
  11. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hear. Res. 130, 94-107 (1999).
  12. Moyer, J. R., Thompson, L. T., Disterhoft, J. F. Trace eyeblink conditioning increases CA1 excitability in a transient and learning-specific manner. 16, 5536-5546 (1996).
  13. Leuner, B., Falduto, J., Shors, T. J. Associative memory formation increases the observation of dendritic spines in the hippocampus. J. Neurosci. 23, 659-665 (2003).
  14. McEchron, M. D., Disterhoft, J. F. Hippocampal encoding of non-spatial trace conditioning. Hippocampus. 9, 385-396 (1999).
  15. McLaughlin, J., Skaggs, H., Churchwell, J., Powell, D. A. Medial prefrontal cortex and pavlovian conditioning: trace versus delay conditioning. Behav. Neurosci. 116, 37-47 (2002).
  16. Runyan, J. D., Moore, A. N., Dash, P. K. A role for prefrontal cortex in memory storage for trace fear conditioning. J. Neurosci. 24, 1288-1295 (2004).
  17. Gilmartin, M. R., McEchron, M. D. Single neurons in the medial prefrontal cortex of the rat exhibit tonic and phasic coding during trace fear conditioning. Behav. Neurosci. 119, 1496-1510 (2005).
  18. Crow, T., Xue-Bian, J. J., Siddiqi, V., Kang, Y., Neary, J. T. Phosphorylation of mitogen-activated protein kinase by one-trial and multi-trial classical conditioning. J. Neurosci. 18, 3480-3487 (1998).
  19. Martin, K. C., et al. MAP kinase translocates into the nucleus of the presynaptic cell and is required for long-term facilitation in Aplysia. Neuron. 18, 899-912 (1997).
  20. Crestani, F., et al. Trace fear conditioning involves hippocampal alpha5 GABA(A) receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8980-8985 (2002).
  21. Crestani, F., et al. Decreased GABAA-receptor clustering results in enhanced anxiety and a bias for threat cues. Nat. Neurosci. 2, 833-839 (1999).
  22. Moore, M. D., et al. Trace and contextual fear conditioning is enhanced in mice lacking the alpha4 subunit of the GABA(A) receptor. Neurobiol. Learn. Mem. 93, 383-387 (2010).
  23. Cushman, J. D., Moore, M. D., Jacobs, N. S., Olsen, R. W., Fanselow, M. S. Behavioral pharmacogenetic analysis on the role of the alpha4 GABA(A) receptor subunit in the ethanol-mediated impairment of hippocampus-dependent contextual learning. Alcohol Clin. Exp. Res. 35, 1948-1959 (2011).
  24. Raybuck, J. D., Lattal, K. M. Double dissociation of amygdala and hippocampal contributions to trace and delay fear conditioning. PLoS ONE. 6, (2011).
  25. Kwapis, J. L., Jarome, T. J., Schiff, J. C., Helmstetter, F. J. Memory consolidation in both trace and delay fear conditioning is disrupted by intra-amygdala infusion of the protein synthesis inhibitor anisomycin. Learn. Mem. 18, 728-732 (2011).
  26. Gilmartin, M. R., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Trace and contextual fear conditioning are impaired following unilateral microinjection of muscimol in the ventral hippocampus or amygdala, but not the medial prefrontal cortex. Neurobiol. Learn. Mem. 97, 452-464 (2012).
  27. Baysinger, A. N., Kent, B. A., Brown, T. H. Muscarinic receptors in amygdala control trace fear conditioning. PLoS ONE. 7, (2012).
  28. Wanisch, K., Tang, J., Mederer, A., Wotjak, C. T. Trace fear conditioning depends on NMDA receptor activation and protein synthesis within the dorsal hippocampus of mice. Behav. Brain. 157, 63-69 (2005).
  29. Smith, D. R., Gallagher, M., Stanton, M. E. Genetic background differences and nonassociative effects in mouse trace fear conditioning. Learn. Mem. 14, 597-605 (2007).
  30. Rudy, J. W., O'Reilly, R. C. Contextual fear conditioning, conjunctive representations, pattern completion, and the hippocampus. Behav. Neurosci. 113, 867-880 (1999).
  31. Wiltgen, B. J., Sanders, M. J., Anagnostaras, S. G., Sage, J. R., Fanselow, M. S. Context fear learning in the absence of the hippocampus. J. Neurosci. 26, 5484-5491 (2006).
  32. Reijmers, L. G., Perkins, B. L., Matsuo, N., Mayford, M. Localization of a stable neural correlate of associative memory. Science. 317, 1230-1233 (2007).
  33. Huerta, P. T., Sun, L. D., Wilson, M. A., Tonegawa, S. Formation of temporal memory requires NMDA receptors within CA1 pyramidal neurons. Neuron. 25, 473-480 (2000).
  34. Jacobs, N. S., Cushman, J. D., Fanselow, M. S. The accurate measurement of fear memory in Pavlovian conditioning: Resolving the baseline issue. J. Neurosci. Methods. 190, 235-239 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Trace Fear ConditioningFear MemoryHippocampal Dependent LearningFreezing BehaviorAuditory ToneFoot ShockContextual MemoryNovel ContextSound Attenuating ChamberFear Conditioning Chamber

Powiązane artykuły