Izolacja i przygotowanie ścian komórkowych bakterii do analizy składu metodą ultra sprawnej chromatografii cieczowej

Summary

Bakteryjna ściana komórkowa składa się z peptydoglikanu, makromolekularnej sieci nici cukrowych połączonych peptydami. Ultrasprawna chromatografia cieczowa zapewnia wysoką rozdzielczość i przepustowość dla nowatorskich odkryć składu peptydoglikanu. Przedstawiamy procedurę izolacji ścian komórkowych (woreczków) i ich późniejszego przygotowania do analizy za pomocą UPLC.

Abstract

Bakteryjna ściana komórkowa jest kluczowa dla określenia kształtu komórki podczas wzrostu i podziału, a także utrzymuje mechaniczną integralność komórek w obliczu ciśnienia turgoru o sile kilku atmosfer. W różnych kształtach i rozmiarach królestwa bakterii, ściana komórkowa składa się z peptydoglikanu, makromolekularnej sieci nici cukrowych połączonych krótkimi peptydami. Kluczowe znaczenie peptydoglikanu dla fizjologii bakterii leży u podstaw jego stosowania jako celu antybiotykowego i zmotywowało do badań genetycznych, strukturalnych i biologicznych komórek dotyczących tego, w jaki sposób jest on solidnie składany podczas wzrostu i podziału. Niemniej jednak nadal potrzebne są szeroko zakrojone badania, aby w pełni scharakteryzować kluczowe działania enzymatyczne w syntezie peptydoglikanu i skład chemiczny ścian komórkowych bakterii. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest potężną metodą analityczną służącą do ilościowego określania różnic w składzie chemicznym ścian bakterii hodowanych w różnych warunkach środowiskowych i genetycznych, ale jej przepustowość jest często ograniczona. W tym miejscu przedstawiamy prostą procedurę izolacji i przygotowania ścian komórkowych bakterii do analiz biologicznych peptydoglikanu za pomocą HPLC i ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC), rozszerzenia HPLC, które wykorzystuje pompy do dostarczania ultrawysokich ciśnień do 15 000 psi, w porównaniu z 6 000 psi w przypadku HPLC. W połączeniu z przedstawionym tutaj przygotowaniem bakteryjnych ścian komórkowych, iniektory do próbek o małej objętości, detektory o wysokiej częstotliwości próbkowania, mniejszych objętościach próbek i krótszych czasach pracy UPLC umożliwią wysoką rozdzielczość i przepustowość dla nowatorskich odkryć składu peptydoglikanu i podstawowej biologii komórek bakteryjnych w większości laboratoriów biologicznych z dostępem do ultrawirówki i UPLC.

Introduction

Celem opisanej tutaj metody jest wyizolowanie nienaruszonych ścian komórkowych bakterii (woreczków) i trawienie peptydoglikanu (PG) w taki sposób, że ultra sprawna chromatografia cieczowa (UPLC) może być użyta do dostarczenia informacji takich jak tożsamość składników muropeptydu i ich stężenia, średnia długość nici glikanu oraz frakcja materiału zaangażowanego w wiązania krzyżowe między niciami. Aby uzyskać szczegółowe omówienie biochemii PG i gatunków muropeptydów, istnieje kilka doskonałych recenzji, które opisują strukturę PG i jej rolę w infekcji, odporności, morfogenezie i wzroście^1-6. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) do analizy PG została początkowo opracowana przez Glaunera i Schwarza w latach 80., a ostatnio została udoskonalona i szeroko stosowana w laboratoriach Miguela de Pedro i Waldemara Vollmera. Poprzednie metody wykorzystywały analizę aminokwasów lub chromatografię bibułową, czasochłonne i żmudne techniki, które nie dają dokładnej lub pełnej oceny składników ściany komórkowej.

Analiza UPLC może być łatwo zaimplementowana w każdym laboratorium badawczym, które ma dostęp do ultrawirówki i UPLC. Metoda UPLC, którą prezentujemy poniżej, izoluje całe woreczki, dostarczając w ten sposób wyczerpujących, ilościowych informacji na temat wszystkich zawartych w nich związków chemicznych. Metoda ta pozwala na precyzyjne określenie ilościowe wszystkich muropeptydów w populacji bakterii, a wszystko to w ciągu 20 minut UPLC. Wdrożenie tej metody wymaga jedynie podstawowych umiejętności laboratoryjnych, bez znacznych nakładów finansowych w materiały. Aby wykonać kroki tej metody, naukowcy muszą jedynie posiadać umiejętności w pipetowaniu, przygotowywaniu i enzymów oraz dostosowywaniu pH, dzięki czemu jest ona dostępna dla szerokiego zakresu dyscyplin naukowych. Wybór enzymów stosowanych w tym protokole zależy od gatunku analizowanej bakterii; opisany tutaj protokół jest przydatny w przypadku Escherichia coli i ogólnie stwierdzono, że jest odpowiedni do izolowania woreczków od innych organizmów Gram-ujemnych. W przypadku stosowania tej metody do bakterii Gram-dodatnich zaleca się konsultację z literaturą; U tych gatunków oczyszczanie worka było tradycyjnie trudniejsze. W szczególności może być konieczna zmiana tej metody pod względem wyboru enzymów i długości czasu trawienia, aby dostosować się do grubszych ścianek i polimerów dodatkowych, takich jak kwasy tejchojowe bakterii Gram-dodatnich. Pierwszy enzym w tym protokole rozszczepia lipoproteiny błony zewnętrznej (takie jak lipoproteina Brauna lub Lpp) przyłączone do peptydoglikanu, uwalniając w ten sposób wszystko oprócz C-końcowego di- (lub tri-) peptydu Lpp ze ściany komórkowej. Ten krok jest konieczny podczas badania Enterobacteria, ale wiele innych bakterii Gram-ujemnych nie ma odpowiedników Lpp, dlatego ten krok można pominąć. Drugi enzym specyficznie rozszczepia się po kwasie muraminowym składniku peptydoglikanu, rozpuszczając podjednostkę disacharydową, która tworzy gatunek muropeptydu. Aby zapewnić dokładną ocenę architektury PG, należy zachować ostrożność podczas trawienia woreczków, aby zapobiec rozszczepieniu mostów poprzecznych lub jakiejkolwiek innej części łodygi peptydu.

Chociaż skład chemiczny peptydoglikanu z ponad 100 szczepów ~40 gatunków bakterii był analizowany przez HPLC, nie przeprowadzono żadnych analiz za pomocą technologii UPLC. Ponadto wcześniejsze prace scharakteryzowały peptydoglikan tylko na podstawie niewielkiej części domeny bakteryjnej, częściowo ograniczonej przepustowością HPLC. W związku z tym rozpowszechnienie tej metody wśród jak największej liczby badaczy i wdrożenie jej na platformach UPLC będzie miało kluczowe znaczenie dla prowadzenia badań fizjologicznych dużej części gatunków bakterii, których peptydoglikan nie został jeszcze sklasyfikowany.

Protocol

1. Hoduj kultury bakterii w 2,5 ml pożywki przez noc

Rozcieńcz wstecznie kultury 1:100 do 250 ml świeżej pożywki i osiągnij OD₆₀₀ 0,7-0,8. Przygotować roztwór 6% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie.

UWAGA: Proszek SDS jest niebezpieczny - unikaj wdychania proszku SDS; załóż maskę na nos i usta.

2. Dzień 1 - Liza kultur bakteryjnych jest przeprowadzana w ciągu jednego dnia i przez noc

1. Podczas gdy rozcieńczone kultury rosną, przygotuj wrzącą kąpiel wodną na gorącej płycie w zlewce o pojemności 1 l. Gdy woda się zagotuje, wlej 6 ml 6% SDS do 50 ml probówek polipropylenowych, dodaj jedną małą mieszadło do każdej probówki, dokręć pokrywki probówek palcami, umieść probówki w łaźni wodnej i włącz mieszanie do 500 obr./min na płycie grzejnej.
2. Zebrać 250 ml kultur w temperaturze 5 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić granulki w 3 ml pożywki lub 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Powoli pipetować zawiesiny komórek do probówek o pojemności 50 ml z 6% wrzącą SDS w celu lizy komórek (końcowe stężenie 4% SDS), podczas gdy probówki są zanurzone we wrzącej łaźni wodnej i ponownie zamknąć pokrywki tak, aby były szczelne palcami. Zawiesiny komórek muszą być szybko przeniesione do wrzącej SDS po ponownym zawieszeniu. Należy unikać nagłych zmian środowiskowych, ponieważ może to spowodować błędną zmianę struktury ściany komórkowej.
3. Przykryj wrzącą łaźnię wodną i pozwól komórkom wrzeć przez 3 godziny, okresowo sprawdzając poziom wody i uzupełniając łaźnię wodną w razie potrzeby. Po 3 godzinach wyłącz element grzejny płyty grzejnej i kontynuuj mieszanie przez noc z prędkością 500 obr./min.

3. Dzień 2 - Trawienie enzymatyczne odbywa się w ciągu jednego dnia

1. Jeśli SDS wytrącił się w probówkach o pojemności 50 ml przez noc, należy ustawić łaźnię wodną na wrzenie przez dodatkowe 1-2 godziny. Włączyć blok grzewczy do 60 °C. Przygotować zapas 1 mg/ml Pronazy E w 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) + 0,06% w/v NaCl i aktywować Pronazę E w temperaturze 60 °C przez co najmniej 30 minut.
2. Użyj ultrawirówki o masie 400 000 × g, aby wirować próbki przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia dużych polimerów PG, a tym samym oczyszczenia ich z innych składników komórkowych. Ostrożnie usuń supernatant, a następnie ponownie zawieś każdą granulkę w ultraczystej wodzie o temperaturze pokojowej. UWAGA: Objętość zawiesiny zależy od objętości użytych probówek ultrawirówek; Użyj objętości, która wypełnia probówki co najmniej do połowy, ale nie przekracza maksymalnej objętości rurek. Powtarzać wirowanie/mycie do momentu, gdy woda nie utworzy pęcherzyków podczas ponownego wymieszania, co oznacza, że karta charakterystyki została całkowicie usunięta (zwykle trzy płukania). Przestań myć osad, jeśli utworzy się biały osad, ponieważ oznacza to, że woreczki zbijają się ze sobą. Zbrylanie się nie jest katastrofalne, ale grudki bardzo silnie wiążą się z plastikiem i szkłem, powodując duże straty próbki. W takim przypadku postępuj zgodnie z protokołem, używając zbitej próbki worków.
3. Na ostatnim etapie wirowania/przemywania ponownie zawiesić próbki w 900 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) + 0,06% w/v NaCl i przenieść do probówek o pojemności 2 ml, uprzednio nakłutych małą igłą z otworami w wierzchołkach. Dodać 100 μl aktywowanej pronazy E o stężeniu 100 mg/ml (stężenie końcowe 100 μg/ml) do każdej próbki i inkubować w temperaturze 60 °C przez 2 godziny. Ustaw inny blok grzewczy na 100 °C.
4. Zatrzymać wytrawianie Pronazy E, dodając 200 μl 6% SDS do każdej próbki i gotować próbki w bloku grzewczym o temperaturze 100 °C przez 30 minut. Ustawić inny blok grzewczy na 37 °C i przygotować zapas 1 mg/ml muramidazy (mutanolizyny) w 50 mM buforze fosforanowym (pH 4,9).
5. Podobnie jak w kroku 3.2, użyj ultrawirówki o masie 400 000 × g, aby wirować próbki przez 20 minut w temperaturze pokojowej i myć ultraczystą wodą o temperaturze pokojowej, aż SDS zostanie całkowicie usunięty (zwykle trzy płukania). Objętość ponownego zaparcia zależy od objętości użytych probówek do ultrawirówek; Użyj objętości, która wypełnia probówki co najmniej do połowy, ale nie przekracza maksymalnej objętości rurek.
6. Na ostatnim etapie wirowania/przemywania ponownie zawiesić próbki w 200 μl 50 mM buforu fosforanu sodu (pH 4,9). Objętość tę można dostosować w zależności od ilości peptydoglikanu w próbce i może ona być zależna od gatunku. Jeżeli istnieją wcześniej opublikowane sprawozdania z analizy HPLC dla gatunków będących przedmiotem zainteresowania, objętość ta może być oszacowana na podstawie tych danych ilościowych (kompilację badań HPLC PG można znaleźć w informacjach uzupełniających w pozycji^{referencyjnej 7}). W przypadku innych gatunków można przeprowadzić przygotowanie worka do tego etapu, a następnie dodać różne ilości objętości zawiesiny w celu powtórzenia próbek w celu określenia minimalnej objętości, która pozwala PG pozostać w roztworze (patrz Dyskusja w celu uzyskania dalszych szacunków). Jeśli próbka zawiera więcej peptydoglikanu, należy zwiększyć objętość zawiesiny; Jeśli próbka zawiera mało peptydoglikanu, należy zmniejszyć objętość zawiesiny do minimum 50 μl.
7. Przenieść próbki do probówek o pojemności 1,5 ml i dodać 1 mg/ml muramidazy, aby uzyskać końcowe stężenie 40 μg/ml. Inkubować 6-8 godzin lub przez noc w temperaturze 37 °C.

4. Dzień 3 - Przygotowanie próbek do UPLC odbywa się ostatniego dnia

1. Włączyć blok grzewczy do temperatury 100 °C. Gotować próbki bez SDS przez 5 minut, aby zatrzymać trawienie muramidazy. Odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze 16 000 × g w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść supernatant (muropeptydy są teraz rozpuszczalne) do szklanych probówek o wymiarach 13 mm x 100 mm. Postaraj się odzyskać jak najwięcej supernatantu, zbliżając się bardzo blisko osadu, nie naruszając go.
2. Dostosuj pH, dodając do próbki 500 mM buforu boranowego (pH 9), aby uzyskać końcowe stężenie 100 mM buforu boranowego. Bufor boranowy jest kompatybilny ze środkiem redukującym borowodorkiem sodu. Dodać 1-2 ziarna borowodorku sodu, aby zredukować każdą próbkę i pozostawić reakcję na co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. UWAGA: Borowodorek sodu jest wysoce reaktywny i niebezpieczny w obsłudze - unikać kontaktu ze skórą (nosić rękawice) i unikać kontaktu z oczami (nosić okulary ochronne).
3. Dostosuj próbki do pH 3-4 (punkt izoelektryczny muropeptydu wynosi ~3,5) za pomocą kwasu ortofosforowego o stężeniu 50% v/v, stosując przyrosty co 20 μl do pH 6, mierzone za pomocą papierka wskaźnikowego pH, a następnie z przyrostem 2 μl. UWAGA: Kwas ortofosforowy jest i niebezpieczny w obsłudze - unikać kontaktu ze skórą (nosić rękawice) i unikać kontaktu z oczami (nosić okulary ochronne). Próbka powinna bąbelkować w odpowiedzi na dodanie kwasu ortofosforowego; Kiedy próbka przestaje bulgotać, zwykle oznacza to, że osiągnięto pH 6. Jeżeli w próbce nie występuje bąbelkowanie, może to oznaczać, że ilość dodanego borowodorku sodu była zbyt mała. W takim przypadku należy przerwać obniżanie pH, ostrożnie dodać jedno lub dwa ziarna borowodorku sodu, odczekać 5-10 minut, a następnie wznowić regulację pH.
4. Przefiltrować próbkę przez filtr strzykawkowy 0,22 μm bezpośrednio do fiolki UPLC. Jeśli utworzył się osad, podgrzej rurkę z kilkoma przejściami przez płomień przed filtrowaniem. Jeśli próbka nie zostanie wstrzyknięta do instrumentu UPLC w ciągu dnia, należy zamrozić w temperaturze -20 °C przez noc. Próbki mogą być przechowywane przez okres do roku w temperaturze -80 °C. Próbkę można rozmrozić, kilkakrotnie przechodząc przez płomień.
5. Wstrzyknąć 10 μl każdej próbki do przyrządu UPLC wyposażonego w kolumnę C18 1,7 μm z odwróconymi fazami i detektor absorbancji ustawiony do monitorowania 202-208 nm. Próbki są wstrzykiwane sekwencyjnie, ale funkcje automatycznego podajnika próbek pozwalają na przetwarzanie do 96 próbek w partii. Użyć 50 mM fosforanu sodu (pH 4,35) + 0,4% v/v azydku sodu dla rozpuszczalnika A i 75 mM fosforanu sodu (pH 4,95) + 15% v/v metanolu dla rozpuszczalnika B. UWAGA: Azydek sodu dodaje się w celu skompensowania absorpcji metanolu o długości 205 nm, aby uniknąć dryftu linii podstawowej. Ustaw przepływ na 0,25 ml/min i użyj gradientu liniowego przez 25 minut, aby uzyskać 100% rozpuszczalnika B i sekwencyjną elucję muropeptydów w ciągu 30 minut. Jeżeli do scharakteryzowania muropeptydów po UPLC ma być stosowana spektrometria mas, należy zebrać frakcje interesującego piku w kolektorze frakcji i wysuszyć frakcje za pomocą parownika odśrodkowego.

Results

Korzystając z procedury opisanej na rysunku 1, końcowa próbka powinna składać się z co najmniej 200 μl klarownego roztworu, który został przefiltrowany bezpośrednio do fiolki UPLC (krok 4.4). Oddzielenie UPLC różnych muropeptydów w próbce bakteryjnej opiera się na ich względnej rozpuszczalności między cieczą fazą ruchomą a fazą stacjonarną kolumny. Kolumny C18 z odwróconymi fazami zapewniają silnie hydrofobową matrycę do oddzielania gatunków muropeptydów na podstawie hydrofobowości i wielkości⁸

Discussion

Krytycznym etapem tej procedury jest krok 3.1 drugiego dnia przygotowania próbki. Jeśli karta charakterystyki wytrąciła się w ciągu nocy lub jeśli próbki były przechowywane w 4% karcie charakterystyki przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej, próbki muszą być ponownie gotowane przez co najmniej 1 godzinę w celu ponownego rozpuszczenia karty charakterystyki. Częstą przyczyną wytrącania się SDS jest stosowanie pożywek z solami potasu, dlatego w miarę możliwości należy unikać potasu w pożywkach. Jak wspomniano w sekcji ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase E	Amresco	E629
Mutanolizyna ze Streptomyces	Sigma-Aldrich	M9901
Borowodorek sodu (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452882	Borowodorek sodu jest wysoce reaktywny i niebezpieczny w obsłudze
Kwas ortofosforowy	Sigma-Aldrich	79607	Kwas ortofosforowy jest i niebezpieczny w obsłudze
Kwas borowy	Sigma-Aldrich	31146
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	S2002	Azydek sodu jest trucizną
Tetraboran sodu	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0,22 μ m filtry strzykawkowe	Paski pH Fisher	SLGVR04NL
(zakres pH 0-6)	Fisher	M95863
50 ml polipropylenowe probówki Falcon	VWR	21008-951
Rurki szklane 13 mm x 100 mm	Kimble Chase	60CM13
12 mm x 32 mm szklana fiolka do odzyskiwania z szyjką śrubową	Wody	186000327C
Dodecylosiarczan sodu	Ambion	Proszek SDS AM9820	jest niebezpieczny
Waters Acquity UPLC H-Class, w tym:
Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN
Acquity UPLC H-Class Quadternary Solvent Manager
Acquity UPLC BEH C18 1.7 i mikro; m kolumna
Acquity UPLC PDA Detektor
Woda Frakcja Zbieracz
Acquity UPLC 30 cm Kolumna Grzejnik/Chłodnica